ＮＡＮＯＧ基因在侧群表型干细胞样肝癌细胞中的表达及意义

摘要：【目的】基于侧群（ＳＰ）细胞分选方法,从肝癌细胞Ｈｕｈ７和Ｈｅｐ３Ｂ中分选ＳＰ表型干细胞样肝癌细胞,观察干细胞标记物ＮＡＮＯＧ基因在该ＳＰ表型肝癌细胞中的表达。【方法】采用流式细胞术检测和分选肝癌细胞Ｈｕｈ７和Ｈｅｐ３Ｂ中的ＳＰ细胞和非侧群（ＮＳＰ）细胞,细胞生长曲线法检测ＳＰ和ＮＳＰ细胞的增殖能力,Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验检测ＳＰ和ＮＳＰ细胞的侵袭能力,ＭＴＴ法检测ＳＰ和ＮＳＰ细胞对５－氟尿嘧啶（５－ＦＵ）和阿霉素（ＤＯＸ）的药物敏感性;Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ和ＷＢ检测ＳＰ与ＮＳＰ细胞中ＮＡＮＯＧ基因的表达。【结果】肝癌细胞Ｈｕｈ７和Ｈｅｐ３Ｂ中分选的ＳＰ细胞比例分别为（５．３±０．８）％和（１３．４９±１．０）％。生长曲线表明Ｈｕｈ７和Ｈｅｐ３Ｂ的ＳＰ细胞的增殖速度快于ＮＳＰ细胞（Ｐ＜０．０５）,体外侵袭实验结果显示Ｈｕｈ７和Ｈｅｐ３Ｂ的ＳＰ细胞体外侵袭能力高于ＮＳＰ细胞（Ｐ＜０．０５）,ＭＴＴ结果显示Ｈｕｈ７和Ｈｅｐ３ＢＳＰ细胞对５－ＦＵ和ＤＯＸ有耐药性,高于ＮＳＰ细胞（Ｐ＜０．０５）。Ｈｕｈ７和Ｈｅｐ３ＢＳＰ细胞ＮＡＮＯＧｍＲＮＡ平均表达水平分别是ＮＳＰ细胞的４．１７和５．５１倍（Ｐ＜０．０５）,ＮＡＮＯＧ蛋白平均表达水平分别是ＮＳＰ细胞的３．７８和５．０１倍（Ｐ＜０．０５）。【结论】肝癌细胞Ｈｕｈ７和Ｈｅｐ３Ｂ中分选的ＳＰ细胞符合肿瘤干细胞的部分生物学特征,ＮＡＮＯＧ基因在ＳＰ表型干细胞样肝癌细胞中高表达。     

克隆乙型肝炎病毒DNA在肝与肾细胞中复制与表达的研究

对比研究在外细胞培养系统中乙型肝炎病毒在肝,紧名的复制与表达。方法髟克隆ＨＢＶＤＮＡ分别转染ＨｅｐＧ２与２９３细胞系;ｐ１７７ｔｎ与ｐ３．８Ⅱ还转染了原代人胚肾细胞。培养后收集转染细胞培养上清液,用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ;提取转染细胞的ＤＮＡ与ＲＮＡ,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ与Ｎｏｒｈｅｒｎ印迹杂交检测细胞内ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶＲＮＡ。结果转染ＨｅｐＧ２细胞,ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ均有     

与乙型肝炎病毒preS1特异性结合的HepG2细胞膜受体样蛋白

本文对人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２细胞株上与乙型肝炎病毒外周蛋白ｐｒｅＳ１特异性结合的膜受体样蛋白进行了研究。用麦芽糖结合蛋白－ｐｒｅＳ１－直链淀粉树脂亲和层析法，分离得到了与ｐｒｅＳ１特异性结合的ＨｅｐＧ２细胞的膜受体样蛋白质，并经抗ＭＢＰ－ｐｒｅＳ１的单克隆抗体Ｆ３５．２５结合Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ加以证实。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＰＡＧＥ结果显示，ＨｅｐＧ２细胞膜上存在四种不同的受体样蛋白：ＨＬ１，ＨＬ２，ＨＬ３和ＨＬ４，分子量分别为６８０００，６６０００，５１０００和４５０００．对ＨＬ１，ＨＬ２，ＨＬ３和ＨＬ４的氨基末端序列进行了分析。     

