抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的 :制备抗禽流感病毒 (AIV)H9亚型血凝素蛋白的单克隆抗体 (mAb)。方法 :以AIVH9亚型油乳剂灭活疫苗作为免疫原 ,免疫 8wk龄BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb ;采用ELISA和血凝抑制试验(HI)检测腹水mAb的效价 ;采用ELISA、HI、免疫荧光染色 (IF)及Westernblot鉴定mAb的特异性。结果 :获得 3株可稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株 2A3、2H1和 1C8,其腹水mAb的ELISA效价依次为 1× 10 7、1× 10 5和 5× 10 6,血凝抑制效价为 1× 2 8～ 1× 2 13 ;3株mAb的Ig亚类均为IgG1。以mAb 2H1进行Westernblot的结果显示 ,该mAb能与AIV的Mr 为 75 0 0 0的蛋白条带起反应 ,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb。与 32株AIVH9亚型国内分离株进行血凝抑制试验表明 ,mAb 2H1具有良好的广谱性。结论 :成功地制备了抗AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb ,为AIV的抗原性分析、血清学诊断、疫苗质量的监测及流行病学调查等奠定了基础     

禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的研制和初步应用

目的：获得特异针对禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体。方法：以H9N2亚型病毒制成疫苗免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与SP2／0细胞融合，取细胞上清用HI筛选。结果：共获得9株稳定分泌针对血凝素蛋白抗体的杂交瘤细胞；经广谱性和特异性鉴定，所有单抗株均能与所有检测的82株不同年代不同地方不同禽源H9亚型流感病毒大部分分离株反应，且所有单抗株均不与非AIV-H9病毒反应，而其中一株（8E6）能与所有检测的H9亚型病毒株反应。进行Western blot分析显示，其中8株单抗能与AIV的Mr为75000处反应，表明是针对AIVH9HA的单抗。结论：本试验获得9株广谱性特异性很好的单抗，特别是8E6株；这些单抗株为以后作病毒抗原性位点分析、临床检测和流行病学调查提供了良好试剂。     

抗禽流感病毒H7亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制

目的:研制禽流感病毒H7亚型血凝素特异性单克隆抗体(mAb)。方法:以H7亚型禽流感诊断抗原为免疫原免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14进行融合。通过HA和HI试验筛选阳性克隆。应用HI试验和Western blot试验测定mAb的反应性和特异性。结果:共获得4株分泌抗AIVH7亚型HAmAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为2E2、2A4、5F5、7G5。这些mAb的腹水HI效价在5×27～5×211之间,其中2E2属于IgM亚类,2A4属于IgG1亚类,5F5、7G5属于IgG2a亚类。Western blot分析结果显示,4株AIVH7亚型HAmAb能与AIVH7蛋白在Mr75000处反应,但不与新城疫病毒(NDV)蛋白发生反应,表明这些mAb能特异性识别AIVH7亚型HA。mAbHI反应性测定结果表明:4株mAb中,2E2、5F5、7G5只与H7亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、传染性支气管炎病毒(IBV)反应,显示出良好的特异性;而2A4除了与H7亚型AIV反应外,还与H15N8标准株发生低水平交叉反应。结论:这些mAb不仅为H7亚型AIV的HA结构分析提供了工具,而且为建立快速廉价的H7亚型禽流感诊断方法提供了核心试剂。     

采用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感疫苗株

目的构建重组H5亚型禽流感疫苗株。方法采用RT-PCR技术，分别扩增鹅源高产禽流感病毒A／Goose／Dalian／3／01（H9N2）的6条内部基因片段、高致病性禽流感病毒株A／Goose／HLJ／QFY／04（H5N1）的血凝素（HA）基因和N3亚型参考株A／Duck／Germany／1215／73（H2N3）的神经氨酸酶（NA）基因，并对HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸（R-R-R-K-K）的编码序列进行缺失与修饰，然后分别构建这8个基因的转录与表达载体，将其共转染293T／MDCK混合培养细胞单层，对拯救出的重组病毒进行表型分析。结果利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽流感病毒的疫苗株，其基因序列符合设计要求包括删除HA基因的毒力相关序列，疫苗株的表型为H5N3。结论构建成功重组禽流感疫苗株rH5N3，为制备H5亚型禽流感疫苗打下了坚实的基础。     

