人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞

目的 采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法.方法 以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和问断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs.观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定.结果 体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞.细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降.无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差.间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好.经统计学处理,第6 d后差速贴壁 间断应用NT2法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05).结论 差速贴壁结合同断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法 .     

新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的体外培养和纯化方法，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。     

成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养与鉴定

目的 探索一种简便、经济实用的获得成年大鼠嗅鞘细胞的方法.方法 无菌条件下取2.5月龄的SD大鼠嗅球最外二层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中.采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养.定期进行形态学观察并摄片.在培养第14 d行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度.结果 培养的嗅鞘细胞呈双极、多突起形、扁圆形三种,其中扁圆形较少,嗅鞘细胞的纯度在90%以上.结论 差速贴壁和阿糖胞苷化学抑制相结合进行成年大鼠嗅鞘细胞原代培养是一种简便经济实用的方法,可获得高纯度的嗅鞘细胞.     

成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定与纯化

目的:探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法.方法:取成年大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,并采用免疫荧光法进行鉴定与形态学观察.结果:通过差速贴壁法纯化,可获得纯度约为80%的嗅鞘细胞,并通过GFAP免疫荧光及P75和hoechst双重免疫荧光鉴定;相差显微镜下细胞形态以梭形、双极及三极细胞为主,有少量的多极细胞.结论:从成年大鼠嗅黏膜中成功分离培养出嗅鞘细胞,为从人鼻腔嗅黏膜中培养嗅鞘细胞提供重要的依据.     

大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分裂增殖和免疫细胞化学特性

目的:体外培养大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs),观察其形态、分裂增殖和免疫细胞化学特性,探索自体嗅黏膜嗅鞘细胞作为OECs来源的可能性。方法:采用差时贴壁的方法分离培养成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞,相差显微镜下观察细胞形态和分裂增殖;用免疫组化方法观察GFAP、NGFRp75、S鄄100、NGF、BDNF、NT鄄3的表达。结果:培养的细胞根据形态来分,可分为双极、多极和偏平状;细胞分裂时先回缩成球形,分裂成两个子球,再伸出突起,变成梭形或多极形。GFAP、NGFRp75、S鄄100、BDNF和NT鄄3表达阳性。结论:在含血清培养基上,大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞能正常分裂增殖和分泌神经营养因子。     

成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的分离、培养、纯化与生物学特性的研究

目的探讨成年大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的分离、培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫细胞化学特性。方法采用原代培养技术,从成年大鼠的嗅球分离培养OECs,用差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体等方法纯化培养OECs,并用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）扩增OECs,倒置相差显微镜下观察OECs的形态变化特点及生长情况,采用GFAP、NGFRp75、S100等抗体行免疫细胞化学染色,根据NGFRp75免疫细胞化学染色结果统计培养的OECs的纯度,并计算OECs的增殖率。结果体外培养的成年大鼠OECs主要为双极或三极细胞,其突起细长。差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法的纯化效率高于其他两种。免疫细胞化学染色显示,培养的成年大鼠OECs呈现GFAP、NGFRp75、S100蛋白染色阳性。bFGF能明显促进OECs的增殖（P〈0.01）,对OECs的形态、纯度没有明显影响。结论差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法是一种高效率的纯化培养OECs的方法,bFGF能明显促进OECs的增殖。     

免疫吸附法纯化人胚嗅鞘细胞的实验研究

目的:探索分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法。方法:分离人胚嗅球,采用胰酶消化获取单细胞悬液,应用含Forskolin、BPE的DMEM/F12培养基,接种于p75包被的培养皿,培养2周后细胞行免疫组化染色鉴定。结果:培养细胞形态多为2￣4极细胞,成纤维细胞少,嗅鞘细胞纯度非常高,嗅鞘细胞标志物p75阳性。结论:嗅鞘细胞体外分离培养条件要求极高,应用p75免疫吸附纯化培养的嗅鞘细胞效果好。     

