H3K9Ac在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床意义

目的 研究组蛋白H3赖氨酸残基9位乙酰化（H3KgAc）在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其与卵巢癌组织学分级、临床分期之间的关系。方法 采用免疫组织化学ABC法检测20例良性、16例交界性、40例恶性卵巢上皮性肿瘤中H3K9Ac的表达情况，并分析其与临床病理指标间的关系。结果 ①H3K9Ac在良性、交界性、恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达逐渐降低，差异有显著统计学意义（P〈0．01）；②与粘液性囊腺癌相比，H3KgAc在浆液性囊腺癌中表达较低，差异有统计学意义（P〈0．05）；③H3KgAc的表达与卵巢上皮性癌的组织分化程度及临床分期有关，在Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌中H3KgAc的表达明显低于Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌（P〈0．01）；随着组织分化程度降低，H3KgAc表达也逐渐降低，两两比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 H3KgAc在良性、交界性、恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达差异显著，且随着卵巢上皮性癌恶性程度的增高，表达逐渐降低，H3K9Ac可能为卵巢上皮性肿瘤的良恶性及其预后判断提供一个新的生物学指标。     

组蛋白H3K9、H4K8的乙酰化及正相关表达SATB1促进结直肠癌的临床进展

目的观察结直肠癌组织组蛋白乙酰化水平及其与临床病理特征的相关性,并进一步探讨组蛋白乙酰化状态与SATB1表达的相关性。方法收集苏州市立医院本部存档的200例结直肠癌组织及相关临床病理资料。采用免疫组化法检测组蛋白乙酰化关键位点H3K9、H3K18、H4K8、H4K12的乙酰化水平。结果结直肠癌组织中H3K9阳性率为69. 0%,其表达与肿瘤浸润深度及远处转移显著相关(P 0. 05),与其他临床病理特征无明显相关性(P 0. 05)。H4K8阳性率为46. 0%,其表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期显著相关(P 0. 05),与其他临床病理特征无明显相关性(P 0. 05)。H3K18及H4K12在结直肠癌组织中均强阳性,阳性率为100. 0%。H3K9表达与SATB1高表达呈显著正相关(rs=0. 508,P 0. 05)。H4K8表达与SATB1高表达呈显著正相关(rs=0. 612,P 0. 01)。结论组蛋白乙酰化是结直肠癌发生、发展的重要因素,且其乙酰化水平与SATB1蛋白表达密切相关。     

曲古抑菌素A对核移植供体细胞组蛋白H3乙酰化水平的影响

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对组蛋白H3乙酰化水平的影响,进而提高他们重编程的能力。方法用不同浓度的TSA处理胎儿成纤维细胞,应用免疫荧光和WesternBlot方法对细胞乙酰化水平进行量化分析。结果0.5nM,5nM,50nM和100nM浓度的TSA均引起供体成纤维细胞形态学的变化,对供体成纤维细胞组蛋白H3乙酰化有明显的剂量效应,随着TSA浓度增加,组蛋白H3乙酰化水平逐渐增加,在TSA浓度5nM时比0.5nM增加尤为明显。结论TSA能够提高胎儿成纤维细胞组蛋白H3乙酰化水平,提高核移植重编程的能力。     

P38MAPK的激活上调SH-SY5Y细胞APP表达及组蛋白H3乙酰化水平

目的研究P38MAPK信号通路的激活对淀粉前体蛋白(APP)表达的影响及其相关表观遗传学机制。方法体外培养神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),Western blot法检测SH-SY5Y的APP蛋白表达及组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表达;吸光度值法检测组蛋白3(H3)和组蛋白4(H4)整体乙酰化水平。结果 P38MAPK信号通路经特异性激动剂激活SH-SY5Y 72 h后,APP表达明显增高至对照组的1.5倍(0.41±0.09vs0.28±0.08,P<0.01);同时组蛋白H3整体乙酰化水平增高(0.20±0.04vs0.06±0.03,P<0.01),但H4乙酰化水平无明显改变;组蛋白乙酰化酶CBP表达增高至对照组的2.5倍(0.30±0.03vs0.11±0.05,P<0.01),而组蛋白去乙酰化酶HDAC3表达下降至对照组的40%(0.19±0.05vs0.49±0.03,P<0.01)。结论 P38MAPK信号通路可能通过上调组蛋白乙酰化水平增加SH-SY5Y的APP蛋白表达。     

