mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达

目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSeetag2/seFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达.方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体psectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况.结果:将750 bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv.将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34 000.结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据.     

人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究

目的构建人OX40-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人OX40-Fc融合蛋白。方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX40膜外区cDNA编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，采用脂质体法稳定转染COS-7细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与Western blotting进行鉴定。检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性。结果测序证实构建的OX40膜外区与OX40-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实OX40-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与Western blotting证实其为OX40-Fc蛋白。增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用。结论成功构建了人OX40-Fc真核表达载体，并使有生物学活性的OX40-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达。为进一步研究该蛋白在自身免疫性疾病治疗中的作用及调节免疫自稳机制中的地位奠定了基础。     

小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用

目的:克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒, 初步探讨其表达产物sST2-Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响.方法:借助RT-PCR技术, 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA, 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体(psST2-Fc).应用脂质体将重组质粒psST2-Fc转染CHO细胞, 经G418筛选, 获得稳定表达sST2-Fc融合蛋白的CHO细胞株.细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后, 采用Western blot进行鉴定, 应用FACS检测sST2-Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况;ELISA法检测sST2-Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响.结果:测序证实克隆和构建的小鼠sST2-Fc cDNA阅读框序列正确, Western blot 证实sST2-Fc融合蛋白的表达, sST2-Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-6.结论:成功构建sST2-Fc融合基因并获得稳定表达, sST2-Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应.     

hBAFF-R-Fc融合分子的构建、表达与鉴定

目的 构建人hBAFF-R-Fc基因的真核表达质粒,并表达有生物学活性的人hBAFF-R-Fc融合蛋白.方法 化学合成法合成人hBAFF-R膜外区cDNA编码基因,酶切测序证实后,与hIgG4.Fc/Leu235Glu突变体一起导入线性化pSec/WG真核表达载体,阳性重组体酶切测序证实后,采用脂质体法稳定转染CHO细胞,用夹心ELISA检测其表达;收集的蛋白经蛋白A亲和纯化,以SDS-PAGE与Western blot进行鉴定并检测hBAFF-R-Fc的活性.结果 测序证实构建的hBAFF-R膜外区与hBAFF-R-Fc cDNA阅读框完整,EIJSA证实转染hBAFF-R-Fc基因的CHO细胞培养上清中含有hBAFF-R-Fc蛋白,SDS-PAGE与 Westernblot鉴定证实其为hBAFF-R-Fc蛋白.hBAFF-R-Fc蛋白对活化后的B细胞有抑制增殖的作用.结论 成功构建了人hBAFF-R-Fc真核表达载体,并使有生物学活性的hBAFF-R-Fc蛋白在CHO细胞上获得了稳定表达.为进一步研究该蛋白在狼疮性肾炎等自身免疫性疾病治疗中的作用奠定了基础.     

过表达人细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)促进MCF-7乳腺癌细胞生长及S期细胞增加

目的构建带FLAG标签的细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)基因真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2并检测其对MCF-7乳腺癌细胞生长及细胞周期的影响。方法采用反转录PCR从MDA-MB-231乳腺癌细胞中扩增Skp2基因,构建重组真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至MCF-7乳腺癌细胞中。采用Western blot法检测FLAG-Skp2的表达,Alamar blue比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果与Gen Bank结果一致。Western blot结果显示质粒转染48 h后,细胞成功表达融合蛋白FLAG-Skp2。过表达Skp2的MCF-7乳腺癌细胞较对照组生长速度明显加快,S期细胞显著增多。结论成功构建人Skp2真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2。过表达Skp2的MCF-7细胞生长加快,S期细胞增多。     

CR2-DAF和DAF-CR2靶向补体抑制物的构建、表达与鉴定

目的: 构建针对补体激活物的特异靶向补体抑制物, 并对其进行体外活性鉴定.方法: 将补体受体(CR2)与补体抑制物(促衰变因子, DAF)以融合表达方式(顺反结构)克隆到表达载体PBM中, 然后将重组体转移到CHO细胞中进行蛋白表达, 用SDS-PAGE、 Western blot、流式细胞术(FCM)检测、 SPR检测及补体介导的细胞溶解实验对表达的融合蛋白进行生物学活性鉴定.结果: SDS-PAGE和Western blot结果显示出现预期大小的目标片段.FCM与SPR检测结果显示, 重组蛋白CR2-DAF与DAF-CR2能特异地与C3包被的CHO细胞、 C3dg配基相结合.补体介导的细胞溶解实验结果显示, 靶向补体抑制物比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显(CR2-DAF的抑制效率高达20倍).结论: 成功构建了CR2-DAF和DAF-CR2靶向补体抑制物, 为下一步进行动物体内补体抑制实验奠定了基础.     

