负载BMP的新型组织工程骨的构建及骨缺损修复实验

OBJECTIVE: To construct a new tissue-engineered bone with poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA), bone morphogenetic protein (BMP) and bone marrow-derived stem cells (BMSCs) and observe its effect in repairing segmental bone defects. METHODS: A 15-mm bone defect in the right radius was induced in New Zealand white rabbits, and the models were randomized into three groups to receive implantation of the tissue-engineered bone grafts constructed with PLGA carrying 5 mg BMP and about 1 x 10(6) BMSCs (experimental group), grafts of PLGA with about 1 x 10(6) BMSCs (control group), or grafts of exclusive PLGA (blank control group), respectively. The osteogenesis in the bone defect after the implantation on was evaluated X-ray films, and the histological changes of the tissues sampled from the bone defect 4, 8, and 12 weeks after operation were observed and new bone formation was measured by image analysis. RESULTS: The bone defect was completely repaired in the experimental group 12 weeks after the implantation, showing the best results among the 3 groups. The bone defects in the blank control group was filled with only fibrous and connective tissues at 12 weeks. CONCLUSION: This tissue-engineered bone constructed with PLGA, BMP and BMSCs possesses good ability in repairing segmental bone defect.     

负载BMP的新型组织工程骨的构建及骨缺损修复实验

目的 探讨以聚乳乙醇酸(poly-(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨髓基质干细胞(BM-SCs)构建成新型组织工程骨并观察其在动物体内的成骨能力。方法 制作新西兰大白兔右桡骨中段15mm骨缺损实验模型,随机分为实验组、对照组和空白组,实验组植入同时负载5mgBMP及1×10⁶个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PLGA、对照组植入负载1×10⁶个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PLGA、空白组仅植入PLGA。术后对动物进行大体观察、摄X线片观察各组不同时相骨缺损修复情况、比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度、并于术后第4、8、12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察,图像分析骨小梁的生成数量。结果 实验组在12周内骨缺损完全修复,且同时期内新生骨的数量和质量显著优于对照组,空白材料组骨缺损主要由纤维结缔组织填充。结论 利用含BMP的PLGA支架与BMSCs复合构建的新型组织工程骨具有良好的骨缺损修复能力。     

骨髓基质细胞在3种聚合物表面的黏附性能的研究

目的 应用微吸管吸吮技术测量骨髓基质细胞在聚L-乳酸（PLLA）、丙交酯／乙交酯（PLGA）、聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇（PLGA-EASPPEG]）聚合物表面的黏附力，比较3种材料的细胞黏附性，以筛选生物相容性好的生物材料。方法 在微吸管吸吮装置下，测量不同时间段骨髓基质细胞在各种生物材料表面的黏附力。结果 细胞种植在生物材料表面4、12、24h，各时间段PLGA-[-ASP—PEG]表面的细胞黏附力均最强，PLGA表面的黏附力强于PLLA。结论 在PLLA、PLGA、PLGA-[AsP-PEG]中，PLGA-EASP—PEG]表面的细胞黏附力最好，是理想的生物材料。     

Experimental Research on Ectopic Osteogenesis of BMP2-derived Peptide P24 Combined with PLGA Copolymers

To experimentally evaluate the ectopic osteogenetic capacity of synthesized BMP2-derived peptide P24 combined with poly lactic-co-glycolic acid (PLGA), Wistar rats were di- vided into two groups: group A, in which BMP2-derived peptide P24/PLGA complex was implanted, and group B which received simple PLGA implant. The complex was respectively implanted into the back muscles of rats. Samples were taken the 1st, 4th, 8th, and the 12th week after the implantation. Their bone formation was detected by X-ray examination, and tissue response was histologically ob- served. Western blotting was used for the detection of the expression of collagen Ⅰ (Col-Ⅰ) and osteopontin (OPN). There was acute inflammation in the tissue around both types of implants at early stage. The cartilage was found around implant areas 4 weeks after the implantation of BMP2-derived peptide p24/PLGA complex, 8 weeks after the implantation, osteoblasts were found, and 12 weeks after the implantation, typical trabecular bone structure was observed. In group B, after 12 weeks, no osteoblasts were found. It is concluded that PLGA is an ideal scaffold material for bone tissue engi- neering. BMP2-derived peptide can start endochondral ossification and is more effective in inducing ectopic osteogenesis.     

