利用体内噬菌体展示技术筛选及鉴定肺癌特异性结合肽

目的利用体内噬菌体展示技术筛选并鉴定与肺癌特异性结合的多肽。方法用肺癌细胞A549接种裸鼠复制荷瘤动物模型,将随机肽库尾静脉注入裸鼠体内,循环15 min后取肿瘤组织中结合的噬菌体,如此进行3轮体内筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA初步鉴定噬菌体克隆对肺癌细胞的亲和力、特异性。将阳性噬菌体克隆扩增、测序获得外源多肽氨基酸序列,化学方法合成多肽,鉴定多肽对肺癌细胞和组织的亲和力、特异性。结果ELISA结果显示,随机挑选的20个噬菌体单克隆中,1个对A549具有很强亲和力。测序获得多肽,命名为zp2。化学合成多肽zp2。竞争抑制、细胞免疫荧光和组织免疫荧光实验结果表明多肽zp2与肺癌细胞A549及肺癌组织特异性结合。结论利用体内噬菌体展示技术筛选出与肺癌细胞A549特异性结合的多肽,为肺癌诊断及治疗药物的研制奠定基础。     

利用体内噬菌体展示技术筛选膀胱癌特异性结合肽

目的:利用体内噬菌体展示技术筛选与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽。方法:将人膀胱移行细胞癌细胞BIU87接种于裸鼠体内,制备膀胱癌荷瘤小鼠模型,尾静脉注射噬菌体展示环七肽库,然后筛选与膀胱移行细胞癌特异性结合的含外源多肽的噬菌体,经过3轮体内筛选后,免疫组织化学法及ELISA法鉴定单克隆噬菌体对BIU87的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体单链DNA进行测序,并推导出外源多肽氨基酸序列,化学合成多肽、制备分子探针后采用激光扫描共聚焦显微镜术及流式细胞术鉴定多肽对膀胱癌细胞和组织的特异性。结果:3轮体内筛选后,噬菌体富集率达到4.334×102倍。免疫组化结果显示,肿瘤组织中噬菌体肽的含量随着每一轮筛选呈增长趋势,且结合逐渐增强,同时由于噬菌体经肝、肾代谢,可见肝脏结合大量非特异性的噬菌体。ELISA结果显示,随机挑选的30个单克隆噬菌体斑中,有24个阳性噬菌体,其中10个噬菌体对BIU87有较强的亲和力,对其测序并推导出3种多肽序列,重复率最高的序列CSSPIGRHC(8/10)命名为NYZL1。化学合成FITC-C6-NYZL1,通过激光扫描共聚焦显微镜术、流式细胞术均证明多肽NYZL1可以特异性结合膀胱癌细胞。结论:利用体内噬菌体展示技术筛选出了与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽NYZL1,为膀胱癌早期诊断和靶向治疗提供一定的理论依据。     

肝癌细胞特异性内在化肽的筛选和初步鉴定

应用噬菌体肽库技术筛选与肝癌细胞特异性结合并可以内在化的短肽,为肝癌的导向治疗奠定基础。以肝癌细胞株BEL-7404作为筛选靶细胞,对噬菌体展示随机12-肽库进行亲和淘选。经过3轮淘选后,共随机挑选出20个噬菌斑进行扩增和测序,同时用细胞ELISA检测其与肝癌细胞的结合情况,并通过免疫荧光术、流式细胞术等方法进一步鉴定噬菌体克隆对肝癌细胞的导向性及内在化的效果。结果表明3轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果。从扩增的噬菌体克隆中选择结合力最强的LJ08通过免疫荧光术、流式细胞术鉴定,结果显示LJ08与肝癌细胞呈特异性结合并内在化进入肝癌细胞。结论认为,通过对噬菌体随机肽库的筛选,得到可以与肝癌细胞BEL-7404结合并可以内在化的噬菌体肽,为该肽作为肝癌导向治疗的药物载体奠定基础。     

