人类肥胖相关新基因LYRM1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗人LYRM1蛋白的多克隆抗体并对其进行初步鉴定。方法:预测LYRM1蛋白的抗原表位,设计并合成出一段由17个氨基酸组成的多肽,将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备抗LYRM1蛋白的多克隆抗体,利用ELISA、Westernblot鉴定其效价及特异性,并将该抗体用于人脂肪组织LYRM1的表达检测。结果:制备了兔抗人LYRM1蛋白的多克隆抗体并证实此抗体效价较高、特异性较强。结论:采用人工合成多肽作为半抗原成功制备了人类肥胖相关新基因LYRM1的多克隆抗体。     

兔抗mLAIR-1胞外区抗体的制备、纯化和鉴定

目的:表达并纯化小鼠白细胞相关免疫球蛋白样受体-1(mLAIR-1)胞膜外区与人IgGFc段的融合蛋白,制备兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体。方法:构建真核表达载体,表达并纯化mLAIR-1-Fc融合蛋白。以mLAIR-1-Fc融合蛋白免疫家兔,用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化多克隆抗体。用间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定多克隆抗体的特异性。结果:表达并纯化了mLAIR-1-hIgFc融合蛋白。以其免疫家兔,用亲和层析的方法纯化得到兔抗mLAIR-1胞膜外区的抗体,能与转染细胞和细胞表面天然mLAIR-1分子结合。结论:成功地构建了mLAIR-1胞膜外区基因的真核表达载体,表达并纯化了mLAIR-1-Fc融合蛋白。用偶联mLAIR-1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化的兔抗mLAIR-1胞外区抗体,具有高特异性和高效价,为进一步研究mLAIR-1分子的结构和功能提供了新的手段。     

柯萨奇病毒B 组5 型VP1 蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用His Trap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别。结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90%。ELISA测得抗体的效价为1∶128 000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原。结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具。     

Trim22 B细胞表位预测及多克隆抗体制备与鉴定

目的:预测人Trim22的B细胞抗原表位,制备并鉴定其多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件分析Trim22的氨基酸序列,确定抗原表位并人工合成多肽。将合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联,免疫大白兔制备抗Trim22的抗体。经饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并对抗体进行ELISA、Western blot鉴定。结果:获得抗Trim22的多克隆抗体,抗体效价为1∶16 000,该抗体能特异性地识别包含(382～397)区段的Trim22缺失突变体,同时该抗体不能识别Trim22旁系同源分子Trim5α、Trim6和Trim34α。结论:采用人工合成多肽作为半抗原制备出抗Trim22的多克隆抗体,对研究内源性Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用机制具有重要价值。     

新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位分析及抗体制备

目的：分析一个新的人突触相关蛋白(FRCA)抗原表位并制备其多克隆抗体。方法：从人胎肝文库PCR扩增获得FRCA基因全长cDNA序列；通过生物信息学分析，预测FRG4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域，并进行了多序列比对；采用固相多肽合成法合成了FRCA抗原多肽，并免疫家兔；用免疫组化检测蛋白在人肝癌细胞HepG2细胞中的表达。结果：通过生物信息学分析选取抗原13肽PKLVKEEVFWRNY，制备兔抗人FRCA多克隆抗体。高效液相色谱检测显示抗体纯度达82．79％，抗体滴度为1：16000，Western blot证实该抗体具有较好的反应性和特异性，免疫组化证实其主要在HepG2细胞胞浆中表达。结论：成功制备了新的人突触相关蛋白(FRCA)多克隆抗体。     

人LC3蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其抗体的制备与鉴定

目的:制备兔抗人LC3的多克隆抗体,为细胞自噬的研究提供有用的检测工具。方法:构建pET32a(+)LC3的原核细胞表达载体并进行序列鉴定,大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达LC3蛋白,SP-Sepharose XL柱纯化;纯化的人LC3蛋白免疫兔制备抗血清,通过LC3蛋白偶联的Sepharose 4B(LC3-Sepharose 4B)亲和层析纯化兔抗人LC3的多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot鉴定其特异性。结果:成功实现了LC3蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化,并用质谱分析证明表达蛋白相对分子质量(Mr)为15 500。制备的兔抗人LC3多克隆抗体具有很高的特异性,与大肠杆菌成分无交叉反应。Western blot能够特异检测自噬过程中LC3Ⅰ型和Ⅱ型蛋白,观察到自噬发生时LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化。结论:获得了重组人LC3蛋白,成功地制备了该分子的特异性多克隆抗体,为细胞自噬的检测提供了有用的探针。     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

