皮炎外瓶霉分子鉴定的初步研究

目的：设计皮炎外瓶霉种特异性引物，并对其特异性及敏感性进行检测。方法：通过对暗色真菌核糖体DNA进行分析，设计皮炎外瓶霉种特异性引物；实验菌株包括标准株、参照株及临床分离株等皮炎外瓶霉，以及甄氏外瓶霉、裴氏着色霉、卡氏枝孢霉、疣状瓶霉等，应用常规聚合酶链反应(PCR)及快速PCR方法检测其特异性及敏感性。结果：序列分析显示皮炎外瓶霉rRNA基因转录内间隔区较为保守，特异引物对15株皮炎外瓶霉均可扩增出单一的特异性片断，将模板稀释成1万倍后仍可得到相同的结果，其他致病菌种均为阴性。结论：皮炎外瓶霉种特异性引物具有较高的特异性及敏感性，可试用于该菌种的鉴定。     

致病性外瓶霉的PCR-RFLP分类

应用PCR方法对致病性外瓶霉进行分类鉴定。以ITS3和ITS4为引物 ,对常见的7种致病性外瓶霉的模式株核糖体DNA转录间隔区(ITSⅡ)进行扩增 ,4种内切酶(HinFI、MspI、BsuRI和RsaI)酶切。各种间多态性显著 ,常规方法难以鉴别的皮炎外瓶霉和甄氏外瓶霉较易区分。PCR RFLP准确可靠 ,可用于形态及其他方法难以确定的致病菌种的鉴别。     

致病性外瓶霉的体外抗真菌药敏试验研究

目的 测定致病性外瓶霉的药物敏感性,对不同药物间最小抑菌浓度（ＭＩＣ）的差异以及各菌种间药物敏感性差异进行比较,为指导临床正确用药提供理论依据。方法 参照Ｍ２７－ａ方案中的微量稀释法。受试菌株包括１３株皮炎外瓶霉。１７株甄氏外瓶霉,１３株丛梗孢外瓶霉,１０株棘状外瓶霉及４株威尼克外瓶霉;所研究的药物为伊曲康唑,氟康唑,酮康唑,二性霉素Ｂ及５－氟胞嘧啶。结果 二性霉素Ｂ、伊曲康唑、氟康唑、酮康唑和５     

甄氏外瓶霉致暗色丝孢霉病

报告1例甄氏外瓶霉感染所致的暗色丝孢霉病.患者男,59岁.右小腿外踝上方肿块伴瘙痒5个月,皮损为一直径约3 cm的暗红色斑块.皮损组织病理PAS染色见分隔菌丝,组织块马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上25℃培养长出黑色酵母样菌落,分离菌株最高生长温度37℃,小培养下见分枝分隔菌丝,环痕产孢,分生孢子聚集在环痕梗顶端,分离菌株ITS1区测序结果与甄氏外瓶霉98.54%同源.根据分离菌株生物学特点,菌株被确定为甄氏外瓶霉.     

微量法检测致病性外瓶霉对特比萘芬的敏感性

目的 :　探讨应用美国国家实验室标准委员会 (NCCLS)推荐的微量法检测致病性外瓶霉对特比萘芬的敏感性 ,为临床治疗由外瓶霉引起的暗色丝孢霉病提供依据。方法 :　参照M 2 7A方案(1997)检测 7种 6 6株外瓶霉最小抑菌浓度 (MIC) ,其中皮炎外瓶霉 (E .d) 19株、甄氏外瓶霉 (E .j) 18株、棘状外瓶霉 (E .sp) 12株、丛梗孢外瓶霉 (E .m) 13株、威尼克外瓶霉 (E .w) 2株、鲑鱼外瓶霉 (E .sa) 1株、嗜鱼外瓶霉 (E .p) 1株 ,菌悬液终浓度 (0 .5～ 2 .5 )× 10 3 CFU/ml,孵育温度 2 7℃ ,培养时间 5～ 7天。分别应用RPMI 16 40和SDB培养基比较其MIC值的差异。结果 :　特比萘芬对 6 6株外瓶霉的MIC范围为0 .0 0 4～ 0 .5 μg/ml,小于 0 .12 5 μg/ml的菌株有 5 8株 ,占 87.9% ,MIC50 分别为E .d 0 .0 3μg/ml,E .sp 0 .0 93μg/ml,E .j0 .0 3μg/ml。E .m 0 .0 3μg/ml,E .w 0 .0 12 μg/ml。应用RPMI 16 40和SDB培养基时MIC值具有一致性。结论 :　经过改良的M 2 7A方案可以用于特比萘芬对外瓶霉的药敏实验。致病性外瓶霉对特比萘芬的敏感性较高 ,由该类菌引起的暗色丝孢霉病可用特比萘芬治疗。     