TSA通过组蛋白乙酰化影响TLR2基因表达

目的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Trichostatin A,TSA)处理人THP-1细胞,干预组蛋白H3乙酰化水平,探讨组蛋白H3乙酰化对人THP-1细胞中TLR2基因表达水平的影响。方法构建THP-1巨噬细胞模型,分别利用不同浓度TSA处理细胞,Real-time PCR和Western blot方法检测m RNA和蛋白的表达;染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)比较TSA处理前后启动子区H3乙酰化水平。结果TSA以浓度依赖方式上调表达水平。TSA上调组蛋白H3乙酰化水平,使启动子区H3乙酰化水平明显上升。结论 TSA通过组蛋白H3乙酰化影响基因表达,这是乙酰化调控TLR2基因表达的一种可能机制。     

mTOR信号通路与组蛋白乙酰化在胃癌细胞中的相互作用

目的研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路与组蛋白乙酰化在人胃癌细胞生存活力、细胞周期、相关基因及蛋白表达方面的相互作用。方法分别单独或联合脱乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(trichostatin A,TSA)、mTOR抑制剂雷帕霉素和PI3K抑制剂LY294002干预人胃癌MKN45和SGC7901细胞,以噻唑蓝法检测细胞生存活力,流式细胞术检测细胞周期,实时定量PCR检测p21WAF1基因表达情况,蛋白免疫印迹检测Akt、p70S6K及4E-BP1蛋白表达情况。结果联合用药比单独用药对胃癌细胞生长抑制作用更明显(P<0.01);不管单独或联合用药,均可使MKN45细胞阻滞在G2期(P<0.05),使SGC7901细胞阻滞在G1或G2期(P<0.05);联合用药比单独用药更能提高抑癌基因p21WAF1的表达;联合用药使Akt、p70S6K及4E-BP1磷酸化表达较单独用药显著下降(P<0.01),联合用药后组蛋白H4/H3乙酰化也较单独用药表达升高(P<0.01)。结论mTOR信号通路与组蛋白乙酰化在胃癌的发生发展中存在相互关系,mTOR抑制剂与脱乙酰化酶抑制剂联合应用具有协同作用,可望成为肿瘤基因防治的新靶点。     

X线放射诱导大鼠心肌细胞系H9c2损伤中组蛋白乙酰化水平降低

目的研究辐射暴露对心肌细胞的影响及组蛋白乙酰化的修饰变化,分析其相关性并探讨其机制。方法将大鼠心肌细胞系H9c2分为对照组和放射组,放射组分别用X线给予2、4、6和8 Gy剂量照射。48 h后,通过比色法检测细胞培养上清乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞内丙二醛(MDA)含量及过氧化物歧化酶(SOD)活性;用annexin V-FITC/PI染色及流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase3及组蛋白乙酰化相关蛋白H3K9ac、HDAC3表达。结果与对照组相比,不同剂量照射组细胞上清LDH相对活性增加(P0.05),细胞内MDA相对含量增加(P0.05),细胞内SOD相对活性降低(P0.05);此外放射组细胞凋亡率明显增高(P0.05),并且Bcl-2蛋白表达水平降低(P0.05),caspase-3蛋白表达水平增高(P0.05);同时与对照组相比,放射组组蛋白H3乙酰化水平降低(P0.05),HDAC3表达水平增高(P0.05)。结论辐射暴露导致H9c2细胞损伤并诱导其凋亡,此过程中细胞内组蛋白乙酰化水平降低,而HDAC3可能是调节组蛋白乙酰化水平的主要因子。     

氧化应激上调人神经母细胞瘤细胞内β-裂解酶的表达

目的研究氧化应激对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)β-裂解酶(BACE1)表达的影响及组蛋白乙酰化、DNA甲基化的改变。方法采用H2O2处理体外培养的SH-SY5Y,Western blot法检测细胞的BACE1表达及DNA甲基转移酶(DNMTs)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表达;实时定量PCR检测BACE1 mRNA的表达;吸光度值法检测组蛋白3(H3)和组蛋白4(H4)整体乙酰化水平。结果 SH-SY5Y细胞经H2O2处理1和72 h后BACE1 mRNA和蛋白表达均明显增多;H2O2处理72 h后DNMT1、DNMT3A表达均下降,分别是对照组的75%和65%(P<0.01);而组蛋白去乙酰化酶HDAC3的表达增高至对照组的1.6倍(P<0.01);同时,组蛋白H3整体乙酰化水平下降,但H4乙酰化水平无明显改变。结论氧化应激可能通过改变SH-SY5Y细胞内DNA甲基化水平及组蛋白乙酰化状态调节BACE1的表达,在阿尔茨海默病发病过程中发挥作用。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂促大鼠胚胎干细胞向神经元分化

