人CXC型趋化因子受体CXCR6真核表达载体的构建及生物学功能研究

目的:克隆和构建带人CXC型趋化因子受体6(CXCR6)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+).CXCR6,分析瞬时转染CXCR6基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响.方法:Trizol一步法抽提人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR扩增CXCR6全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体peDNA3.1(+),酶切鉴定.将构建好的pcDNA3.1(+)-CXCR6瞬时转染.MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达.利用微孔隔离小室检测转入人CXCR6基因的MDA-MB-231细胞的迁移能力.结果:扩增出人CXCR6基因全长,测序结果和GenBank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).瞬时转染pcDNA3.1(+)-CXCR6显著增强MDA.MB-23l细胞的迁移能力.结论:成功构建带有人CXCR6基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CXCR6,为CXCR6在肿瘤学中的研究奠定基础.     

组织蛋白酶L基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒并进行表达鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人卵巢癌组织总RNA中逆转录CTSL基因的cDNA全长,克隆到pMDl8-T载体上;亚克隆至pcI)NA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和westeIn-blot检测CTSL基因和蛋白表达.结果:PCR克隆出CTSL cDNA全长,成功克隆人pMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,重组阳性克隆酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正确插入pcD-NA3.1载体.RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达.结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌中的作用提供了实验基础.     

uPA和PAI-1基因克隆及真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆人卵巢上皮癌组织uPA和PAI-1基因cDNA全长,构建表达uPA和PAI-1基因的真核表达载体。方法：采用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA和PAI-1基因的cDNA全长,克隆到pGEM-TEasy Vector上,通过酶切和测序进行鉴定;酶切后与真核表达载体pcDNA3.1/myc-his（-）B连接,酶切及测序再次鉴定;采用脂质体法将重组质粒DNA转染至卵巢癌上皮细胞SKOV3细胞;采用有限稀释法和G418分别加压筛选并培养SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞及对照细胞;Western blot法检测转染前后SKOV3细胞uPA和PAI-1基因的表达。结果：成功扩增出uPA和PAI-1基因的cDNA的全长,并克隆入T载体,DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3.1-uPA和pcDNA3.1-PAI-1,Western blot能检测到uPA和PAI-1基因蛋白分别在SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞中的表达。结论：成功构建了uPA和PAI-1表达基因的真核表达载体,为进一步研究uPA和PAI-1基因在卵巢癌侵袭转移中的作用提供了实验基础。     

脂氧素A4受体样蛋白基因的克隆与转染及其在Hela细胞的表达

目的：构建脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)基因的真核表达载体，克隆后转染Hela细胞，观察LRLP基因在Hela细胞中的表达。方法：应用PCR方法．以小鼠睾丸cDNA为模板，扩增出LRLP基因片段，插入质粒pGEM—T中，转化人大肠杆菌JM109。扩增阳性重组质粒，经酶切后纯化并测序鉴定目的片段。构建含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP／LRLP，转化人大肠杆菌JM109扩增．酶切后再测序鉴定目的片段，抽提质粒后瞬时转染Hela细胞，置激光共聚焦显微镜下照像。结果：测序鉴定表明．克隆的LRLP序列与GenBank中LRLP原序列100％．符合，激光共聚焦显微镜下见Hela细胞中LRLP基因表达。结论：成功地构建了真核表达载体pEGFP／LRLP，并转染了Hela细胞。     

人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达

目的:从人类乳腺癌耐多柔比星细胞株细胞(MCF-7/Adr)中克隆CD44基因并构建CD44基因真核表达载体pcDNA3.1-CD44;将pcNDA3.1-CD44稳定转染入人乳腺癌细胞株(MCF-7)细胞中.方法:从MCF-7/Adr细胞中提取总RNA进行RT-PCR,获得全长的cDNA模板;将含有CD44基因的cDNA模板使用限制性内切酶进行双酶切获得带有酶切位点的CD44基因,再将带有酶切位点的CD44基因经TA克隆后测序验证,然后亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,双酶切鉴定后再次测序验证.脂质体法将pcDNA3.1-CD44质粒转染到MCF-7细胞中,48小时后RT-PCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF-7细胞的表达变化.结果:成功从人MCF-7/Adr细胞中克隆获得CD44基因并构建真核表达载体,转染后在MCF-7中检测到CD44基因mRNA和蛋白水平表达上调;将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF-7细胞经G418筛选两周后获得阳性克隆.结论:成功克隆和建立人CD44基因真核表达质粒;pcDNA3.1-CD44能在MCF-7细胞中表达;在MCF-7/Adr中新发现一种CD44基因的变异体(基因库号FJ216964);这为进一步研究其基因功能打下了基础.     

人Survivin基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的:研究Survivin在肝癌细胞中的表达定位。方法:用RT-PCR的方法从肝癌组织中获取Survivin基因,并克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,获得重组质粒pEGFP-Survivin,再转染到肝癌细胞SMMC-7721中,利用载体上的GFP跟踪其细胞内定位。结果:成功克隆了Survivin基因,经DNA测序与人Survivin基因完全一致。重组质粒pEGFP-Survivin成功转染到人肝癌细胞SMMC-7721中,并观察到GFP表达于肝癌细胞的胞浆中。结论:重组质粒pEGFP-Survivin能成功构建。     

pIRES2-EGFP-hBMP2载体的构建及对人牙龈成纤维细胞表型的影响

目的:构建hBMP2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2并观察其对人牙龈成纤维细胞表型的影响. 方法:采用RT-PCR方法从人成骨肉瘤细胞中克隆hBMP2基因,连接T 载体并测序正确后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定后转染入HEK293细胞中,利用荧光显微镜和Western Blot进行表达鉴定,最后转染人牙龈成纤维细胞,通过MTT实验观察转染hBMP2后对人牙龈成纤维细胞增殖特性、ALP活性、OC含量、体外矿化能力的影响. 结果:成功克隆了人BMP2基因,酶切鉴定及测序均正确,真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2能正确表达hBMP2蛋白,hBMP2对人牙龈成纤维细胞增殖特性无影响,但可增强其ALP活性、OC含量及体外矿化能力. 结论:构建了hBMP2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2,该基因可促进人牙龈成纤维细胞向成骨细胞方向分化.     