铜锌超氧化物歧化酶基因对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）对肝癌细胞增殖的抑制作用。方法：利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，将人铜锌ＳＯＤ基因导入人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２细胞内，获得高表达。检测其对ＨｅｐＧ２细胞生物学特性的影响。结果：与对照相比ＳＯＤ基因转染后的肝癌细胞生长受到抑制，细胞体积变大，分裂象减少，Ｓ期细胞比率减少，软琼脂集落形成率低，裸鼠成瘤瘤体小。结论：铜锌ＳＯＤ基因具有抑制ＨｅｐＧ２肝癌细胞增殖的作用。     

铜锌超氧化物歧化酶基因对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）对肝细胞癌增殖的抑制作用。方法：利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，将人铜锌ＳＯＤ基因导入人肝细胞系ＨｅｐＧ２细胞内，获得高表达，检测其对ＨｅｐＧ２细胞生物学特性的影响，结果：与对照组相比，ＳＯＤ基因转染后的肝癌细胞生长受到抑制，细胞体积变大，分裂象减少，Ｓ期细胞比率减少，软琼脂集落形成率低，裸鼠成瘤瘤体小。结论：铜锌ＳＯＤ基因具有抑制ＨｅｐＧ２肝癌细胞增殖的作     

三氧化二砷诱导人胃癌细胞株MGC—803细胞凋亡的研究

为探讨三氧化二砷对胃癌细胞的作用及可能的机制。用不同浓度的Ａｓ２Ｏ３作用于增减的胃癌细胞株ＭＧＣ－８０３细胞。噻唑蓝细胞活力测定显示Ａｓ２Ｏ３能明显抑制ＭＧＣ－８０３细胞生长；     

HepG2 细胞谷胱甘肽含量和谷胱甘肽转移酶活力的诱导

目的：建立一种具有较高ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力的肝细胞系。方法：将ＨｅｐＧ２细胞在０．１,０．３,０．５ｍｇ／Ｌ浓度的ＣＤＤＰ间歇作用下传代１２个月后得到三种稳定的ＣＤＤＰ耐药细胞系ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．１,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．３,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．５细胞的ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力,结果用显著性ｔ检验方法作统计学处理。结果：诱导刺激后的子代ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．１,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０     

逆转录病毒介导的人肝癌特异性的HSV—tk／ACV的体外抗肝癌作用

目的；建立肝癌特异性前药转换基因治疗的方法。方法和结果；构建携带单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体，经过ＰＡ３１７细胞包装及病毒滴度测定后，感染肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１细胞，用Ｎｏｒｈｅｒｎ杂交方法证明ＨＳＶ－ｔｋ基因在ＡＦＰ高分泌的ＨｅｐＧ２细胞中得到特异转录，以阿昔洛韦（ＡＣＶ）为前药攻击转基因的肝癌细胞呈示对ＨｅｐＧ２有相对选择性杀伤作用。结论；该Ａ     

维甲酸和三氧化砷对急性早幼粒细胞性白血病细胞组织因子表 …

目的 探讨全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）和三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）在体内外对急性早幼粒细胞性白血病（ＡＰＬ）细胞组织因子（ＴＦ）表达的意义。方法 利用复钙时间测定、ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法,分别检测了ＡＴＲＡ和Ａｓ２Ｏ３治疗前后ＡＰＬ患者（２３例）骨髓单个核细胞的促凝活性、ＴＦ抗原及其ｍＲＮＡ的转录水平,同时还检测了使用ＡＴＲＡ和Ａｓ２Ｏ３处理ＡＰＬ细胞株ＮＢ４－Ｒ１细胞以及转染ＰＭＬ－ＲＡＲａ融     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的：用丙型肝炎（丙肝）阳性血清（抗ＨＣＶ阳性及ＨＣＶＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ阳性）感染ＨｅｐＧ２细胞,以期建立稳定的ＨＣＶ感染的细胞模型。方法：采用丙肝阳性血清连续感染法感染ＨｅｐＧ２细胞,用逆转录多聚酶链反应检测传代ＨｅｐＧ２细胞内ＨＣＶＲＮＡ正链和负链,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原（ＨＣＶＮＳ５、ＨＣＶ ｃａｐｓｉｄ）的存在。结果：感染后传代的     