利用噬菌体随机肽库筛选表达Aβ靶向肽的噬菌体

目的抗Aβ神经毒性的Aβ靶向肽噬菌体的筛选。方法分别合成Aβ1-10序列组成的短肽并将其生物素化;以生物素化Aβ1-10为靶分子,用噬菌体展示技术及液相亲和捕获法筛选出特异性高亲和力的噬菌体;采用生物传感分析技术,通过结合特异性实验和短肽竞争性抑制实验,检测所筛选的噬菌体与靶分子之间的亲和动力学关系。结果经过对靶分子Aβ1-10的3轮筛选,筛出了与Aβ1-10特异性结合的单克隆噬菌体;生物传感分析技术结果进一步表明,靶分子（Aβ1-10）与所筛选噬菌体之间的结合具有高度特异性。结论筛选出了展示特异性高亲和力结合Aβ1-10短肽的噬菌体。     

P-糖蛋白结合肽的筛选及合成肽鉴定

目的 筛选人膀胱癌P-糖蛋白特异性结合肽并合成鉴定.方法 利用表达获得的P-糖蛋白胞外段融合蛋白为靶蛋白,采用酶联板法筛选噬菌体随机12肽库,化学合成该特异性肽序列,免疫细胞化学方法进行鉴定.结果 从噬菌体随机肽库中筛选获得了与P-糖蛋白特异性结合的噬菌体阳性克隆,测序获得特异性结合肽序列.免疫细胞化学结果显示特异性合成肽可与耐药细胞BIU-87/ADM结合,而与敏感细胞BIU-87不结合.结论 筛选获得的结合肽具有一定的亲和力,可与特定的肿瘤细胞结合,表现出一定的肿瘤特异性;P-糖蛋白结合肽的筛选,为人膀胱癌多药耐药的靶向治疗结论提供实验依据.     

一种新型肝癌免疫毒素的表达、纯化及初步鉴定

从噬菌体随机肽库中筛选获得了与肝癌细胞特异性结合的12-肽A54,将其与蜂毒肽(melittin,Mel)编码基因连接后,插入质粒载体pET-32a(+)中,构建成A54-Mel与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)及六聚组氨酸(6×His)的融合表达载体pET32-A54-Mel。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达后,获得可溶性表达产物,经Western blot鉴定,表达产物能与蜂毒肽特异性抗体反应。表达菌经超声裂解后,上清液用Ni+离子亲和层析法纯化得到了融合蛋白(Trx-A54-Mel),经肠激酶裂解、再次Ni+离子亲和层析后得到纯度大于95%的肝癌特异性免疫毒素A54-Mel。经细胞ELISA和四氮唑盐(MTT)法检测,发现A54-Mel在体外具有一定的肿瘤细胞特异性靶向及杀伤活性,为新型免疫毒素在肝癌靶向治疗中的研究奠定了基础。     

心肌靶向肽的筛选及验证

目的 利用噬菌体展示技术,在心肌活体切片上筛选能特异性结合心肌的靶向短肽,提高药物心肌组织靶向运输效率,为杜兴肌肉萎缩症(DMD)及其他心肌相关疾病的靶向治疗提供有效的候选靶向肽.方法 制备心肌活体切片,体外培养心肌活体切片并用免疫组化技术检测其蛋白活性.将噬菌体文库以1x1012pfu的滴度与体外培养的心肌活体切片共孵育,回收并扩增与心肌活体切片结合的噬菌体,再经5轮体外生物淘选获得特异性靶向心肌的噬菌体,测序分析候选噬菌体的插入序列并对高效富集的噬菌体进行体内组织分布验证.结果 成功建立了心肌活体切片体外培养平台,获得了具有良好生物学活性的心肌活体切片,活体切片培养48 h后,仍能检测到抗肌萎缩蛋白的正常表达和定位.在此基础上,利用噬菌体文库对心肌活体切片进行5轮筛选,回收滴度测定结果显示淘选具有良好的富集效应.筛选后的噬菌体测序分析和体内组织分布验证结果显示,候选噬菌体在心肌、骨骼肌中出现明显富集,而在肝、肾组织中分布显著降低.结论 筛选出的候选噬菌体在心肌和骨骼肌中均表现为较高的结合效率,证明候选短肽具有心肌靶向能力,同时也为DMD的心肌靶向治疗提供了一种新方法.     