外瓶霉引起咽部暗色丝孢霉病

报告１例瓶霉引起咽部暗色丝孢霉病。病原真菌经真菌学检查初步鉴定为甄氏外瓶霉ｌｅｃａｎｉｉ－Ｃｏｒｎｉ变种。口服伊曲康唑和５氟胞嘧啶有明显效果。文章讨论了外瓶霉的致病情况及治疗方法。     

伊曲康唑、特比萘芬和他克莫司单用及联合对皮炎外瓶霉的体外抗真菌作用

目的 探讨他克莫司与伊曲康唑、特比萘芬联合对皮炎外瓶霉的体外抗真菌效果.方法 参考美国临床实验室标准化研究所M38-A2方案,测定特比萘芬和伊曲康唑对12株皮炎外瓶霉的最低抑菌浓度;利用棋盘法,测定他克莫司和伊曲康唑或特比萘芬的联合抗皮炎外瓶霉效果.结果 特比萘芬和伊曲康唑对皮炎外瓶霉最低抑菌浓度范围分别为(0.06 ～0.125) mg/L和(0.5 ～1) mg/L.他克莫司和特比萘芬联合对5株皮炎外瓶霉、他克莫司和伊曲康唑联合对10株皮炎外瓶霉有协同作用.两组均无拮抗作用.结论 他克莫司在体外与伊曲康唑或特比萘芬联合应用时,能够增加皮炎外瓶霉对伊曲康唑和特比萘芬的敏感性.     

甄氏外瓶霉的PCR－RFLP分型研究

目的 对不同来源的甄氏外瓶霉进行分析，为建立更为合理的分型方法提供依据。方法 以ＩＴＳ３和ＩＴＳ４为引物，对１７株甄氏外瓶霉的核糖体ＤＮＡ转录间隔区（ＩＴＳⅡ）进行扩增，４种内切酶（ＨｉｎＦ、ＭｓｐＩ、ＢｓｕＲＩ和ＲｓａＩ）酶切。结果 ＩＴＳⅡ扩增片段约为３３０ｂｐ，１７个菌株可分为Ⅵ型，３朱变种发属于不同的型，ＢＭＵ００１９５带型独特，有可能为新变种或新种；种群关系与来源显示出一定的相关性。结论     

疣状瓶霉与美洲瓶霉的关系

众所周知疣状瓶霉及美洲瓶霉这两种暗色丝孢霉可引起着色真菌病,即使大多数医学真菌学家认为美洲瓶霉是疣状瓶霉的同义名,然而有些学者根据美洲瓶霉的颈圈较疣状瓶霉更深而认为这二种菌是不同的种。作者等对32株证实为美洲瓶霉或疣状瓶霉的菌种从形态学,生理学及抗原特征来研究其分类情况,其中12株可产生带或浅或深颈圈的分生孢子。这32     

抗真菌药单用及联合体外抗皮炎外瓶霉生物膜效应

目的 检测抗真菌药单用及联合对皮炎外瓶霉生物膜的体外抗真菌活性。方法 96孔板构建皮炎外瓶霉生物膜,通过棋盘式微量液基稀释法,检测两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑及卡泊芬净单用或联合抗皮炎外瓶霉生物膜的活性。结果 伊曲康唑、伏立康唑及卡泊芬净对皮炎外瓶霉生物膜50%和80%最低抑菌浓度（SMIC50、SMIC80）均 > 32 mg/L,两性霉素B的SMIC50为1 ~ 2 mg/L,SMIC 80为4 ~ 8 mg/L。两性霉素B与伏立康唑联合抗皮炎外瓶霉生物膜有协同效应;两性霉素B与伊曲康唑或卡泊芬净联合,以及伏立康唑与卡泊芬净联合对皮炎外瓶霉生物膜均无协同作用;所有组合均未见拮抗效应。结论 两性霉素B具有较好的抗皮炎外瓶霉生物膜活性,与伏立康唑联合能够增强对皮炎外瓶霉生物膜的杀伤作用。     

甄氏外瓶霉所致皮肤暗色丝孢霉病1例

患者女,57岁。右前臂伸侧出现红色斑块、溃疡5月余。皮损组织病理示:角化过度,表皮增生,真皮浅层及中层可见弥漫性以嗜中性粒细胞为主的混合炎性细胞浸润,伴红细胞渗出,真皮组织中存在真菌孢子及菌丝样结构。真菌种属鉴定示:甄氏外瓶霉。诊断:甄氏外瓶霉所致暗色丝孢霉病。伊曲康唑与特比萘芬口服联合治疗效果显著。     

病原性黑酵母的血清学试验研究

本研究采用血清凝集反应和外抗原试验的方法,对3种病原性黑酵母进行了初步试验.凝集反应结果表明皮炎万氏霉与外瓶霉属交叉效价在1:320以下,可彼此区分;甄氏外瓶霉与棘状外瓶霉之间尚无法区分;外抗原试验发现棘状外瓶霉与皮炎万氏霉有两种抗原成份且两菌之间存在一定交又反应,尚不能区别;甄氏外瓶霉仅有一种抗原成份且与前两菌不存在交叉反应,可供鉴别;3种黑酵母与裴氏着色霉和优状瓶霉之间未见交叉反应.     