鼠Mincle蛋白B细胞抗原表位预测及多克隆抗体制备

目的预测鼠Mincle蛋白的B细胞抗原表位及制备其多克隆抗体。方法以鼠Mincle蛋白氨基酸序列为基础,利用signalP3.0和TMHMM Server在线软件分析其信号肽和跨膜结构,利用DNAstar软件预测其二级结构、蛋白骨架区的柔韧性、亲水性、表面可能性及表面抗原性指数;融合表达PET30a(+)/Mincle蛋白并通过镍层析柱纯化后,免疫兔获得Mincle多克隆抗体。结果 Mincel蛋白是一种跨膜蛋白质,N末端第1-22号氨基酸可能位于蛋白的表面并可能为抗原表位;成功构建了重组载体PET30a(+)/Mincle,转化大肠杆菌BL21后表达包涵体融合蛋白,利用镍亲和层析得到了无生物活性的高纯度重组蛋白,纯化蛋白免疫兔,制备了滴度达1:128 000的多克隆抗体;Western-blot检测显示抗体特异性高。结论 Mincle蛋白N端即胞外区的第1-22氨基酸可作为Mincle蛋白的主要抗原表位区以制备Mincle多克隆抗体。     

人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高灵敏度和高特异性的人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白抗体并对其效价进行初步评估.方法 构建含有H5N1亚型禽流感病毒NS1序列的pET-28a(+)重组载体的大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达NS1蛋白,并经Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得NS1重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定.以纯化的蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗NS1血清,亲和纯化获得多克隆抗体.应用ELISA和Western Blot检测纯化抗体的效价和特异性.结果 NS1融合蛋白得到高表达,且纯度＞90％,用该融合蛋白免疫新西兰大白兔后得到的抗NS1多克隆抗体,效价达1∶80 000,并特异性识别H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白.结论 获得了NS1多克隆抗体,具有较好的效价和特异性.     

釉成熟蛋白多肽多克隆抗体的制备和应用

目的制备兔抗鼠釉成熟蛋白(amelotin)的多克隆抗体并进行鉴定和应用。方法对amelotin的蛋白质序列进行分析,选取一段氨基酸序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联免疫新西兰大白兔,制备多肽抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法分析抗体特异性。免疫组织化学技术观察amelotin在小鼠下颌组织的表达情况。结果制备的兔抗amelotin抗体效价为1∶1 000 000,特异性高。免疫组织化学染色结果显示amelotin在3、7 d小鼠的磨牙釉质全层有强表达,并且在7 d小鼠下颌下腺的导管上皮细胞质中也有表达。结论成功制备了效价高、特异性好的兔抗amelotin抗体。     

人高迁移率族B1的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的以原核表达的人高迁移率族B1(High mobihty group box 1,HMGB1)蛋白为免疫原免疫日本大耳白兔,制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法将人HMGB1 cDNA克隆于原核表达载体pQE-80L并转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导HMGB1表达,Ni^2 -NTA层析纯化后,用其免疫兔。以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性。结果成功表达并纯化了人HMGB1蛋白,纯化后纯度可达96％;ELISA法测定抗体效价为1：25600;Western blot结果显示所制备的抗体可特异性与人HMGB1蛋白结合。结论成功制备了兔抗人HMGB1多克隆抗体,为进一步研究HMGB1与相关疾病的关系打下了基础。     

人心肌红蛋白多肽单抗原表位基因的克隆、原核表达及抗体制备

目的本研究以原核表达单抗原表位的人心肌红蛋白(MB)肽段,制备不同表位的多克隆抗体。方法利用软件分析人心肌红蛋白的抗原表位,获得4个肽段(片段1、2、3、4);PCR扩增其基因序列,连接到表达载体p ET-GST,转化至E.coli BL21进行诱导表达。结果 GST-Sepharose 4B亲和层析柱进行MB-GST融合蛋白纯化,获得Mr28 000左右的融合蛋白,质量浓度为15 mg/L。免疫新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体。结论 4种多肽抗体均具有较好的特异性。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定北大核心CSCD

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备小鼠抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b的多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法:合成H1b特异性多肽,以匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏小鼠,制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价,通过Western blot和免疫组织化学检测,鉴定抗体的特异性与适用范围.结果:得到小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,效价达1:105.纯化后的抗体用于Western blot可高特异性识别真核表达的H1b蛋白,并可用于免疫组织化学实验.结论:成功制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,该抗体具有较高的效价以及特异性,能区分ASG-PR大亚基的两种剪接异构体,从而为进一步研究H1b蛋白的生理功能及其在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