人G蛋白偶联受体107表达载体构建及细胞定位的研究

目的克隆人G蛋白偶联受体107(GPR107)基因以构建真核表达载体,并探讨GPR107在真核细胞中的亚细胞定位。方法通过分子克隆技术克隆人GPR107基因的cDNA;利用真核细胞表达载体pCMV-Tag2B构建重组载体pCMV-Tag2B-GPR107,瞬时转染至293T细胞,Western blot检测GPR107的表达变化;采用免疫荧光标记,激光共聚焦显微镜观察GPR107在细胞中的定位。结果经过基因测序证实获得人GPR107的cDNA;成功构建真核表达载体pCMV-Tag2B-GPR107;Western blot结果显示,与未转染组比较,转染组GPR107表达量明显上调。激光共聚焦显微镜观察显示GPR107主要表达于细胞质。结论 GPR107在293T细胞中过表达,并定位于细胞质。     

pEGFP-N1-PP1α真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

目的 构建人PP1α基因真核表达载体, 并观察其在人骨肉瘤细胞株(U-2OS)中的表达,为进一步研究PP1对骨肉瘤细胞凋亡影响提供基础.方法 提取U-2OS细胞中总RNA,RT-PCR扩增PP1α并克隆至pEGFP-N1载体,鉴定出阳性克隆送测序, 以重组质粒转染U-2OS细胞,通过Western blot检测转染细胞中PP1α的表达.结果 成功扩增PP1α基因大小片段,重组质粒pEGFP-N1-PP1α的酶切鉴定及测序结果均证明PP1α基因成功克隆到真核表达载体中,Western blot结果证实转染重组质粒后的U-2OS细胞PP1α蛋白表达水平增强.结论 实验将pEGFP-N1-PP1α质粒转染到U-2OS细胞,可以在U-2OS细胞中获得PP1α蛋白增强表达.     

乙肝病毒核心蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建2种包含乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的真核表达载体,检测其在人肝癌细胞系BEL7402中的表达.方法 以质粒pUC19/3.0HBV作为模板,PCR扩增HBc基因,分别以pcDNA3.0和pEGFP-N1为母本,构建含HBc基因的真核表达载体pcDNA-HBc-HA及pEGFP-HBc.通过单、双酶切、PCR及DNA测序鉴定其正确性.利用脂质体将其分别转染入人肝癌细胞系BEL7402,并采用RT-PCR、Western blot及荧光显微镜观察的方法,分别检测其mRNA、蛋白质水平的表达.结果 获得与预期分子量大小一致的DNA片段,转染2种质粒的BEL7402细胞均可高水平表达HBc mRNA,而空载体转染组则无表达,转染pEGFP-HBc转染组及pEGFP-N1转染组,均有较强的绿色荧光表达,pcDNA-HBc-HA转染组细胞可检测到HBc-HA融合蛋白的表达.结论 成功构建2种携栽HBc基因的真核表达载体,并可在人肝癌细胞系BEL7402中有效表达.     

抗端粒酶M1RNA核酶真核表达载体构建及肝癌细胞转染的研究

目的构建抗人端粒酶RNA(hTR)的M1RNA核酶的真核表达载体,并筛选稳定转染核酶的肝癌细胞株。方法设计并应用PCR技术合成hTR模板的M1RNA核酶,应用pEGFPC1载体构建M1RNA核酶的真核表达质粒,应用脂质体LipofectAMINEAM2000转染肝癌细胞系HepG2,应用G418筛选稳定表达核酶的细胞株。结果测序证实hTR的M1RNA核酶基因被正确克隆入真核表达载体pEGFPC1,应用脂质体成功转染肝癌细胞系HepG2。结论成功构建了hTR的M1RNA核酶,并筛选出了稳定表达核酶的肝癌细胞株。     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

uPA在肝癌细胞株及肝癌组织中的表达及意义

目的:从mRNA水平探讨uPA在不同转移潜能肝癌及恶性黑色素瘤细胞株中的表达,从蛋白水平探讨uPA在肝癌组织中的代表表达及其与肝癌转移的关系。方法:检测uPA在不同转移潜能人肝癌及恶性黑色素瘤细胞株中的mRNA表达,用免疫组织化学方法检测uPA在肝癌组织中的蛋白表达。结果:uPAmRNA在高转移潜能肝癌和恶性黑色素瘤细胞株呈高表达,在相应低潜能转移细胞株呈低表达;uPA蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织和正常对照组,在有转移及静脉癌栓形成的肝癌组织阳性表达高于无转移及无癌栓者,癌巢边缘的癌细胞表达强于癌巢中央,血管内癌栓呈强阳性表达。结论:uPA在肝癌的的生长、侵袭和转移中起重要作用,可能作为治疗的操作、预防转移复发的对象。     

肿瘤细胞内特异表达TRAIL载体的构建及其在喉癌细胞株Hepa2中的表达

目的: 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为肿瘤基因治疗的靶向性奠定实验基础. 方法: 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181 hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181 hTERT /TRAIL.用Western Blotting鉴定喉癌细胞株Hepa2中表达产物.结果: RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片段.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL.Western Blotting结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在喉癌Hepa2肿瘤细胞中能有效表达.结论: 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为肿瘤基因治疗的靶向性提供了可行的理想工具.