禽流感H5亚型压电免疫芯片的研究

目的研究一种新型、快速的检测禽流感H5亚型的压电免疫芯片。方法以AT切型、基频10MHz的石英晶体为材料,设计四通道芯片微阵列。采用聚乙烯亚胺黏附一戊二醛交联法将禽流感H5亚型单克隆抗体固定在石英晶体的金膜电极表面制备生物敏感膜,构建可用于检测禽流感H5亚型的压电免疫芯片。结果固定H5单克隆抗体的最佳稀释度为1：10,H5亚型抗原溶液的响应值与空白对照的噪声值之比大于2。结论本次实验构建的压电蛋白芯片可用于禽流感H5亚型的定性检测。     

整合深圳人源H5N1禽流感病毒株血凝素蛋白的假型逆转录病毒的构建

目的 构建整合深圳人源H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)株血凝素(HA)的假型逆转录病毒.方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增深圳人源H5N1禽流感病毒株HA基因,将扩增产物与pGEM-T载体连接,在经过酶切及测序鉴定后,通过Sal Ⅰ与BamHⅠ酶切位点将HA基因克隆至真核表达载体CMV/R,然后协同转移载体pHR-Luc、包装载体pCMV&8.2通过磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(293T),72 h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达,同时测定HIV-HA假病毒对犬肾传代细胞(MDCK)、宫颈癌上皮细胞(HeLa)、中国仓鼠卵母细胞(CHO)和293T等4种不同细胞株的感染活性.结果 深圳人源HSN1禽流感病毒株A/Shenzhen/406H/06属于subelade2.3,其HA基因开放读码框编码567个氨基酸,在GenBank登录号为EF137706.经Sal Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切鉴定HA基因成功克隆至真核表达载体CMV/R.将pHR-Luc、pCMV&8.2、CMV-HA共转染293T细胞后,所收集的假病毒经Western blot证实假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24,还可以整合AIV HA蛋白,并且能够由前体蛋白HA0裂解为具有生物活性的HA1和HA2蛋白.HIV-HA假病毒可以感染MDCK、HeLa、CHO、293T等4种靶细胞,表明所构建的假病毒具有感染活力,且具有广泛的宿主范围.结论 本研究成功构建整合A/Shenzhert/406H/06 HA蛋白的假型逆转录病毒,并且HIV-HA假病毒具有良好的感染活性,从而为下一步筛选中和抗体及抗原表位分析奠定基础.     

用于禽流感H5亚型检测的压电免疫蛋白芯片的研制

采用聚乙烯亚胺(PEI)粘附、戊二醛(Glu)交联的方法,将禽流感H5抗原固定于石英晶体的金电极表面,制成压电蛋白芯片。结果显示,抗原最佳固定浓度为0.761 mg/mL,该芯片用于检测浓度范围为0.1243 mg/mL～1.243 mg/mL的禽流感H5血清时,呈线性相关,相关系数0.9704,且阳性样品的响应值与阴性样品的噪声值之比大于2,可用于定性定量检测。     

H11亚型禽流感病毒血凝素特异性单克隆抗体的制备

禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒（AIV）引起的一种禽类的感染和（或）疾病综合征。本病在世界各国均有存在，我国自1992年报道AI以来，已分离到了多株病毒，绝大多数都是低致病力毒株，却也给养禽业造成巨大的经济损失。血凝抑制试验（HI）试验快速、简便，且价格低廉，因此是最常用的一种检测AIV的方法。但多抗血清的制备比较繁琐，不同批次的抗体质量差异大。如能制备出针对AIV HA蛋白的mAb，将会弥补以上多抗血清的缺点，还可无限制的制备同质的抗体。     