大鼠嗅粘膜原代培养细胞的分类及细胞社会学特性研究

目的：探讨嗅粘膜的细胞社会学特性，为嗅粘膜混合细胞移植治疗中枢神经系统损伤提供可行性研究资料。方法：自成年大鼠鼻中隔活体剪取部分嗅粘膜制成细胞悬液接种于玻璃培养皿，用含10％胎牛血清的F12培养基培养，动态观察细胞的贴壁、生长及分化过程，并用波形蛋白(vimentin)、层粘连蛋白(Iaminin)、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)及神经生长因子受体p^75(nerve growth factor receptor p^75，NGFRp^75)抗体作免疫细胞化学染色，对阳性细胞进行形态学鉴定。结果：体外培养的嗅粘膜细胞中包含成纤维细胞、神经干细胞、嗅细胞和嗅鞘细胞等，不同类型细胞的形态及生长特性存在差异。结论：嗅粘膜细胞之间具有协调的细胞社会学关系；成体嗅粘膜混合细胞群移植治疗中枢神经系统损伤的可行性具有细胞社会学基础。     

新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及形态学观察

目的探讨新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及纯化方法，并对其形态学特征进行观察。方法分离培养新生大鼠嗅球中的嗅鞘细胞，联合应用差速贴壁法和阿糖胞苷抑制法进行纯化，NGFRp^75免疫组化染色鉴定细胞。结果可获得较高纯度的嗅鞘细胞，其形态主要为双极、多极和无突起的“油煎蛋”形，细胞突起细长并交织成网状。结论该方法步骤简便，可重复性好，具有较高的实用价值。     

人血清及神经生长因子对成人鼻黏膜嗅鞘细胞体外增殖的影响

目的:观察人血清及神经生长因子对成人鼻黏膜嗅鞘细胞体外增殖的影响.方法:取成人(自愿者)鼻腔嗅黏膜,制成细胞悬液,分别用DF12培养基(对照组)、10 ng/ml NGF DF12培养基、10%胎牛血清的DF12培养基、10 ng/ml NGF 10%胎牛血清的DF12培养基、10%人血清的DF12培养基和10 ng/mlNGF 10%人血清的DF12培养基培养细胞,并用差时贴壁法纯化嗅鞘细胞.采用MTT法观察上述各种培养液对嗅鞘细胞增殖的影响.结果:加入与不加入NGF培养液组之间的光密度无统计学意义(P＞0.05);胎牛血清组、人血清组与对照组之间的光密度有显著统计学意义(P＜0.01);胎牛血清组和人血清组之间的光密度无统计学意义(P＞0.05).结论:人嗅鞘细胞的体外培养对血清具有依赖性,人自体血清培养可替代胎牛血清用于嗅鞘细胞的体外培养、扩增.本研究结果为人嗅鞘细胞的自体移植治疗脊髓损伤提供了可行性基础.     

大鼠嗅鞘细胞的纯化及活性检测

目的采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞,并检测嗅鞘细胞的生物活性。方法分离新生7d的SD大鼠嗅球嗅鞘细胞,分组后采用改良的6h和18h两次差速贴壁法联合不同时段（1、3和5min）胰酶消化法纯化培养,观察不同时段纯化的嗅鞘细胞的形态特点及生长情况;应用FITC标记的神经生长因子受体p75抗体（兔抗鼠NGFRp75抗体）检测嗅鞘细胞并评估细胞纯度;应用CCK-8法和酶联免疫吸附法分别检测嗅鞘细胞在纯化后3～15d的增殖活性和分泌脑源性神经营养因子的含量。结果随着细胞的生长,梭形的嗅鞘细胞逐渐增多;改良差速贴壁联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞纯度分别为（57.52±2.13）%、（78.95±2.60）%、（49.01±0.74）%,3min组最明显,组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;改良差速贴壁法联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞在纯化后7、9、11d时增殖的细胞数目和脑源性神经营养因子分泌量显示3min组最优,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论改良差速贴壁（6h＋18h）联合胰酶限时消化3min的纯化方法能获得较高纯度的嗅鞘细胞。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

胎鼠嗅球分离培养出神经干细胞的研究

目的研究胎鼠嗅球中分离培养产生神经千细胞(NSCs)的情况。方法取孕16～18d的孕鼠。取胎鼠的嗅球,用含10％FCS的培养基培养传代分离出的细胞。免疫细胞化学方法鉴定培养和传代出的细胞,对染色阳性的细胞计数检测纯度。结果P^75染色阳性证明分离培养的细胞为嗅鞘细胞(OECs)；来源于嗅球的细胞培养出的神经球行NeS血染色阳性证明为NSCs；传代OECs纯度为95%-98％。结论胎鼠嗅球中可分离培养出NSCs,OECs可稳定传代。可以作为移植用的种子细胞。     

