人补体受体2-Fc融合蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人补体受体2(CR2)-Fc融合蛋白基因表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人CR2-Fc蛋白。方法将人CR2片段和IgG1 Fc片段进行连接,克隆入PCI-neo表达载体。脂质体法将测序正确的重组真核表达载体转染CHO K1细胞进行蛋白表达,采用SDS-PAGE、Western blot法对蛋白表达进行检测和鉴定。结果利用双酶切及基因测序结果证实CR2-Fc基因序列正确,重组真核表达载体构建成功;SDS-PAGE检测纯化产物的相对分子质量(M r)与预期结果一致,Western blot法在同样位置检出条带。结论成功构建了CR2-Fc重组真核表达载体,获得了有活性的融合蛋白。     

携带外源基因的rAAV-2在人树突状细胞中的稳定表达

目的:观察2型重组腺相关病毒(rAAV-2)载体介导外源基因对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的感染效能。方法:采用激光共聚焦显微镜观察FITC标记的rAAV-2进入DC的过程;用不同的感染复数(MOI)的rAAV-2-Luc和rAAV-2-GFP感染新分离的DC,荧光素酶(Luc)检测试剂盒检测Luc的表达和流式细胞术(FACS)检测GFP表达细胞的百分率。结果:加入rAAV-2后80分钟就可见病毒吸附在DC膜上,至90分钟可完全进入细胞内;MOI为1×104vp/cell时就可检测到Luc的表达,并呈现出随着MOI的加大而提高的趋势,自MOI为5×105vp/cell起,再提高MOI值并不能明显增加luc的表达;rAAV-2介导外源基因感染DC 48小时后就可检测到表达,从96~240小时表达水平无明显变化;GFP的表达率为5~18%。结论:rAAV-2介导外源基因能有效感染DC,感染的DC可稳定表达外源基因,rAAV-2载体体外遗传修饰的DC可以进一步用于ex vivo途径的免疫治疗研究。     

人AITRL胞外区基因克隆表达及重组蛋白生物活性分析

目的:获得重组人活化诱导的肿瘤坏死因子超家族配体胞外区蛋白(sAITRL),分析AITRL蛋白的生物学功能.方法:从全长质粒AITRL-pMD18-T中扩增sAITRL cDNA,亚克隆至表达载体pQE30;将重组质粒转化至 E. coli M15,IPTG诱导蛋白表达;表达蛋白用Ni2 -IMAC柱纯化、复性并Western blot鉴定,流式细胞仪检测sAITRL重组蛋白的结合活性,增殖试验分析sAITRL的生物学活性.结果:成功构建了sAITRL-pQE30原核表达载体;表达相对分子质量约15 KD的重组蛋白;sAITRL能与活化淋巴细胞上的天然受体AITR结合,低浓度的sAITRL能促进淋巴细胞的增殖,而在高浓度下则抑制了淋巴细胞的增殖.结论:成功表达了具有生物学活性的sAITRL重组蛋白,AITR-AITRL相互作用在调节淋巴细胞增殖过程中起重要作用.     

人源受体相关蛋白的原核表达及功能检测

目的研究人源受体相关蛋白(RAP)的表达并鉴定表达产物的功能。方法用IPTG诱导培养含有人源RAP重组表达载体(pET-28 a( )-RAP)的BL21转化菌,利用融合蛋白中6个组氨酸纯化标签,经N i -NTA树脂亲和层析、SDS-PAGE分离鉴定表达产物,并经脱盐、浓缩、冻干处理获得RAP融合蛋白冻干品。将RAP融合蛋白与富含LDLR家族受体的巨噬细胞进行结合实验,分析RAP融合蛋白的功能。结果经亲和层析分离纯化后获得可溶性表达的RAP融合蛋白。实验显示,表达的RAP融合蛋白可竞争性抑制VLDL与巨噬细胞的结合。结论实验获得的RAP融合蛋白具有正常的结合活性,可用于相关研究,为RAP蛋白生产开发奠定了良好的基础。     

人sPD-1-Fc融合蛋白的构建及Cos-7细胞的表达

目的:构建重组人pSG5-Fc-hPD-1嵌合基因质粒,并在真核细胞进行表达,得到分泌性的sPD-1-Fc融合蛋白。为PD-1的生物学活性研究奠定基础。方法:从GenBank里查到人PD-1胞外区的基因序列,设计特异性引物,以人淋巴细胞cDNA为模板PCR扩增得到人PD-1胞外区片段。以pSG5-Fc真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pSG5-Fc-hPD-1。脂质体瞬时转染猴肾成纤维细胞(Cos-7),收取72 h的细胞上清。用Western blot鉴定,并与原核表达的人PD-L1蛋白免疫共沉淀检测生物学活性。结果:通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切及测序证实构建的重组质粒pSG5-Fc-hPD-1正确。重组质粒在Cos-7细胞中高效表达并分泌融合蛋白sPD-1-Fc到细胞上清,应用Western blot测定到上清中的融合蛋白,且得到的sPD-1-Fc融合蛋白具有与PD-L1结合的生物学活性。结论:通过基因重组方法在真核细胞里得到高效分泌型表达的sPD-1-Fc重组蛋白,为研究PD-1生物学活性奠定了实验基础。     