高能震波治疗节段性骨缺损的机制探讨

目的探讨高能震波治疗节段性骨缺损的成骨效能及愈合机制。方法实验兔18只,制造两侧兔桡骨中段10mm的骨缺损。第6周一侧骨缺损的两骨断端用高能震波进行冲击处理,作为实验组;另一侧为对照组。于术后第2,4,6,8,12周分别行双侧桡骨X射线检查。于术后第4,6,8,12周切取标本行组织学检查,第6,8周标本切片作bFGF、BMP免疫组化研究。结果实验组施加高能震波后bFGF、BMP阳性表达强度明显高于对照组,满12周6只中4只获骨性愈合,2只未愈;对照组满12周6只无1只愈合。结论高能震波能有效地促进骨的再生与修复。     

含天然钙化层的骨软骨材料修复猪膝关节软骨缺损

目的 构建含和不含天然钙化层的修复材料,比较两者在猪膝关节软骨缺损修复中的效果,探讨钙化层在骨软骨组织工程中的重要性.方法 选取普通实验猪膝关节骨,软骨通过Ⅱ型胶原水凝胶冻干技术和天然骨软骨脱细胞技术构建含有钙化层和无钙化层的骨软骨支架,以贵州小香猪自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)为种子细胞,构建移植修复材料.30只小香猪按随机数字表法分为空白对照组、无钙化层组、含钙化层组(n=10).双膝关节滑车骨软骨缺损造模,直径8 mm,深至软骨下骨,植入对应的修复材料.分别于12、24周取材,采用大体、体式显微镜观察,以及MRI检测缺损填充情况,HE染色、番红0-固绿染色,以及Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色观察新生修复物的组织类别,O'Driscoll组织学评分评价修复效果.结果 各组术后24周修复效果较12周均有改善.大体和体式显微镜观察,24周空白对照组新生组织部分填充缺损,为纤维组织,软骨表面凹陷深大;无钙化层组移植物填充缺损,软骨表面凹陷;含钙化层组缺损填充较好,表面微凹陷,三层结构可见,与宿主组织整合佳.组织学观察提示空白对照组为纤维组织填充修复;无钙化层组为骨和纤维软骨修复,三层结构不明显;含钙化层组钙化层结构清晰,移植物与宿主整合,软骨表面微凹陷,透明软骨修复.O'Driscoll组织学评分,12、24周空白对照组分别为(3.80±0.83)、(5.50 ±0.52)分,无钙化层组分别为(10.30±0.63)、(14.20±0.68)分,含钙化层组分别为(15.10±0.58)、(18.80±0.87)分,各组评分差异均有统计学意义(P＜0.01),含钙化层组评分最高.结论 含有天然钙化层的骨软骨支架,在猪骨软骨缺损修复中取得了很好的修复效果,明显优于无钙化层支架和空白对照,是今后软骨组织工程支架设计的重要参考.     