成年大鼠侧脑室下区星形胶质细胞的培养与纯化

目的:探讨SD大鼠侧脑室下区星形胶质细胞(AST)的体外培养与纯化方法。方法:将差速贴壁后SD大鼠侧脑室下区AST置于含有B27添加剂的DMEM/F12中培养,采用低浓度血清(2.5～5ml/L)调整法对AST进行纯化。观察AST生长变化,采用形态学和GFAP免疫细胞化学染色进行细胞和纯度鉴定。结果:体外培养的大鼠侧脑室下区星形胶质细胞呈纤维状聚集或类圆形散在生长,GFAP染色呈阳性反应,细胞胞浆着色较深,高倍视野下细胞骨架形态清晰可见,细胞核不着色。在体外培养14～15d时可以获得91%的AST。结论:差速贴壁结合低浓度血清调整法是一种简单实用的AST体外培养纯化方法。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的分离培养及形态学研究

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells OECs)的分离培养方法并观察其形态。方法：采用差时贴壁和阿糖胞苷(Ara—c)抑制相结合的方法培养嗅鞘细胞,并在不同阶段进行观察和行NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定。结果：成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形3种类型,突起细长编织成网状。结论：差时贴壁和Ara—c抑制相结合的纯化培养方法是一种简单而又有实效的嗅鞘细胞培养方法。     

嗅内衬细胞的培养

目的 :探索一种简单的培养纯化嗅内衬细胞的方法。方法 :取新生 2 0 d的大鼠嗅球表层 ,以阿糖胞苷和牛垂体提取液分别作用 ,应用差速贴壁分选方法纯化培养细胞 ,以P75NGFR抗体鉴定。结果 :取得了较高纯度的嗅内衬细胞。结论 :应用阿糖胞苷和牛垂体提取液 ,联合差速贴壁分选法是有效可行的获取高纯度嗅内衬细胞的方法。     

嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子含量的测定

目的观察嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子(GDNF)的含量随培养时间的变化关系，为选择嗅鞘细胞移植的最佳时间提供理论依据。方法采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅球及嗅粘膜嗅鞘细胞，培养21天，3天留取标本一次，采用ELISA法对上清GDNF进行测定。结果GDNF的含量随培养时间的延长逐渐升高，但绝对含量很低。结论培养的嗅鞘细胞能分泌GDNF，细胞移植在14天以后为宜。     

新生大鼠嗅鞘细胞的体外培养和纯化

目的建立一种可行的体外培养和纯化嗅鞘细胞（OECs）的方法.方法利用显微外科技术,从新生大鼠脑中取出嗅球的嗅神经组织,去除脑膜和微血管,消化后细胞接种在含有10%的DMEM/F12（1：1）培养液中于体外进行培养,应用含血小板凝集抑制素、牛垂体提取液的DMEM/F12培养液,将这些细胞接种于p75包被的培养皿中纯化培养.用P75抗体免疫组织化学染色鉴定OECs,计算纯化度.结果OECs的外形主要以突起细长的双极和三极为主,随时间延长细胞生长排列呈现一定方向性.P75抗体免疫组化呈阳性.此方法获得的OECs纯度可达90%以上.结论本研究所建立的培养方法可行,适宜从新生大鼠中获得嗅鞘细胞.     

体外培养的嗅上皮神经干细胞具有多潜能性

目的:探讨成体嗅上皮神经干细胞(olfactory epithelium neural stem cells)的培养方法及其体外分化的多潜能性。方法:使用中性蛋白酶和Ⅰ型胶原酶分阶段酶解消化嗅上皮,富集嗅上皮神经干细胞,扩增细胞,用加入生长因子bFGF和EGF的无血清培养液促使其形成神经球。血清诱导神经球分化并用免疫细胞化学染色方法鉴定分化细胞。结果:原代培养的嗅上皮神经干细胞呈集落样增殖,集落中的细胞表达在体分子标记GBC2和细胞角蛋白5。传代细胞用含生长因子的无血清培养液培养可增殖形成神经球。用含血清的培养液可诱导神经球分化;从神经球迁移出的分化细胞具有很高的异质性,其中包含有TUJ1阳性的神经元、P75NGFR阳性的嗅鞘细胞、GFAP阳性的星形胶质细胞和NG2阳性的寡突胶前体细胞,同时也存在有nestin阳性的神经干细胞。结论:成体嗅上皮神经干细胞可体外培养增殖形成神经球,神经球细胞具有向神经元、星形胶质细胞和寡突胶前体细胞分化的潜能。