生殖支原体粘附素蛋白MgPa的表达及其多克隆抗体的制备与纯化

目的:制备并纯化生殖支原体(Mg)粘附素蛋白(MgPa)的多克隆抗体,为进一步探讨MgPa的生物学功能及其在Mg的临床诊断与预防方面的应用提供实验基础。方法:构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达生殖支原体粘附素蛋白(rMgPa′),重组蛋白经Western blot鉴定后用Ni-NAT亲和层析柱纯化,然后免疫新西兰兔以制备兔抗rMgPa′血清。用饱和硫酸铵法和溴化氰活化的琼脂糖4B亲和层析柱纯化多克隆抗体,并经Western blot鉴定免疫血清的特异性,用间接ELISA法检测免疫血清的效价。结果:在大肠杆菌中成功表达一分子量约为37kD的6×His-rMgPa′融合蛋白,免疫新西兰兔后获得了相应的多克隆抗体,利用饱和硫酸铵法和亲和层析法纯化后得到具有较高纯度的多克隆抗体,SDS-PAGE分析的结果表明所制备的多克隆抗体分子量约为150kD,Western blot结果表明制备的抗体具有较高的特异性,ELISA结果显示抗体的效价为1∶25600。结论:成功制备了高效价、高特异性的兔抗rMgPa′的多克隆抗体,为进一步研究MgPa的生物学功能、Mg的临床诊断与预防提供了重要的实验基础。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

S100A10蛋白的表达及其抗体的制备

目的制备S100A10蛋白及其特异性抗体。方法用PCR扩增编码S100A10的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的蛋白产物经镍柱亲和层析纯化后,作为抗原皮内接种免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体,分别以ELISA,Western blot法检测抗体的滴度和抗原特异性。结果成功构建原核表达载体pET28a(+)-(S100A10)2,得到纯化的(S100A10)2蛋白,制备的多抗具有较高的抗体滴度和抗原特异性。结论建立了S100A10原核表达及纯化系统,成功制备了S100A10的多克隆抗体,为S100A10的进一步研究提供了工具。     

β-Netrin抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定

目的:制备抗神经细胞突起生长诱向因子(β-Netrin)的多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:应用GoldKey软件分析人βNetrinC末端结构域氨基酸的序列(共114个氨基酸),确定抗原表位并人工合成多肽。然后采用碳化二亚胺法,将合成肽与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联作为抗原,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行HAT选择培养,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞并克隆化。对分泌的mAb的效价、Ig亚类(型)及特异性,分别用间接ELISA和Westernblot进行鉴定。同时,通过免疫细胞化学染色鉴定抗体的特异性。另外,以偶联的分子免疫新西兰白兔,制备抗β-Netrin的pAb,用Westernblot鉴定其特异性。结果:以确定的此16个氨基酸的序列NH2-FRGKRT-LYPESWTDRG-COOH作为抗原表位,以人工合成多肽与BSA偶联作为免疫原,获得3株可稳定分泌特异性抗β-Netrin mAb的杂交瘤细胞。免疫细胞化学染色结果表明,这3株抗体均能特异性地识别细胞中的抗原。另外,制备了高效价的抗β-Netrin的pAb,并能特异性地识别原核表达的β-Netrin蛋白。结论:采用人工合成多肽作为半抗原成功地制备出抗β-Netrin的pAb和mAb。     

小鼠几丁质酶的重组表达和抗体制备

目的: 检测脂多糖(LPS)刺激成骨细胞后, 几丁质酶(chitotriosidase)基因表达变化情况.进行小鼠chitotriosidase的原核和真核表达, 并利用原核表达纯化的蛋白, 制备兔抗鼠多克隆抗体.方法: 用LPS刺激MC3T3-E1细胞, 提取mRNA, 通过RT-PCR获得小鼠chitotriosidase的编码区全长序列, 克隆进pRSET A载体, 转化BL21菌株, IPTG诱导表达.获得的包涵体蛋白用镍柱纯化后, 作为抗原免疫兔子, 制备多克隆抗体.用该抗体检测真核表达的小鼠chitotriosidase蛋白, 并确定抗体的灵敏度和特异性.结果: LPS明显刺激chitotriosidase表达.原核表达的包涵体蛋白经镍柱纯化后也能制备出效果较好的多克隆抗体.结论: 成功地克隆表达了小鼠的chitotriosidase蛋白, 并制备出高灵敏度、高特异性的多克隆抗体, 为进一步阐明chitotriosidase在病理条件下的表达变化和功能提供了一条途径.