血管内皮细胞生长因子165基因转染对兔骨缺损修复的影响

目的 构建pcDNA3．1-血管内皮细胞生长因子（VEGF）165质粒,观察其对兔骨缺损修复的影响。方法构建成重组真核表达质粒pcDNA3．1-VEGF165;采用30只新西兰大白兔,制备双侧桡骨骨缺损模型,实验组以体积等大的明胶海绵置于创腔,局部直接注射稀释的质粒液200ng;对照组以同量生理盐水代替质粒液,同法处理。于术后1、2、4、6、8和12周行X线照片后获取标本,观察缺损局部组织修复及新生血管并计算微血管密度（MVD）。结果pcDNA3．1-VEGF165质粒构建成功,测序正确。术后X线：1周时两组无明显差别,实验组2周骨痂形成、骨质修复,12周时骨质已正常,对照组表现为修复迟缓;HE染色：实验组2周大量新生血管形成、通血,4周成骨细胞大量增殖、骨小梁形成,12周骨皮质改建完成,骨髓腔再通;对照组经历过程类似,但相对时间延迟,12周时骨髓腔及皮质改建尚未完成。2周时对照组及实验组MVD分别为56．1±6．1、69．1±5．4,均较1周时42．2±6．4、47．0±7．5时增加,组间及组内间差异有统计学意义（t=8．0347,P=0．0000）。结论骨缺损局部直接应用PcDNA3．1-VEGF165质粒液后,可表达并上调VEGF165,具有促进局部微血管形成、加快骨缺损修复的作用。     

特种肽支架材料对骨髓基质干细胞黏附、增殖及成骨分化的影响

目的 探讨新型含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽K16RGDSPC修饰聚丙交酯-CO-乙交酯（PLGA）-[ASP-PEG]支架材料对骨髓基质干细胞（BMSCs）在其表面黏附、增殖及成骨分化的影响。方法 固相合成法合成K16GRGDSPC并通过质谱仪和高压液相色谱进行鉴定。用交联剂Sulfo-LC-SPDP将K16GRGDSPC接枝到PLGA-[ASP-PEG]支架材料上,通过XPS图谱检测接枝反应的发生。将改性后的PLGA-[ASP-PEG]支架材料与兔BMSCs在成骨诱导培养基中复合培养,以未改性的支架材料作对照。通过沉淀法、微管吮吸法、MTT法和考马斯亮蓝法分别检测BMSCs的黏附和增殖性能的变化;应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP表达水平并通过RT-PCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）和Ⅰ型胶原的表达,通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达,观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XPS图谱证实含RGD肽K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面。复合BMSCs培养结果表明,改性后的PLGA-[ASP-PEG]表面BMSCs的黏附性能和增殖能力明显提高,而且其成骨标志物（ALP、OCN、OPN、Ⅰ型胶原和Cfba1）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 含RGD肽K16GRGDSPC能促进BMSCs在骨基质材料表面的黏附、增殖并诱导其向成骨方向分化。     

牡蛎壳／消旋聚乳酸复合人工骨修复兔桡骨缺损的实验研究

目的观察牡蛎壳／消旋聚乳酸复合人工骨（OPCB）修复兔桡骨节段性骨缺损的成骨能力,同时观察其在体内的生物相容性、降解情况,并评价其性能。方法应用热致相分离法（TIPS）分别制得OPCB及纯消旋聚乳酸（PDLLA）多孔材料;将27只成年新西兰白兔随机分成3组。制作1．2cm的双侧桡骨干缺损并植入上述两种材料。设立不植入任何材料的空白对照组。观察材料植入后动物的局部及全身反应。于术后6、12、侣周分别取材。作X线、大体标本及组织形态学观察,同时观察术后不同时期的组织反应、材料的降解、骨缺损的修复情况。结果OPCB及纯PDLLA植入动物体内无明显的局部不良反应,且OPCB材料修复骨缺损的能力明显强于纯PDLLA及空白对照组（P〈0．05）。术后18周时,植入OPCB材料的骨缺损基本修复,OPCB与宿主骨结合紧密;植入纯PDLLA材料的骨缺损部分修复;空白对照组则骨缺损断端只有少量骨生成。形成骨不连。同时OPCB材料植入后在6、12周分别可见吞噬有材料的巨噬细胞和多核巨细胞．18周时仍有部分复合材料未降解吸收。结论OPCB材料具备良好的生物相容性及骨缺损修复能力,是一种良好的骨组织工程修复材料。     