人组蛋白H3真核表达载体的构建及功能初步检测

目的构建带myc标签的人组蛋白H3基因真核表达载体,获得Myc-H3融合表达蛋白,并对其功能进行初步检测。方法采用PCR技术从乳腺文库中扩增人H3基因编码序列,将其正确插入pXJ-40-myc载体,重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western blot法检测融合蛋白表达,通过免疫共沉淀技术检测融合蛋白与已知结合蛋白组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶(LSD1)和组蛋白甲基转移酶(EZH2)的相互作用。结果构建得到组蛋白H3基因的真核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;经Western blot法检测,融合蛋白成功表达;免疫共沉淀检测证实Myc-H3融合蛋白可以和已知相互作用蛋白LSD1及EZH2相互作用。结论成功构建组蛋白H3真核表达载体,该融合蛋白正确表达。     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

人TRAM基因真核表达载体的构建

目的 构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法 首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果 菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论 基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

人sPD-1-Fc融合蛋白的构建及Cos-7细胞的表达

目的:构建重组人pSG5-Fc-hPD-1嵌合基因质粒,并在真核细胞进行表达,得到分泌性的sPD-1-Fc融合蛋白。为PD-1的生物学活性研究奠定基础。方法:从GenBank里查到人PD-1胞外区的基因序列,设计特异性引物,以人淋巴细胞cDNA为模板PCR扩增得到人PD-1胞外区片段。以pSG5-Fc真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pSG5-Fc-hPD-1。脂质体瞬时转染猴肾成纤维细胞(Cos-7),收取72 h的细胞上清。用Western blot鉴定,并与原核表达的人PD-L1蛋白免疫共沉淀检测生物学活性。结果:通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切及测序证实构建的重组质粒pSG5-Fc-hPD-1正确。重组质粒在Cos-7细胞中高效表达并分泌融合蛋白sPD-1-Fc到细胞上清,应用Western blot测定到上清中的融合蛋白,且得到的sPD-1-Fc融合蛋白具有与PD-L1结合的生物学活性。结论:通过基因重组方法在真核细胞里得到高效分泌型表达的sPD-1-Fc重组蛋白,为研究PD-1生物学活性奠定了实验基础。     

人Gal-9基因的克隆及在CHO细胞中的表达

目的:构建β-半乳糖苷结合凝集素-9(Gal-9)的真核表达载体,在CHO细胞中表达,并检测其表达。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Gal-9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGal-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测Gal-9的表达,MTT法检测Gal-9对同种异体淋巴细胞增殖的影响。结果:DNA测序和酶切鉴定证明Gal-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGal-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法,在分子和蛋白水平证实Gal-9的表达,MTT法检测显示,Gal-9明显抑制同种异体淋巴细胞增殖反应,平均抑制率达85.43%。结论:成功构建pGal-9的真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以成功表达,并抑制同种异体淋巴细胞增殖反应。     

结核分枝杆菌脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达及纯化

目的构建含结核分枝杆菌(MTB)脂蛋白G(Lpr G)基因的真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,并在HEK293T细胞中表达和纯化Lpr G融合蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,用PCR法扩增Lpr G基因,并通过DNA重组构建真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,酶切鉴定并测序。将重组质粒转染HEK293T细胞后,应用Western blot法检测His-Lpr G-FLAG融合蛋白的表达。利用Ni-NTA金属亲和层析柱从细胞上清和细胞裂解液中纯化融合蛋白His-Lpr G-FLAG,并用SDS-PAGE和Western blot法检测纯化后的蛋白。结果成功构建了pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG的真核表达载体,Western blot结果表明转染质粒后,HEK293T细胞裂解液中检测到目的蛋白,相对分子量(Mr)为27 000。经Ni-NTA金属亲和层析柱纯化后得到高纯度的融合蛋白His-Lpr G-FLAG。结论成功构建并在HEK293T细胞中表达和纯化了His-Lpr G-FLAG融合蛋白。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

大鼠重组骨桥蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达和纯化

目的 构建包含大鼠骨桥蛋白(OPN)的真核表达载体,获得稳定表达重组蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对蛋白进行纯化,为OPN在大鼠模型实验中的进一步功能学研究奠定基础.方法 通过脂质体lipofectamine 2000将重组质粒pLVX-OPN转染到CHO细胞中,嘌呤霉素筛选出稳定克隆细胞.Real-time PCR法检测转染后CHO细胞中OPN的mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测上清中OPN分泌水平.取CHO细胞72 h无血清培养上清进行镍柱亲和层析纯化,ELISA法和Western blot法分别检测产量和纯度.结果 pLVX-OPN表达载体经DNA琼脂糖电泳鉴定为阳性,且质粒测序成功.经质粒pLVX-OPN转染的CHO细胞中OPN mRNA表达水平是转染前的上千倍,上清分泌蛋白水平较转染前增加.上清分泌的OPN蛋白通过镍柱亲和层析纯化后纯度有所提高,产量在30％以上.结论 pLVX-OPN真核表达载体的成功构建和在CHO细胞中的稳定表达及纯化为OPN的功能学研究提供了有效工具.     

EGFP-Sam68融合蛋白在HeLa细胞的表达和定位

目的克隆有丝分裂Src相关蛋白p68(Sam68)基因cDNA全长,构建Sam68真核绿色荧光蛋白表达载体,并确定其在HeLa中的表达和定位。方法提取HeLa细胞总RNA,RT-PCR扩增Sam68基因片段,经酶切鉴定及测序正确后,克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pcDNA3.0-EGFP)上,并转染HeLa细胞,Western blot法检测Sam68表达,免疫荧光细胞化学染色观察其细胞定位。结果酶切和测序证实Sam68正确插入pcDNA3.0-EGFP载体中,且载体正确表达了EGFP-Sam68融合蛋白,该蛋白定位在HeLa细胞核内。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-EGFP-Sam68。     

小鼠趋化因子COL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列，经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3．1-CCL19Ig，酶切和测序鉴定插入序列；将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达，通过RT—PCR、Western blot鉴定目的基因的表达，利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgGI Fc段序列，其序列分别与GenBank中公布序列比对一致，IgG1-Fc段读码框未发生改变；Western blot结果证实转染了pcDNA3．1-mCEL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38000的融合蛋白mCCL19Ig表达；体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性，且呈剂量依耐关系。