大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体的构建、制备及表达

目的检测大鼠CTLA4-FasL重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利用Flag标签纯化目的蛋白,ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果获得含有大鼠CTLA4-FasL融合基因的重组腺相关病毒,感染炎性成纤维样滑膜细胞后能够分泌性表达目的蛋白。结论构建并制备的CTLA4-FasL重组腺相关病毒能够有效感染炎性成纤维样滑膜细胞并促使期表达CTLA4-FasL融合蛋白,为今后关节炎治疗的体内实验研究奠定了基础。     

CTLA4-Ig重组腺相关病毒载体的构建及转染表达效果

重组腺相关病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)载体是目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一。本研究通过构建CTLA4 Ig基因重组腺相关病毒载体 (rAAV CTLA4 Ig) ,研究其对大鼠转染的表达效果及规律。大肠杆菌Sure 2和 2 93细胞均由武汉同济医院心血管内科研究室提供 ;质粒pUF1 CTLA4 Ig、pXX2和pXX6由美国匹兹堡大学分子生物实验室XiaoX教授提供 ;近交系Lewis大鼠 ,2 0 0～ 2 5 0g,雄性 ,购自中国医学科学院实验动物研究所。仓鼠抗小鼠的CTLA4 Ig购自Pharm ingen公司 ,辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG购自Vec…     

重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性.方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性.结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104 IU/mg.结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当.为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础.     

Complexin-1/2过表达重组载体对阿尔茨海默病小鼠记忆损伤的实验研究

目的　构建Complexin-1/2（CPLX-1/2）基因的重组腺相关病毒过表达载体pAAV- CPLX-1/2并研究其在阿尔茨海默病记忆损伤中的作用。 方法　将用Oligo 7软件对Genbank上小鼠CPLX-1/2 mRNA的CDS两端序列进行分析,合成CPLX-1/2基因,构建过表达载体并转化至大肠杆菌Top10;选取正确的克隆进行PCR和测序鉴定。重组腺相关病毒载体测序正确后,转染AAV293细胞,包装腺相关病毒。将重组腺相关病毒经脑立体定位注射到三转基因阿尔茨海默病(3XTg-AD)小鼠海马CA3区,经免疫组化和Western-Blot检测CPLX-1/2蛋白表达情况,水迷宫检测CPLX-1/2过表达对3XTg-AD小鼠记忆的影响。 结果　PCR及测序结果表明成功构建了含小鼠CPLX-1/2基因的重组腺相关病毒表达载体。CPLX-1/2在海马CA3表达显著增加。CPLX-1/2过表达显著改善3XTg-AD小鼠的记忆损伤。 结论　本研究成功构建了CPLX-1/2重组腺相关病毒过表达载体并在整体动物水平成功高效表达; CPLX-1/2过表达可显著改善3XTg-AD小鼠空间记忆的损伤。为在整体动物水平深入研究CPLX-1/2的功能提供了新的手段;研究结果提示CPLX-1/2可能作为AD记忆损伤治疗的关键靶点。     

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的:设计构建融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒表达载体。方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片段,通过连接pGEM-T-Easy载体及PBV220-NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因,连接腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV,采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK-293细胞获取重组腺相关病毒,Dot-blot法测定重组病毒滴度,MTT比色法观察重组腺相关病毒对A549细胞存活率的影响。结果:合成Ant-Shepherdin[79-87]基因,连接PBV220-NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因;得到高滴度的(3.4×1013pfu/L)重组腺相关病毒表达载体;带有融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒对A549细胞具有强烈的诱导凋亡作用。结论:成功构建了NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组腺相关病毒表达载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。     

人CD28-Fc融合蛋白在真核细胞中的表达与纯化

目的建立稳定表达CD28-Ig融合蛋白系统,提供用于研究的CD28-Ig融合蛋白。方法构建高表达的真核细胞表达载体,利用FAD批准的、可用于生产人用重组蛋白药物的CHO细胞进行表达,MTX加压筛选出稳定表达的细胞株。蛋白A纯化获得电泳纯融合蛋白。结果经RT-PCR,SDS-PAGE及Western印迹鉴定,CHO细胞上清中纯化的蛋白是CD28与Ⅰg的融合蛋白,并获得纯度较高的融合蛋白。结论成功建立CD28-Ig融合蛋白表达体系,并获得稳定表达融合蛋白的细胞株,为T细胞活化第二信号系统的基础研究奠定了基础。     