骨髓基质细胞复合聚DL-乳酸/羟基磷灰石修复兔桡骨缺损的研究

目的探讨复合兔骨髓基质细胞（BMSCs）的聚DL-乳酸/羟基磷灰石（PDLLA/HA）在修复兔桡骨缺损中的效果。方法 36只健康新西兰白兔,共72侧前肢,造成1.0cm长的桡骨缺损,随机分成A、B、C3组,A组植入BMSCs＋PDLLA/HA,B组单纯植入PDLLA/HA,C组不做任何植入,于术后2、4、8、12周时行X线、大体和组织学观察。结果 A组成骨效果优于B组,12周时已完全骨性愈合,髓腔通畅,在各骨缺损修复时期,其成骨速度、成骨量和再生髓腔结构均优于B组、C组;A组X线评分也高于B组,差异均有统计学意义（均P〈0.01）。结论 BMSCs复合PDLLA/HA具有较强的成骨能力,有望成为临床修复骨缺损的治疗方法。     

Experimental Study on the Enhancement of Rat Skull Defects Repair by Induced Osteogenesis

The repairing capacities of bone matrix gelatin(BMG),decalcified bonematrix(DBM)and deep frozen bone(DFB)were tested in experimental defects onskulls of rats.The healing of defects were judged by roentgenographic,histological and atomic absorption spectrophotometric methods.The healing ofdefects was most effective with BMG(P<0.01),and DMB came next while thecapability of bone induction was very weak in DFB.In the BMG and DBMgroups,skull defects were completely healed in 12 weeks after the operation,but inthe DFB group healing was incomplete.The control group failed to healspontaneously.The results suggest that during the process of resorption of BMGand DBM,bone morphogenetic protein(BMP)was released by diffusion,whichinduced mesenchymal cells originating from the dura mater to differentiate intochondrocytes and osteobIasts,resulting in formation of new bone.The inducedosteogenesis is considered to be a complex process regulated not only by BMP butalso by various systemic and local growth factors.     

骨形态发生蛋白及多孔复合陶瓷人工骨修复长骨大段骨缺损的实验研究

目的：为研制理想的、能较快修复长骨大段骨缺损的人工骨材料。方法：将骨形态发生蛋白（BMP）和多孔复合陶瓷（PCC）结合研制成BMP／PCC人工骨,并将BMP／PCC和PCC人工骨进行兔桡骨大段骨缺损修复的对比研究。术后2、4、8、12周时取材,分别作大体、组织形态学、新骨形成定量分析及生物力学测试。结果：BMP／PCC人工骨内新骨形成量明显多于PCC人工骨、术后12周时,BMP／PCC侧植入部位的抗折强度明显高于PCC侧。结论：BMP／PCC人工骨能更快促进长骨大段骨缺损的修复,是一种较理想的人工骨材料。     

同种异体骨移植后骨愈合的实验研究

目的：通过有关的动物实验来探讨有关异体骨移植骨愈合的规律，以达到加速异体骨移植骨愈合的目的。方法：24只新西兰大白兔为实验动物，随机分为实验组和对照组。实验组用梯度降温、深低温保存的股骨外侧髁植入，在接触的骨面置入骨形态发生蛋白(BMP)骨基质，以金属螺钉固定；对照组用取下的自体股骨外侧髁原位植入，用与实验组相同的内固定方法固定；术后4、8和12周行大体标本观察，并行苏木精-伊红(H-E)染色及BMP免疫组化染色，观察异体骨愈合的情况。结果：深低温保存的同种异体骨移植愈合与自体骨相似。BMP染色在新生骨及其周围类基质表达阳性。其愈合是从宿主骨向移植骨，从周围向中央，从哈佛管向其四周逐渐进行爬行替代的过程。结论：同种异体骨移植愈合过程主要通过骨传导实现成骨，骨诱导亦发挥积极作用。使用BMP、合适的内固定、大小适合的移植物，可以使异体骨愈合的过程与自体骨相似。     