目的探讨组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂丁酸钠（NaB）对大鼠胚胎干细胞（ESC）向神经元分化的影响。方法利用含bFGF、EGF的DMEM／F12培养基培养原代ESC;应用DAPI染色,荧光显微镜观察不同药物浓度NaB（0．2、1、2μmol／L）作用48h后对细胞凋亡的影响;免疫荧光检测NaB（1μmol／L）作用72h后和对照组（PBS）ESC双肾上皮质激素（DCX）和DAPI,计算DCX／DAPI的比值;免疫印迹检测不同浓度NaB（0．2、1、2μmol／L）作用48h后和对照组（PBS）ESC组蛋白H3、H4乙酰化水平。结果在1、2／μmol／LNaB组ESC出现明显凋亡,细胞形状不规则,核固缩,核内可见致密的颗粒荧光,视野下细胞碎片较多,且凋亡细胞百分比明显高于0．2μmol／LNaB组和对照组[（7．85±0．73）％、（18．42±2．04）％比（3．48±0．35）％、（2．16±0．32）％,均P〈0．05]。1μmol／LNaB组ESCDCX／DAPI比值高于对照组（38．51±4．33比14．81±1．77,P〈0．05）。随NaB药物浓度的增加,ESC蛋白H3、H4乙酰化程度较对照组增强,0．2±mol／L组处理后乙酰化组蛋白H3和H4表达变化不明显,1、2μmol／L时组蛋白H3和H4乙酰化程度明显增高（均P〈0．05）。结论HDAC抑制剂NaB可明显促使ESC向神经元分化。     

苯中毒病人TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白化学修饰改变

目的:研究拓扑异构酶Ⅱα(TOPOⅡα)启动子调控因子SP1组蛋白化学修饰在苯中毒病人中的改变。方法:25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组,25例正常人骨髓单个核细胞为对照组,染色质免疫沉淀技术探讨TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白乙酰化和甲基化水平的变化,RT-PCR法测定Sp1 mRNA的表达水平。结果:与对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4和H3乙酰化水平下降(P0.01),组蛋白H3K9甲基化水平升高(P0.01),组蛋白H3K4甲基化水平无明显改变。与正常对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1的mRNA表达水平降低(P0.05)。结论:慢性苯中毒TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰水平的改变伴随着mRNA水平的变化。TOPOⅡα启动子调控因子Sp1可能通过组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰改变在苯中毒所致的造血毒性中发挥作用。     

Global histone modification pattern associated with recurrence and disease-free survival in non-small cell lung cancer patients

Global histone modification patterns are presumed to establish epigenetic patterns of gene expression and determine the biology of the cell. In the present study, the global modification status of histone H3 and H4 was evaluated in 408 non-small cell lung cancer (NSCLC) tissues by immunostaining. NSCLC showed variable staining scores for each antibody. Clinicopathological analyses demonstrated a positive correlation between weak nuclear staining for H3K9Ac (P < 0.001), H3K9TriMe (P= 0.001), H4K16Ac (P < 0.001) and tumor recurrence except H4K20 TriMe (P= 0.201). Staining scores of four different antibodies were not correlated with other clinicopathologic variables. Patients were further clustered according to histone modification patterns: acetylation dominant, methylation dominant, co-dominant and modification-negative. The acetylation-dominant group (P= 0.009) and co-dominant group exhibited less frequent lymph node metastasis (P= 0.050), recurrence (P= 0.002) and distant metastasis (P= 0.010). The acetylation-dominant group showed better prognosis in survival analysis (P < 0.001, log-rank), whereas methylation-dominant and modification-negative status was associated with poor prognosis. In conclusion, our data suggest that global histone H3 and H4 modification patterns are potential markers of tumor recurrence and disease-free survival in NSCLC patients.     