从噬菌体15肽库中筛选乙脑病毒糖蛋白模拟肽

目的 用抗JEVE蛋白的mAb2H4筛选噬菌体15肽库,以研究JEVE蛋白模拟肽。方法 用生物素标记的mAb2H4,对噬菌体随机15肽库进行3轮筛选,经ELISA鉴定后,随机挑战取10个阳性噬菌体克隆测序,并与JEVE蛋白进行同源性比较,结果 筛选到的噬菌体能与mAb2H4特异地结合,并且这种结合可被天然JEV抗原所抑制,10个阳性噬菌体克隆的氨基酸序列相同,均为RQD-PQWPYANSTIAR,同源分析表明,在JEVE蛋白不同区域有两个同源性较高的序列：STXAR和WXXAXST,阳性噬菌体展示肽了能与抗天然JEV抗原的鼠血清产生特异性反应。结论 筛选的该噬菌体克隆展示肽可模拟JEVE蛋白的部分抗原性。     

噬菌体肽库与NCI-H1299细胞筛选肺癌特异性结合多肽ZS-9的初步研究

目的：利用噬菌体肽库与肺癌NCI-H1299细胞筛选出肺癌特异性结合的多肽,研究其亲和力和特异性。方法：以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,与噬菌体随机十二肽库进行三轮筛选,挑取单克隆扩增并测序,进行生物信息学分析、比对;利用ELISA、细胞免疫化学、组织免疫化学方法测定多肽的亲和力和特异性。结果：经过三轮减性筛选发现,随机挑选的9个单克隆中,其中1个对〖JP〗NCI-H1299和A549均具有较高亲和力,将其命名为ZS-9,测序结果为CAT AAT AAG CAT CTT CCG TCT ACG CAG CCT CTT GCG,根据测序结果推导出ZS-9的氨基酸序列HNKHLPSTQPLA,生物信息学分析表明ZS-9的氨基酸序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI) GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性,表明我们筛选到一种新的肺癌相关抗原的配体。结论：利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞NCI-H1299和A549具有较高亲和力的多肽ZS-9,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。     

利用噬菌体肽库技术获得与人Fas结合的多肽基序

目的　利用噬菌体随机肽库技术获得与人Fas胞外区结合的多肽及其多肽基序 ,观察多肽基序的生物学功能。方法　以人Fas胞外区与IgGFc段的融合蛋白Fas .Fc为筛选配基 ,筛选噬菌体随机九肽库 ;微量淘洗与ELISA相结合鉴定阳性克隆 ,DNA测序和分析。化学合成多肽进行竞争性ELISA以及细胞增殖抑制实验。结果　经过 4轮亲和筛选 ,微量淘洗鉴定 ,获得 4 2个阳性克隆 ;固定ELISA实验显示筛选到的噬菌体短肽能与Fas .Fc特异性结合 ,并呈剂量依赖关系 ;随机选取 13个阳性克隆进行DNA测序 ,其序列及出现几率分别为 :PRKARVDTS(2 / 13)、YKKKSLQVQ (2 / 13)、YKKKSMLQA(2 / 13)、SRKKYDQYA(4/ 13)、YARKIKPTA(2 / 13)和ARKKTEGAG(1/ 13)。经多重序列分析 ,获得多肽基序 : R/KKK A。在ELISA和竞争性ELISA实验中 ,化学合成多肽EGEFYKKKSM LQADPAK (P3)可抑制Fas与抗人Fas单抗Apo 1的结合 ,且呈剂量效应关系 ;P3不能抑制Fas与FasL的结合。细胞增殖实验表明 ,多肽可抑制Jurkat细胞增殖 ,且随多肽剂量的增加而加强。多肽与单抗Apo 1联合作用对Jurkat细胞增殖的影响与单独使用P3没有明显差别。结论　通过噬菌体随机肽库技术获得与Fas结合的多肽及其多肽基序 ,它们可能模拟了抗Fas抗体Apo 1对Fas的结合位点 ,为基于Fas凋     