2015-2016年度中国甲型H1N1亚型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定CSCD

目的 为获得2015-2016年度中国流行的甲型H1N1亚型流感病毒疫苗候选株,制备流感病毒重配株并对其进行鉴定.方法 采用经典重配的方法,将H1N1亚型流感病毒流行株与H3N2亚型的鸡胚高产重配母本株（X-157株）在鸡胚上进行混合培养.用H3亚型的HA蛋白抗血清和X-157株全病毒抗血清对混合培养病毒进行阴性筛选.阴性筛选后HA滴度较高的病毒用Real-Time PCR法对表面蛋白基因型进行鉴定.对表面蛋白基因型正确的毒株用限制性内切酶酶切鉴定法鉴定其内部基因组成.进一步对HA和NA基因进行Sanger法测序,并用表面基因无氨基酸位点突变的毒株免疫雪貂,进行双向血凝抑制（Two-way hemagglutination inhibition test,HI）试验.结果 Real-Time PCR筛选出5株表面蛋白基因型正确的毒株.经内部基因鉴定其中4株为6＋2组成,1株为5＋3组成.5株重配株的HA和NA基因均未发生氨基酸位点突变.5株重配株HA滴度均维持在1 024以上.最终选取的12号重配株免疫原性良好,HI滴度达5 120,双向HI试验均通过.重配后疫苗株在鸡胚上的产量是重配前野毒株的64倍.结论 成功制备了2015-2016年度中国流行的甲型H1N1亚型流感病毒疫苗株,为疫苗贮备和疾病防控奠定了基础.     

鸡IL-2、IL-1 8、IFN-γ cDNA和CpG DNA在减毒沙门菌运送H5亚型禽流感DNA疫苗中的佐剂作用

目的 探讨鸡IL-2、IL-18、IFN-γ cDNA和CpG DNA在减毒沙门菌运送H5亚型禽流感DNA疫苗中的佐剂作用。方法 将携带禽流感病毒（AIV）DNA疫苗的重组沙门菌SL7207（pVAX1-HA-IL2）、SL7207（pVAX1-HA—IL18）、SL7207（pVAXt—HA—IFN-γ）、SL7207（pVAX1—HA—CpG）、SL7207（pVAX1-HA）和SL7207（pVAX1）经口服和滴鼻途径首免1日龄商品代伊莎褐蛋鸡，测定免疫鸡的体液和黏膜免疫应答水平，并进行攻毒保护试验。结果 二免后3周，SL7207（pVAX1-HA—CpG）、SL7207（pVAX1-HA-IFN-γ）免疫组以及SL7207（pVAX1-HA）和SL7207（pVAX1-IFN-7）联合免疫组鸡产生了较高水平的特异性黏膜免疫应答（P〈0．05），但重组菌免疫鸡血清中抗AIV HI抗体水平与空载体组相比差异无统计学意义。SL7207（pVAX1-HA-CpG）、SL7207（pVAX1-HA—IFN-7）的免疫保护指数显著高于阴性对照组。结论 初步观察佐剂效应依次为：CpG〉IFN-7〉IL-18，IL-2未表现出佐剂效应。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析

目的:预测H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性.方法:依据近年H5N1亚型禽流感病毒流行趋势,下载得到相关HA蛋白氨基酸序列.进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性.通过BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清,初步鉴定候选表位抗原性.结果:综合多项预测及空间构象模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA141～155、HA206～223、HA302～316.候选表位处于H5N1亚型禽流感HA1 蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H5N1亚型禽流感病毒HA相应区域具有较好的一致性.而不同候选表位在BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能.结论:所筛选的表位具有成为H5N1亚型禽流感病毒HA Th和B细胞相关抗原表位的可能.本研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H5N1亚型禽流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础.     

用于禽流感H7亚型检测的压电免疫蛋白芯片研制

目的研制禽流感H7亚型检测的压电免疫蛋白芯片。方法采用聚乙烯亚胺（PEI）黏附、戊二醛（Glu）交联的方法．将禽流感H7抗原固定于石英晶体的金电极表面。研究敏感材料的浓度、pH值对其固定量的影响。结果该芯片用于检测浓度范围为0．123～0．617mg／ml的禽流感H7血清时，呈线性相关，相关系数0．9785。结论检测阳性样品的响应值与阴性样品的噪声值之比大于2，可用于禽流感H7亚型定性定量检测。     

禽流感病毒血凝素H5特异性单克隆抗体的制备及ELISA捕获法的建立

目的 制备和鉴定禽流感病毒(H5N1)血凝素(H5)特异性单克隆抗体(mAb),建立H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法.方法 以H5血凝素和携带H5全长基因的质粒免疫Balb/c小鼠制备mAb,利用血凝抑制(HI)实验筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验筛选捕获抗体和检测抗体,建立测定H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法.结果 获得16株特异性针对H5的单克隆抗体,与A型流感病毒H1、H3、H7、H9和B型流感病毒的血凝素无HI交叉反应,对H5血凝素的血凝抑制效价为1:100～1:51 200;通过配对实验,建立以单克隆抗体H5M9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记单克隆抗体H5M11为检测抗体的双抗体夹心ELISA;检测多株H5N1病毒和H5血凝素的最低检出值为1/32血凝单位,检测A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均为阴性.结论 建立了一种灵敏度高、特异性强的测定H5抗原的ELISA捕获法,可应用于禽流感病毒H5N1感染的实验室早期诊断.     