Proteomic analysis of nuclear matrix proteins during arsenic trioxide induced apoptosis in leukemia K562 cells

Background Arsenic trioxide (As2O3 ) has been identified as a very potent anti-acute leukemic agent. However its role in apoptosis needs to be elucidated. As2O3 interferes with the proliferation and survival of tumor cells via a variety of mechanisms. Drug-target interactions at the level of nuclear matrix (NM) may be critical events in the induction of cell death by As2O3. This study dealt with As2O3 -target interactions at the level of NM in chronic myelogenous leukemia cell line K562 by proteomics. Methods K562 cells were cultured in MEM and treated with different concentrations of As2O3. The nuclear matrix proteins were analyzed by high-resolution two-dimensional gel electrophoresis and computer-assisted image analysis. Results As2O3 significantly inhibited the growth of chronic myelogenous leukemia cell line K562 at low concentrations. While more than 200 protein spots were shared among the nuclear matrices, about 18 distinct spots in the nuclear matrices were found characteristic for As2O3 treated cells. Conclusions: As2O3 induces apoptosis in K562 cells in a dose and time-dependent manner. Our results demonstrated that for the detection of the onset of apoptosis, the alteration in the composition of nuclear matrix proteins was a more sensitive indicator than nucleosomal DNA fragmentation test. These results indicated that As2O3 might be clinically useful in the treatment of chronic myelogenous leukemia. The changes of nuclear matrix proteins in the treated cells can be used as a useful indicator for this treatment.     

Nuclear matrix associated protein PML: an arsenic trioxide apoptosis therapeutic target protein in HepG2 cells

Objective To investigate arsenic trioxide(As2O3)-induced apoptosis and the effects on cell nuclear matrix related protein promyelocytic leukaemia(MPL).Methods HepG2 cells were cultured in MEM medium and treated with 0.5,2.5 and 10μmol/L As2O3 for either 24 h or 96 h at each concentration.In situ terminal deoxynucleotidyl trangferase(TdT) labeling (TUNEL)and DNA ladders were used to detect apoptosis.Confocal microscopy and Westem blotting were used to observe the expression of PML.Results The growth rates of HepG2 cells were slower in the As2O3 treated than the untreated control group.DNA ladder and TUNEL positive apoptotic cells could be detectedin As2O3 treated groups.The expression of PML decreased in HepG2 cells with 2 μmol/L As2O3 treatment,Confocal images demonstrated that the expression of PML protein in HepG2 cell nuclei decreased after treatment with 2μmol/L As2O3,and micropunctates characteristic of PML protein in HepG2 cell nuclei disappeared after treatment with 5μmol/L As2O3.Conclusions Our results show that arsenic trioxide can significantly inhlbit the growth of HepG2 cellsin vitro.As2O3 induces apoptosis in HepG2 tumor cells in a time and concentration dependent manner.As2O3 may degrade the PML protein in HepG2 cell nuclel.The decreased expression of PML in As2O3 treated tumor cells is most likely to be caused by apoptosis.Nuclear matrix associated protein PML could be the target of As2O3 therapy.     

运用蛋白质组学研究三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中核基质蛋白的变化

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对慢性粒细胞性白血病细胞系K562细胞核基质蛋白的影响. 方法:用DNA梯度电泳观察As2O3作用后K562细胞凋亡的情况.单向、双向电泳观察As2O3对K562细胞核基质蛋白分布影响. 结果:2.5 μmol/L As2O3处理72 h后,DNA电泳已能检测到发生凋亡的K562细胞,但早在As2O3处理48 h时, 即能观察到核基质蛋白分布的改变,此时尚不能观察到凋亡特征性的DNA片段梯形条带.双向电泳可检测出200多个核基质蛋白点,其中约18个点与As2O3处理相关. 结论:As2O3对K562细胞的影响是时间和剂量依赖性的.双向电泳检测As2O3对K562核基质蛋白分布的影响较DNA梯度电泳检测更为敏感.核基质蛋白成分可能是砷作用的靶蛋白,并且可能是药物发挥抗癌作用的关键点之一.     