纳米羟基磷灰石／聚酰胺66／富血小板血浆复合物修复兔股骨中段骨缺损的实验研究

目的：探讨纳米羟基磷灰石／聚酰胺66／富血小板血浆（n-HA／PA66／PRP）复合物修复兔股骨中段骨缺损的疗效。方法新西兰大白兔共40只,切除左股骨中段1 cm 连同骨膜的骨质造成骨缺损模型后随机分为两组,实验组植入 n-HA／PA66／PRP 复合物后予以钢板固定;对照组植入 n-HA／PA66后予以钢板固定。术后2、4、8、12周每时间点处死5只兔子,进行 X 线片、大体标本观察、组织学、免疫组织化学染色等观察股骨骨缺损愈合情况。结果术后所有动物无感染、死亡及植入物脱落,大体标本及组织学结果显示术后2周内实验组开始有新生骨组织,随着时间的延长,实验组新骨生长速度和数量明显优于对照组;术后12周 Lane-Sandhu 法 X 线片评分显示实验组（6．80±2．05）分,对照组（4．20±1．30）分,二者比较差异有统计学意义（P ＜0．05）;免疫组织化学染色结果显示实验组血管内皮细胞生长因子表达强度在术后第2、4周时与对照组比较,差异有统计学意义（P ＜0．05）,在术后第8、12周时与对照组比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论n-HA／PA66／PRP 复合物具有促进骨质愈合的作用,尤其在早期修复骨缺损的效果优于 n-HA／PA66。     

3D打印多孔钛材料修复兔股骨髁骨缺损的实验研究

目的 研究3D打印的多孔钛材料对骨缺损的修复能力和成骨性能.方法 选取20只6月龄新西兰白兔,在其股骨髁上制备直径6 mm,深10 mm的临界性骨缺损.实验组将多孔钛材料迅速注入骨缺损区.对侧生理盐水冲洗,不植任何材料,作为对照组.术后3d、4周、8周、12周通过X线及CT观察骨缺损处生长变化,术后12周处死所有新西兰白兔,通过大体观察、X线、CT、Micro-CT及组织学观察骨缺损处的修复情况.结果 实验组与对照组一般情况良好,术后12周取出标本清理周围软组织,实验组缺损部位被新生骨填充;对照组见缺损处骨质凹陷;影像学观察,实验组植入物区域与周围界限模糊不清;对照组未见明显新生骨阴影;Micro-CT观察,术后12周实验组植入物区域空隙内长入新生骨组织,植入物附近可见骨小梁长入;对照组缺损区未见明显的骨长入;硬组织切片观察,实验组植入材料与成骨细胞结合,可见成熟的哈佛氏系统散在分布于新生骨内;对照组骨缺损区被大量纤维组织填充.IPP5.1计算新生骨与缺损区面积比,差异有统计学意义.结论 多孔钛材料可以促进骨组织的生长愈合,新生骨组织可以长入并充满孔隙,是一种很有应用前景的组织工程修复材料.     

诱导成骨修复大鼠颅骨缺损

本文定性、定量地考察了骨基质明胶、脱钙骨和深冻骨促进SD大鼠颅骨缺损修复的作用。结果表明它们均有不同程度的诱导成骨作用,其中骨基质明胶的作用最佳,脱钙骨次之。术后12周,骨基质明胶组的骨缺损已完全愈合,脱钙骨组接近愈合。本文还讨论了诱导成骨的机制,认为骨形态形成蛋白(BMP)是促进骨缺损愈合的主要生物活性物质:巨噬细胞可能与整个诱导过程的启动有关。     

骨不连与骨形成蛋白

研究骨不连发生的原理及骨不连与骨诱导因子的关系是抗击有不连发生机理的重要课题。方法：将兔桡骨中段告成ｃｍ的缺损，Ａ组术后即放入ＢＭＰ，Ｂ组术后４周放入ＢＭＰ，Ｃ组为在Ａ组术后８周放入ＢＭＰ。结果：发现ＢＭＰ植入８周时形成骨小梁。Ｂ组和Ｃ组，骨缺损修复仍然取得满意的效果。     