皮炎外瓶霉临床和环境分离株对6种常用抗真菌药物的敏感性测定

目的 探讨临床分离的皮炎外瓶霉对6种常用抗真菌药物的敏感性。方法 参考美国临床实验室标准化研究所M27-A2方案测定特比萘芬（TRB）、伊曲康唑（ITC）、两性霉素B（AMB）、氟康唑（FLC）、伏立康唑（VRC）及卡泊芬净（CAS） 对16株皮炎外瓶霉的最低抑菌浓度（MIC）,同时以E-test法测定VRC、ITC和AMB对16株皮炎外瓶霉的MIC,并进一步测定每种药物的最低杀菌浓度（MFC）。在此基础上,观察TRB与ITC及VRC联合应用时对皮炎外瓶霉的抗菌作用。结果 微量液基稀释法测得TRB、VRC、ITC、AMB、FLC和CAS 对皮炎外瓶霉MIC范围分别为：0.125 ~ 0.25、0.25 ~ 0.5、2.0、2.0、16 ~ 32和16 ~ 64mg/L;TRB、VRC、ITC、AMB和FLC的MFC范围分别为：0.125 ~ 0.5、0.25 ~ 0.5、2.0 ~ 4.0、2.0 ~ 4.0和16 ~ 64 mg/L。E-test法测定VRC、ITC和AMB的MIC范围为：0.032 ~ 0.094、0.047 ~ 0.5和0.125 ~ 3.0 mg/L。TRB与ITC及VRC在体外联合应用对皮炎外瓶霉无协同效应。结论 皮炎外瓶霉在体外对TRB、ITC、AMB、VRC敏感,对FLC和CAS不敏感。     

甄氏外瓶霉所致暗色丝孢霉病1例

暗色丝孢霉病是一大组暗色条件致病性真菌引起的皮肤、皮下组织和系统性感染。皮肤暗色丝孢霉病在我国已有多篇报道，浙江地区尚未见报道，我们报道1例甄氏外瓶霉所致的皮肤暗色丝孢霉病。     

几种常见暗色致病真菌的耐热实验

观察并记录经37℃、45℃、55℃处理10、30、60min后裴氏着色真菌、紧密着色真菌、疣状瓶霉、卡氏枝孢霉、皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉、假阿利什菌、链格孢和孢子丝菌在沙氏培养基上的生长情况。所有受试菌种的菌悬液经37℃、45℃不同时间处理后再培养的生长情况未受影响；在55℃处理后除皮炎外瓶霉、链格孢外其余菌种在55℃不同时间处理后生长均受不同程度影响。可通过耐热试验来鉴别皮炎外瓶霉与甄氏外瓶霉；局部温热引起的局部血循环加速，血管扩张，局部细胞因子释放、各种效应细胞等可能也参与了对着色真菌及其它几种常见深部致病真菌的杀灭过程。     

以蛋白SDS-PAGE图谱为依据的致病性暗色丝孢科真菌系谱学研究

目的　研究对人类致病的主要暗色丝孢科真菌裴氏着色霉、紧密着色霉、疣状瓶霉、皮炎瓶霉、卡氏枝孢霉、甄氏外瓶霉间的系谱格局。方法　采用薄层扫描方法对上述6种30株重要致病性暗丝孢科真菌可溶性全细胞蛋白单向SDS PAGE图谱结合基型趋异方法进行分析。结果　得出其系谱格局为{ [P. verrucosa(F. pedrosoiF. compacta) ]W. dermatitidis[E. jeanselmeiC. carrionii] }。结论　显示(F. pedrosoi和F. compacta,E. jeanselmei和C. carrionii,以及Fonsecaea和Phialophora之间有密切关系。     

着色真菌蟾蜍分离株小鼠致病试验研究

目的：观察着色真菌蟾蜍分离株的致病性。方法：抽样取着色真菌蟾蜍分离株与标准人分离株对照，制成菌悬液，做小鼠腹腔接种，观察接种后小鼠的外观表现，做菌种逆培养和观察内脏病理变化。结果：蟾蜍分离株卡氏枝孢霉、疣状瓶霉、裴氏着色霉和甄氏外瓶霉与病人分离株一样，在接种28天后，均可从小鼠脏器逆培养出接种的菌种，并引起内脏病变，形成结核样肉芽肿，肉芽肿内均可查见棕黄色硬壳小体。而瓶霉和外瓶霉属菌种逆培养结果均阴性。结论：从野生蟾蜍分离出的卡氏枝孢霉、疣状瓶霉，裴氏着色霉和甄氏外瓶霉与病人分离株一样，对小鼠有致病性，故可能是人着色芽生菌病的致病菌。     