FOXO3a在三氧化二砷诱导肝癌HepG2细胞周期阻滞中的作用

目的探讨三氧化二砷（As2O3）对肝癌HepG2细胞增殖的影响及其与细胞周期素依赖性激酶抑制剂（CDKI）p27kip1和p27kip1相关蛋白FOXO3a的关系。方法体外培养人肝癌细胞株HepG2经2μmol/L As2O3处理72 h,用流式细胞仪检测细胞周期变化,并采用核浆分离、Western blot技术及细胞免疫荧光技术检测该过程中p27kip1和FOXO3a在HepG2细胞中的表达变化和亚细胞定位情况。结果与对照组比较,As2O3使HepG2细胞周期阻滞在G2/M期,并诱导凋亡。As2O3作用后,HepG2细胞的p27kip1蛋白和FOXO3a蛋白总量也增加,并且p27kip1的表达变化与FOXO3a的表达水平高低及核-胞浆易位相关。结论 As2O3可能通过上调FOXO3a的表达影响p27kip1基因的转录,从而调控肝癌细胞的增殖。     

低氧条件下三氧化二砷诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡作用

目的：探讨低氧条件下三氧化二砷（As2O3）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡作用。方法：分别在常氧和低氧（CoCl2 200μmol/L）条件下以2、4、8μmol／LAs2O3作用人肝癌Hep岛细胞,24、48、72小时后以MTr法检测细胞增殖抑制率,以AnnexinV／PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡,分析两种条件下As2O3对细胞增殖抑制率和凋亡率的影响。结果：常氧及低氧条件下细胞增殖抑制率,细胞早期凋亡率均随As2O3浓度增加及作用时间延长而升高（P〈0．05）。相同浓度As2O3相同作用时间,低氧条件下细胞增殖抑制率及凋亡率升高更为明显。结论：在低氧条件下As2O3促进细胞凋亡,抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用显著增强。     

黄连素对人肝癌Hep G_2细胞周期及凋亡的影响

目的:观察黄连素对人肝癌细胞Hep G2生长的影响及其可能机制。方法:将浓度分别为0,25,50,100,200μmol/L的黄连素与人肝癌细胞Hep G2共同培养24,48,72 h,用RSB法检测黄连素对人肝癌细胞HepG2生长的抑制率;用流式细胞分析仪分析细胞周期的变化、检测细胞凋亡率及Caspase-3、CyclinB1、CDC2、CDK4蛋白的表达。结果:黄连素对人肝癌细胞Hep G2生长抑制率随药物浓度和作用时间的增加而增大;流式细胞仪分析显示黄连素将人肝癌细胞Hep G2阻滞于S、G2/M期。黄连素作用48 h后人肝癌细胞Hep G2凋亡率明显增加,且随药物浓度的增加而加大。黄连素作用48 h后Hep G2细胞的Caspase-3、CDC2蛋白表达增加;而CDK4、Cy-clinB1蛋白表达降低。结论:黄连素可能通过增加Hep G2细胞CDC2蛋白表达,降低CDK4、CyclinB1蛋白表达使其阻滞于S、G2/M期;可能通过增加Caspase-3蛋白表达增加Hep G2细胞凋亡。     

CHFR基因在人肝癌HepG2细胞中的表达与作用

目的:研究CHFR基因在人肝癌细胞株HepG2中的表达,以及CHFR基因甲基化对HepG2细胞生长与集落形成的影响。方法:采用去甲基化剂5-氮-2-脱氧胞苷处理人肝癌细胞株HepG2,半定量RT-PCR检测CHFR在HepG2细胞中的表达变化,CCK法和平板集落形成试验分析HepG2细胞生长增殖情况的改变。结果:CHFR在HepG2细胞中表达缺失;经Aza去甲基化处理后,CHFR在HepG2细胞中逐渐恢复表达,肿瘤细胞抑制率和集落形成抑制率都逐渐增高,均存在剂量-反应关系;且CHFR表达水平与HepG2细胞抑制率、集落形成抑制率均呈正相关。结论:CHFR对于肝癌细胞的生长增殖能力发挥负向调控作用。     