携载BMP4基因的核壳结构纳米粒子修复兔桡骨临界骨缺损的研究

目的 将改性的壳聚糖包裹骨形态发生蛋白4(BMP4)质粒形成核壳结构,以明胶海绵为此纳米粒子载体,探究其对兔桡骨临界骨缺损的修复作用.方法 新西兰大白兔24只,每只兔子的左右前肢按随机法分为负载BMP4质粒核壳结构组(TACS@EG-HBC/pBMP4/G组)、负载BMP4质粒核结构组(TACS/pBMP4/G组)和对照组.在双侧桡骨制备长约18 mm的完全性临界骨缺损,分别植入含有TACS@EG-HBC/pBMP4或TACS/pBMP4的明胶海绵,对照组仅植入单纯的明胶海绵.术后2、4、8、12周取标本做分别处理,检测缺损部位的大体标本、骨密度及骨矿物质含量、X线、HE染色、免疫组化法、生物力学.结果 24只兔子均纳入分析,术后切口未见感染、化脓等症状.大体标本示:TACS@EG-HBC/pBMP4/G组骨缺损完全骨化修复;骨密度及骨矿物质含量显著高于TACS/pBMP4/G组和对照组(P＜0.05);X线示:术后12周骨缺损处已完全修复,骨髓腔已再通;HE染色结果显示:新生骨小梁相互连接成板层骨;免疫组化结果显示:BMP4棕色蛋白染色明显;生物力学测定结果显示:所形成的新生骨与正常骨组织生物力学差异无统计学意义.结论 TACS@EG-HBC/pBMP4/G具有良好的安全性和成骨能力.     

碱性成纤维细胞生长因子在下颌骨缺损愈合中的作用

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子在颌骨缺损愈合中的作用。方法 在12只杂种狗中制作下颌骨缺损模型并分别植bFGF 自体髓和bFGF bBMP,并设置空白对照组,植入后2、4、8、12周作组织学观察骨缺损区新骨形成情况。结果 早期成纤维细胞生长因子复合物成骨更好、较单纯对照成骨好,但到8周后,所有实验组成骨无明显差异。结论 成纤维细胞生长因子能有效地促进成骨。     

异种骨衍生材料修复节段性骨缺损的实验研究

目的 :评价三种异种骨衍生材料修复节段性骨缺损的成骨作用 .方法 :分别用复合型完全脱蛋白骨 (CFDB)、部分脱蛋白骨 (PDPB)、部分脱钙骨 (PDCB)修复兔桡骨节段性缺损 ,以自体髂骨和空白缺损作为对照 ,术后 4 ,8,12 ,2 4周取材 ,通过X线摄片和不脱钙硬组织切片检测 ,评价三种材料的成骨作用 .结果 :X线摄片可见 4周时材料密度较高 ;8周时材料与宿主骨交界处模糊 ;12周时材料边缘部分区域密度接近宿主骨 ;2 4周时PDPB组髓腔再通 ,PDCB组缺损区域密度大部分接近宿主骨 ,有一些高密度影 ,CFDB组缺损区域有更多高密度影 .X线片评分表明 4周和 8周时各材料组无显著差异 ;12周时PDPB组和PDCB组评分高于CFDB组 ;2 4周时评分为PDPB组 >PDCB组 >CFDB组 .经组织形态观察可见 4周和 8周新骨贴附材料生长 ,以后新骨增多 ,材料随时间推移逐渐降解吸收 ,2 4周时成骨量PDPB组 >PDCB组 >CFDB组 .结论 :PDPB修复节段性骨缺损的效果好 ,PDCB的修复效果较好 ,CFDB修复效果欠佳