威尔尼克外瓶霉致右手掌黑癣

报告1例威尔尼克外瓶霉致掌黑癣。患者女,24岁。右手大鱼际淡褐色椭圆形斑块4年余,无不适。皮损鳞屑真菌镜检:10%KOH涂片可见浅棕色短菌丝及出芽孢子,美蓝涂片染色可见短菌丝及孢子。皮屑培养生长缓慢,初期为灰白色至橄榄色酵母样菌落,很快变为墨绿色至黑色菌落。菌落表面可见絮状、暗灰色至绿灰色气生菌丝。对培养菌株行土豆培养基小培养观察形态学符合威尔尼克外瓶霉,用扫描电镜观察其产孢方式为环痕产孢、合轴式排列方式,菌丝两侧及顶端有环痕梗,环孢子聚集在环痕梗周围。基因测序与标准菌株GQ334387.1(GI:254802560)威尔尼克外瓶霉具有100%同源性。诊断为掌黑癣。给予5%硝酸舍他康唑乳膏每日2次外用,连用2周后皮损完全消退。随访3个月未见复发。     

卡氏枝孢霉与阿耶罗枝孢瓶霉的随机扩增DNA多态性研究

研究卡氏枝孢霉与阿耶罗枝孢瓶霉的ＤＮＡ多态性，了解两菌在ＤＮＡ型别与形态学及菌种来源地域的相互关系。采用溴苯提取法提取ＤＮＡ，以随机扩增ＤＮＡ多态性方法对来自五个国家的２１株分离株（１９株卡氏枝孢霉，２株阿耶罗枝孢瓶霉）进行研究。结果：①１０个随机引物筛选出３个具有较好ＤＮＡ扩增的引物。②１９株卡氏枝孢霉的ＤＮＡ带型具有较大的遗传相似性，阿耶罗枝孢瓶霉的ＤＮＡ带型与卡氏枝孢霉略有不同，但与中国株具有较大相似性（８５％的遗传相似性）。③卡氏枝孢霉的遗传相似性与菌株的来源地域关系密切，同一国家的菌株具有相似的ＤＮＡ带型，位于树状图的同一树组中。结论：随机扩增ＤＮＡ多态性研究发现卡氏枝孢霉具有一定的种内差异，其ＤＮＡ带型与菌株的来源地域关系密切，阿耶罗枝孢瓶霉的ＤＮＡ带型与某些株卡氏枝孢霉更相似。本研究方法简便、快速，可用于流行病学及基因学特征的研究     

光动力疗法单用或联合抗真菌药物对游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡的影响

目的 探讨光动力疗法单用或联合抗真菌药物对游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡的作用。方法 制备皮炎外瓶霉游离态孢子悬液,用改良的96孔板法构建皮炎外瓶霉生物膜。将皮炎外瓶霉游离态孢子和生物膜分别分为单药组（只用抗真菌药物处理）、光动力组（只用光动力处理）和光动力联合药物组（先用光动力处理,再用抗真菌药物处理）,同时设立空白对照组（既不用抗真菌药物处理也不用光动力处理）,抗真菌药物包括两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑和伊曲康唑,药物浓度均为1 mg/L,处理时间均为2 h。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记（TUNEL）法进行凋亡检测。结果 抗真菌药及光动力疗法对游离态（均P < 0.001）及形成生物膜（均P < 0.05）的皮炎外瓶霉凋亡率均有影响。空白对照组和两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑单药组游离态皮炎外瓶霉凋亡率分别为11.67% ± 0.21%、13.30% ± 1.78%、14.30% ± 3.61%、14.51% ± 1.91%、36.17% ± 4.00%,其中伊曲康唑单药组凋亡率显著高于空白对照组（P < 0.05）,其他3个单药组与空白对照组差异均无统计学意义（均P > 0.05）。光动力组游离态孢子凋亡率（41.37% ± 7.80%）显著高于空白对照组（P < 0.05）。光动力联合两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑组的游离态孢子凋亡率分别为29.23% ± 6.71%、37.23% ± 10.86%、43.57% ± 6.42%、69.87% ± 3.53%）,其中联合伏立康唑、伊曲康唑组凋亡率显著高于相应单药组（均P < 0.05）。光动力组生物膜凋亡率（32.00% ± 0.43%）显著高于空白对照组（25.30% ± 1.31%,P < 0.05）,光动力联合两性霉素B组显著高于两性霉素B组（P < 0.05）。结论 光动力联合抗真菌药物能够明显促进游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉的凋亡。