三氧化二砷对人鼻咽癌小鼠移植瘤生长抑制和诱导分化的初步研究

目的：研究三氧化二砷(As203)对人鼻咽低分化鳞癌可移植瘤在SCID小鼠体内生长的抑制作用，并初步研究其对细胞分化的影响。方法：以人鼻咽低分化鳞癌细胞株CSNE-l为研究对象，观察腹腔注射As203(5mg/kg)对人鼻咽癌在SCID小鼠体内生长情况。用光学显微镜和电子显微镜观察形态结构变化、免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况。结果：腹腔注射As203后，鼻咽癌SCID小鼠移植瘤生长抑制，抑瘤率75．4％。同时，瘤组织中癌细胞密度减少，细胞皱缩，脑浆红染，瘤组织分化渐成熟，出现角化细胞和角化珠；间质结缔组织增多。透射电镜下肿瘤细胞均出现成熟分化，核浆比例减少，脑浆中细胞器增多，出现大量张力原纤维并围绕核周，可见细胞明显角质化，细胞表面微小突起增多，桥粒增多，细胞之间以桥粒互相连接。癌细胞PCNA在阴性对照组呈高表达，阳性细胞指数(PI)达95％，As203组的细胞PC—NA表达明显减少，PI55％(P＝0．001)。结论：As203抑制SCID小鼠体内人鼻咽低分化鳞癌的生长，这种抑制作用可能与其能够诱导癌细胞向成熟方向分化有关。     

HBV对肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中MMP-2及MMP-9的表达影响

目的研究基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9在肝细胞癌(HCC)细胞系HepG2和HepG2.2.15中的表达情况,探讨乙型肝炎病毒(HBV)对肝癌细胞系(HepG2,HepG2.2.15)中MMP-2、MMP-9表达的影响及其与癌细胞侵袭转移之间的关系。方法用明胶酶谱法检测HepG2细胞和稳定转染了HBV质粒的HepG2.2.15细胞中MMP-2和MMP-9的表达情况,观察两种细胞的某些生物学活性,用细胞生长曲线检测两者的生长速度。结果明胶酶谱法检测HepG2细胞中MMP-9的表达水平高于HepG2.2.15细胞(P<0.05),而两者MMP-2的表达差异不显著(P>0.05)。细胞生长曲线显示HepG2细胞的生长速度快于HepG2.2.15细胞。结论通过体外鉴定肝细胞癌细胞系HepG2细胞和HepG2.2.15细胞生长状态的差异,揭示了HBV的细胞内感染过程中HBV对肝细胞癌的生长具有一定的影响。HBV可影响明胶酶MMP-2和MMP-9的分泌及活性,进而对肿瘤的侵袭转移产生一定的影响。     

三氧化二砷影响肝癌细胞系Hep201凋亡的研究

目的　研究三氧化二砷对肝癌细胞生长的抑制作用。方法　采用三氧化二砷处理人肝癌细胞系Hep2 0 1,通过生长曲线的绘制观察三氧化二砷对肝癌细胞生长的影响 ,并应用原位缺口末端DNA标记技术检测肝癌细胞的凋亡情况 ,同时用免疫组织化学和NorthernBlot方法检测凋亡相关基因bc1- 2和bax蛋白与mRNA的表达强度 ,探讨三氧化二砷影响肝癌细胞凋亡的机制。结果　经三氧化二砷连续作用 72h后 ,肝癌细胞生长受到抑制 ,发现试验组凋亡的细胞明显多于对照组 ,bc1- 2在试验组中表达强度低于对照组 ,而bax的表达高于对照组。结论　在三氧化二砷的作用下 ,肝癌细胞的生长受到抑制 ,凋亡细胞增加 ,肝癌细胞凋亡增加的机制可能是凋亡的主要调节因子bc1- 2和bax两种基因表达比例发生变化。