胃癌特异性血管结合多肽的体内筛选和初步鉴定

目的：利用噬菌体随机肽库，体内筛选可与胃癌移植瘤血管内皮细胞特异结合的多肽片段，为肿瘤的血管抑制治疗提供有效的方法和手段。方法：采用肾包膜下移植法(SRCA)，建立免疫抑制小鼠肾包膜下人胃癌移植瘤模型。在小鼠体内对噬菌体十二肽库进行4轮淘筛，回收移植瘤和对照组织(脑)中的噬菌体并滴定计数。同时，用免疫组织化学染色法，检测噬菌体在移植瘤组织中的分布情况。结果：与胃癌移植瘤血管特异结合的噬菌体得到富集，为对照组织(脑)的3．4倍。随机挑取单个克隆测序鉴定，发现十二肽YESIRIGVAPSQ的出现次数最多，免疫组化染色显示，噬菌体注入小鼠尾静脉5min后，定位于移植瘤血管的内皮细胞。向小鼠体内单独注入呈现十二肽YESIRIGVAPSQ的噬菌体，从胃癌移植瘤组织回收的噬菌体数量为对照组织(脑)的4．2倍，肺的4．9倍，心脏的5．4倍。结论：筛选到的模拟短肽YESIRIGVAPSQ，有可能成为肿瘤血管靶向治疗的有效工具。体内淘筛噬菌体随机肽库，筛选与靶器官血管内皮细胞特异结合的短肽是可行的，具有推广和应用价值。     

Scavenger receptor block as strategy for the identification of bone marrow homing phages by panning in vivo random peptide phage displayed libraries

Surface molecules exclusively expressed by cells of the bone marrow (BM) are candidate targets for delivering therapeutic agents to this tissue. To identify ligands specific for the BM, we performed a series of pannings in vivo with random peptide phage displayed libraries (RPPDL). We could show that phages bind to bone marrow endothelium (BME) independently of the peptide insert, suggesting that the BM, similarly to spleen and liver, is part of the reticulo-endothelial system (RES). Furthermore, this strong "natural" affinity to the BME was abrogated by polyanions, indicating that phage trapping by this endothelium is mediated by scavenger receptors (SR). To circumvent interference by SR, polyinosinic acid was administered before phage panning in vivo. This led to the identification of a consensus motif that confers binding specificity for a subpopulation of hemopoietic marrow cells. Thus, SR inhibition, by avoiding phage trapping by the endothelium, seems to allow phage particles to extravasate and reach parenchymal cells. Accordingly, this panning strategy in vivo may be useful for the identification of targeting motifs specific for cells located in the extravascular space of various tissues.     

A novel melanoma-targeting peptide screened by phage display exhibits antitumor activity