密码子的鸡体偏嗜性优化增强H5亚型禽流感HA基因的表达水平和免疫原性

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）[GD／1／96（H5N1）]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的HA基因（optiA5）,并将其插入表达载体pCI构建了DNA疫苗质粒pCIoptiHA5;将pCIoptiHA5和表达GD／1／96（H5N1）HA基因的质粒pCIHA5通过问接免疫荧光法和Western—blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白;随之将pCIoptiHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIV GD／1／96（H5N1）鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明基因optiHA5表达水平显著高于野生型HA基因;免疫SPF鸡后,100μg pCIoptiHA5可形成75％的免疫保护,100μg pCIHA5可形成50％的免疫保护;10μg pCIoptiHA5可形成对免疫鸡75％的部分免疫保护,而10μg pCIHA5则基本不能形成免疫保护;pCIoptiHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,提高免疫原性,增强免疫保护效果。     

2016—2018年长沙市人群及活禽市场环境H5N6亚型禽流感病毒监测分析

目的:开展2016—2018年长沙市人群感染和活禽市场(live poultry markets, LPMs)环境污染H5N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)监测,为防控人感染H5N6亚型AIV提供实验室数据。方法:采集2016—2018年长沙市流感样病例和不明原因肺炎病例咽拭子6...     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

不同抗原性甲3 (H3N2) 亚型流感病毒的鉴定及分子生物学研究

目的：对不能用当年标准血清进行鉴定的甲3（H3N2）亚型流感病毒进行抗原性分析及分子生物学研究。方法：用交互血凝抑制试验对毒株进行抗原性分析,提取病毒RNA,用一步法逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）扩增HA1（血凝素重链区）基因片段,产物纯化后测序并分析结果。结果：发现两株从鸡胚分离到的甲3（H3N2）亚型“D”相毒株与2株从MDCK细胞分离到的“0”相毒株抗原性已明显不同;其中1999年分离的“D”相与“0”相2毒株的抗原比大于256,氨基酸序列同源性为93％,抗原决定簇A区和B区氨基酸位点相差分别为50％及35％;受体结合部位（RBS）有6个氨基酸位点发生变异（左侧壁1个、前壁3个、右壁2个）。结论：人群中存在没有发生“0”相变异的甲（H3N2）亚型“D”相毒株,其抗原性与当前流行的“O”相变异株已明显不同,提示今后在鉴定甲3（H3N2）亚型毒株时,需根据毒株的来源和相特性选择适合的标准血清进行鉴定。     

高致病性禽流感H5N1病毒研究进展

1997年8月发现首例人禽流感病例以来,不断有人禽流感病例发生,截至2007年3月1日,WHO报道的经实验室确证的H5N1禽流感感染者共277例,死亡167例,死亡率超过50％。目前WHO对禽流感的预警是3级,即是一种新的流感亚型,已经在人类中引起严重疾病,但还没有在人类中持续传播流行。本文就目前H5N1禽流感病毒来源,跨越物种传播的机制,致病力决定因素及人间传播能力等几个关键的基础问题研究进展进行综述。     

高致病性禽流感H5N1病毒研究进展

1997年8月发现首例人禽流感病例以来,不断有人禽流感病例发生,截至2007年3月1日,WHO报道的经实验室确证的H5N1禽流感感染者共277例,死亡167例,死亡率超过50%。目前WHO对禽流感的预警是3级,即是一种新的流感亚型,已经在人类中引起严重疾病,但还没有在人类中持续传播流行。本文就目前H5N1禽流感病毒来源,跨越物种传播的机制,致病力决定因素及人间传播能力等几个关键的基础问题研究进展进行综述。