前列腺癌细胞组蛋白H3甲基化的差异

 目的：整体分析雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞组蛋白H3甲基化差异,探讨前列腺癌从激素依赖性发展为非激素依赖性的表观遗传机制。方法：应用重甲基细胞培养条件下氨基酸稳定同位素标记(SILAC)技术结合生物质谱分析雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP和非依赖性前列腺癌细胞DU145组蛋白H3的甲基化修饰谱,寻找差异的修饰位点和模式;通过Western blotting验证所发现的差异修饰;采用real-time PCR检测2株细胞相关甲基化酶和去甲基化酶的表达差异。结果：质谱鉴定发现2株前列腺癌细胞的组蛋白H3存在5个甲基化位点,甲基化模式分别为H3K14me2、H3R17me1、H3K36me1、H3K36me2、H3K36me3、H3R72me2、H3K79me1和H3K79me2。其中,包含甲基化位点H3K36的肽段有2种,分别为“KSAPATGGVKKPHR”和“KSAPSTGGVKKPHR”,前者鉴定到的频数高于后者,两者的区别在于第31位的氨基酸分别为A与S,前者归属于组蛋白H3变异体H31T、H31和H32,主要出现在DU145细胞中,后者归属于组蛋白H3变异体H33,在LNCaP细胞中出现次数稍多;提示2株细胞可能表达不同的组蛋白H3变异体,从而导致甲基化模式的差异。Western blotting检测发现H3K36的一甲基化和二甲基化在2株细胞间没有差异,而其在DU145细胞中的三甲基化程度显著高于LNCaP细胞。Real-time PCR检测显示DU145细胞的H3K36去甲基化酶mRNA表达比LNCaP细胞有所降低。结论：组蛋白H3变异体和H3K36去甲基化酶的差异表达可能导致非激素依赖性前列腺癌细胞H3K36三甲基化增加,成为前列腺癌从激素依赖性发展为非激素依赖性的一种表观遗传转变。     

Global mapping of H3K4me3 and H3K27me3 reveals chromatin state-based regulation of human monocyte-derived dendritic cells in different environments

Depending on the environment, dendritic cells (DCs) may become active or tolerogenic, but little is known about whether heritable epigenetic modifications are involved in these processes. Here, we have found that epigenetic histone modifications can regulate the differentiation of human monocyte-derived DCs (moDCs) into either activated or tolerized DCs. The inhibition or silencing of methyltransferases or methylation-associated factors affects the expression of multiple genes. Genome mapping of transforming growth factor (TGF-β)- or lipopolysaccharide (LPS)-associated H3K4 trimethylation (H3K4me3) and H3K27 trimethylation (H3K27me3) demonstrated the presence of histone modification of gene expression in human TGF-β- or LPS-conditioned moDCs. Although the upregulated or downregulated genes were not always associated with H3K4me3 and/or H3K27me3 modifications in TGF-β-conditioned (tolerized) or LPS-conditioned (activated) moDCs, some of these genes may be regulated by the increased and/or decreased H3K4me3 or H3K27me3 levels or by the alteration of these epigenetic marks, especially in TGF-β-conditioned moDCs. Thus, our results suggested that the differentiation and function of moDCs in tumor and inflammation environments are associated with the modification of the H3K4me3 and K3K27me3 epigenetic marks.     

Improved Therapeutic Effect against Leukemia by a Combination of the Histone Methyltransferase Inhibitor Chaetocin and the Histone Deacetylase Inhibitor Trichostatin A

SUV39H1 is a histone 3 lysine 9 (H3K9)-specific methyltransferase that is important for heterochromatin formation and the regulation of gene expression. Chaetocin specifically inhibits SUV39H1, resulted in H3K9 methylation reduction as well as reactivation of silenced genes in cancer cells. Histone deacetylase (HDAC) inhibitors inhibit deacetylases and accumulate high levels of acetylation lead to cell cycle arrest and apoptosis. In this study, we demonstrated that treatment with chaetocin enhanced apoptosis in human leukemia HL60, KG1, Kasumi, K562, and THP1 cells. In addition, chaetocin induced the expression of cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (p15), E-cadherin (CDH1) and frizzled family receptor 9 (FZD9) through depletion of SUV39H1 and reduced H3K9 methylation in their promoters. Co-treatment with chaetocin and HDAC inhibitor trichostatin A (TSA) dramatically increased apoptosis and produced greater activation of genes. Furthermore, this combined treatment significantly increased loss of SUV39H1 and reduced histone H3K9 trimethylation responses accompanied by increased acetylation. Importantly, co-treatment with chaetocin and TSA produced potent antileukemic effects in leukemia cells derived from patients. These in vitro findings suggest that combination therapy with SUV39H1 and HDAC inhibitors may be of potential value in the treatment of leukemia.     