小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白生物信息学分析

目的获取小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)氨基酸序列,并预测其结构和功能。方法利用网络平台及相关生物学软件对小鼠GITR氨基酸序列进行生物信息学分析。结果小鼠GITR氨基酸序列与人等其他物种具有56%的同源性,具有信号肽、胞外区、跨膜区及胞内区等结构;小鼠GITR蛋白胞外区位于第22~153号氨基酸序列区间;可能含有4个N-糖基化位点、4个丝氨酸磷酸化位点、1个苏氨酸磷酸化位点以及1个酪氨酸磷酸化位点。结论小鼠GITR氨基酸序列的生物信息学分析为进一步表达该蛋白及其相关功能研究奠定了基础。     

人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测

目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。     

人肿瘤坏死因子受体的研究进展

肿瘤坏死因子(TNF)是重要的免疫调节因子,其多种生物学功能均通过与肿瘤坏死因子受体(TNFR)相互作用而介导,现已确定的人TNFR有两类,即P55和P75,其结构均由信号肽、胞外结构区、跨膜结构区和胞浆结构区组成.本文从人TNFR的细胞分布、分子结构、与TNF结合蛋白的关系、信号传导及表达调控诸方面作一综述,并介绍了TNFR研究中有待解决的一些问题.     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的表达及免疫性鉴定

水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白中糖蛋白E(gE)的免疫活性最强,本试验成功构建了VZV糖蛋白E的原核表达载体,所表达的重组蛋白可以有效激活小鼠的免疫反应。1方法构建表达融合蛋白的重组原核表达载体pGEX-VgE,然后用IPTG在大肠埃希菌中诱导表达。经过亲和层析柱纯化后,得到VZV糖蛋     

人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析

目的 在大肠杆菌中表达抗入ＴＮＦ－α单链抗体（ＳｃＦｖ）,并分析它的结合活性和中和活性。方法 在获得抗人ＴＮＦ－αＥＳｃＦｖ基因的基础上,用热诱导载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中表达Ｅ６ＳｃＦｖ蛋白。ＥＬＩＳＡ测定抗体的结合活性,实时ＢＩＡ技术确定亲和常数。Ｌ９２９细胞毒试验分析其中和活性。结果 克隆了抗人ＴＮＦ－αＥ６ＳｃＦｖ基因的热诱导载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中,经４２℃热诱导,得到了相对分子质     

肿瘤坏死因子的结构及生物活性

1975年Carswall等在经内毒素处理BCG致敏家兔和小鼠的血浆中发现一种胞毒性因子,这种因子可引起小鼠移植的Math A肉瘤出血性坏死。由于这种因子的胞毒作用只选择性作用于肿瘤细胞,而无损于正常细胞的生物学功能,因此被命名为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)。目前对TNF的分子结构、理化性质及生物学活性等已有初步了解,并已建立了TNF编码的基因克隆和进行体外合成TNF。TNF的分子结构及生物学特性的研究证明TNF是一种与干扰素、淋巴毒素、巨噬细胞分泌的细胞毒性因子在生物学特性方面完全不同的另一类细胞毒素。它的功能主要在于:特异性地抑制肿瘤细胞增殖、杀灭肿瘤细胞,它与干扰素有协同抗癌作用,而不影响正常细胞的生长、分化和代谢功能。因此,研究TNF的分     

人肝细胞生长因子α原核表达体系的构建及表达

人肝细胞生长因子(humanhepato cytegrowthfactor,hHGF)由α和β链组成,为进一步研究hHGFα的生物学功能,我们采用转录前加工修饰方法,构建了hHGFα原核表达体系。根据人HGF全长基因序列设计引物,上游5′ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA 3′;下游5′ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTGTTTCG 3′。以含有hHGFcDNA全序列的质粒pRC/CMV hHGF为模板扩增全长1340bp的hHGFαcDNA ,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后,回收纯化目的条带,以XhoⅠ切为386和95 4bp 2个片段,再分别用EcoRⅠ和BamHⅠ消化后亚克隆入载体pBS…     

人γ—干扰素／β肿瘤坏死因子融合蛋白原核细胞高效表达研究

利用ＤＮＡ重组技术，在构建人γ干扰素突变体表达质粒，取得高效表达的基础上，再将人β肿瘤坏死因子的ＤＮＡ片段亚克隆到该质粒外源编码序的３’端，构建成人γ干扰素／β肿瘤坏死因子融合蛋白的重组有达质粒。