Peptide display on the phage surface has been widely used to identify specific peptides targeting several in vivo and in vitro tumor cells and the tumor vasculature, playing a role in the discovery of bioactive antitumor agents. Bioactive peptides have been selected to target important tumor receptors or apoptosis-associated molecules such as p53. Presently, we attempted to identify potentially antitumor bioactive molecules using the whole cell surface as the recognizable static matrix. Such methodology could be advantageous in cancer therapy because it does not require previous characterization of target molecules. Using a C7C phage display library, we screened for peptides binding to the B16F10-Nex2 melanoma cell surface after pre-absorption on melan-A lineage. After a few rounds of enrichment, 50 phages were randomly selected, amplified, and tested for inhibition of tumor cell proliferation. Seven were active, and the corresponding peptide of each phage was chemically synthesized in the cyclic form and tested in vitro. Three peptides were able to preferentially inhibit the melanoma lineage. A unique peptide, [-CSSRTMHHC-], exhibited in vivo antitumor inhibitory activity against a subcutaneous melanoma challenge, rendering 60% of mice without tumor growth. Further, this peptide also markedly inhibited in vitro and in vivo the tumor cell invasion and cell-to-cell adhesiveness in vitro. This is the first report on a bioactive peptide derived from a C7C library active against whole melanoma cells in vitro and in vivo.     

应用噬菌体展示肽库技术淘选大鼠CCR5膜外第一、二胞外环特异性结合的活性拮抗肽与初步鉴定

目的:利用噬菌体展示肽库技术淘选与大鼠CC趋化因子受体5(CCR5)膜外第一、二胞外环特异性结合的短肽,并鉴定其与CCR5的结合能力。方法:在蛋白质数据库中查得大鼠CCR5第一、二胞外环的氨基酸序列,合成相应的线性短肽作为淘选的靶分子,利用噬菌体展示7肽文库进行3~4轮淘选,用ELISA法鉴定所选肽与靶分子的结合,并测定其与浓度的关系。结果:与CCR5第一、二胞外环特异性结合的噬菌体展示的短肽序列分别为GHWKVWL和HYIDFRW,ELISA鉴定呈阳性反应,且短肽与靶分子的结合具有浓度依赖性和可饱和性。结论:利用噬菌体展示技术成功获得了2条CCR5特异性结合的短肽,并在体外证明其可与CCR5第一、二胞外环具有结合能力。     

内毒素休克小鼠肝脏血管内皮细胞特异性结合肽的体内筛选及初步鉴定

目的：利用体内噬菌体展示技术筛选能与内毒素休克小鼠肝脏血管特异性结合的短肽。方法:尾静脉注射噬菌体环七肽库至内毒素休克小鼠体内，循环10 min后，回收肝脏中的噬菌体。将回收的噬菌体扩增、纯化，并以此为起始物进行下一轮筛选。经过4轮筛选后，将所得文库与正常小鼠做一次差减筛选。随机挑取噬菌体单克隆进行测序，序列分析后，进行噬菌体的体内回输实验及免疫组化分析，验证所筛得噬菌体克隆的导向情况。结果:经过4轮体内筛选，肝脏中噬菌体回收率逐步提高，证明噬菌体文库在肝脏血管中得到有效富集。DNA测序后发现，10条序列中有5条为LTTWAPA，体内回输实验和免疫组化实验均证实表达该序列的噬菌体能有效地靶向于休克小鼠肝脏血管内皮细胞。结论:筛选到的短肽LTTWAPA能特异性结合于内毒素休克小鼠肝脏血管内皮细胞，有可能对内毒素休克的治疗具有重要意义。     

Collagen mimetic peptide engineered M13 bacteriophage for collagen targeting and imaging in cancer

Collagens are over-expressed in various human cancers and subsequently degraded and denatured by proteolytic enzymes, thus making them a target for diagnostics and therapeutics. Genetically engineered bacteriophage (phage) is a promising candidate for the development of imaging or therapeutic materials for cancer collagen targeting due to its promising structural features. We genetically engineered M13 phages with two functional peptides, collagen mimetic peptide and streptavidin binding peptide, on their minor and major coat proteins, respectively. The resulting engineered phage functions as a therapeutic or imaging material to target degraded and denatured collagens in cancerous tissues. We demonstrated that the engineered phages are able to target and label abnormal collagens expressed on A549 human lung adenocarcinoma cells after the conjugation with streptavidin-linked fluorescent agents. Our engineered collagen binding phage could be a useful platform for abnormal collagen imaging and drug delivery in various collagen-related diseases.