siRNA靶向干扰组蛋白H3表达对人鼻咽癌细胞增殖的抑制作用

 目的：应用RNA干扰技术抑制人鼻咽癌细胞株CNE1中组蛋白H3的表达,观察其对鼻咽癌细胞增殖的影响。方法：构建针对组蛋白H3的小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,转染CNE1细胞并筛选获得稳定表达细胞株。实时荧光定量RT-PCR和Western blotting检测细胞中组蛋白H3 mRNA和蛋白表达的改变;CCK-8法和平板克隆形成实验观察细胞增殖能力的改变;双萤光素酶报告系统检测细胞激活蛋白1（AP-1）转录活性的改变。结果：与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA-H3质粒转染组的组蛋白H3 mRNA和蛋白表达均显著下降,细胞生长速度明显减慢,表皮生长因子诱导的细胞克隆形成能力和AP-1转录活性均受到明显抑制。结论：通过RNA干扰技术阻断组蛋白H3的表达,可抑制CNE1细胞的生长、增殖,其机制可能与下调AP-1转录活性有关。组蛋白H3 可能是潜在的肿瘤治疗新靶点。     

Histone deacetylase 3 is required for centromeric H3K4 deacetylation and sister chromatid cohesion

We describe here the role of histone deacetylase 3 (HDAC3) in sister chromatid cohesion and the deacetylation of histone H3 Lys 4 (H3K4) at the centromere. HDAC3 knockdown induced spindle assembly checkpoint activation and sister chromatid dissociation. The depletion of Polo-like kinase 1 (Plk1) or Aurora B restored cohesion in HDAC3-depleted cells. HDAC3 was also required for Shugoshin localization at centromeres. Finally, we show that HDAC3 depletion results in the acetylation of centromeric H3K4, correlated with a loss of dimethylation at the same position. These findings provide a functional link between sister chromatid cohesion and the mitotic "histone code".     

孕期饮酒介导的组蛋白低甲基化对子代心脏发育基因过表达的影响

目的:探讨组蛋白甲基化修饰失衡在孕期酒精暴露致子代心脏发育相关基因表达异常中的作用及其机制。方法:选取健康昆明小鼠,于孕期0.5 d开始给予56%乙醇(5 mL/kg)灌胃,同时给予G9a-组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase, HMT)抑制剂BRD4770(1 mg/kg)灌胃,于胚胎14.5 d、胚胎16.5 d和新生0.5 d收集子代小鼠心脏。RT-qPCR检测心脏发育相关基因Gata4、Cx43和β-MHC的mRNA表达水平,比色法检测HMT活性,Western blot检测小鼠心肌组织组蛋白H3K9me3、G9a-HMT、Cx43及β-MHC的表达水平。结果:比色法结果表明,孕期酒精暴露的子代小鼠心肌组织中HMT活性与生理盐水对照组相比显著降低(P0.05);Western blot结果表明酒精组小鼠心肌组织中G9a-HMT及组蛋白H3K9me3表达水平与生理盐水对照组相比显著降低(P0.05);RT-qPCR结果显示Gata4、Cx43和β-MHC的mRNA表达水平在酒精组显著升高(P0.05),且Western blot结果也表明酒精组Cx43和β-MHC蛋白水平显著高于生理盐水对照组(P0.05)。同时,G9a-HMT特异性抑制剂BRD4770能够进一步降低小鼠心肌组织中组蛋白H3K9me3甲基化水平(P0.05),且Gata4 mRNA表达水平及Cx43和β-MHC的转录和翻译水平在抑制剂干预组较酒精组显著升高(P0.05)。结论:G9a-HMT介导的组蛋白甲基化修饰失衡可能参与了孕期酒精暴露所致的子代心脏发育相关基因表达异常。