共表达HIV-1 gag-gp120与白细胞介素6重组鸡痘病毒的筛选

目的构建共表达中国株HIV1gaggp120与白细胞介素6(IL6)的重组鸡痘病毒(FPV)。方法分别将HIV1gaggp120基因和IL6基因插入到FPV表达质粒pUTAL复合启动子和单一启动子下游,构建重组FPV表达质粒pUTAGEIL6。利用脂质体法将重组质粒和FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,经BUdR加压筛选,重组病毒分别用SDSPAGE和WesternBolt进行鉴定,观察病毒样粒子的形成和重组病毒在哺乳动物细胞中的表达,并分析其免疫原性。结果阳性重组病毒基因组点膜处有显色斑点,WesternBolt结果显示重组病毒表达了gaggp120嵌合蛋白和IL6,在病毒感染细胞中有反转录病毒样粒子形成,且重组病毒可在哺乳动物细胞中表达目的蛋白。小鼠免疫指标检测表明该重组病毒具有很好的免疫原性。结论成功构建了共表达中国株HIV1gaggp120与IL6的重组FPV,为HIV-1基因工程活载体疫苗和巨分子颗粒化疫苗的制备奠定了基础。     

含中国流行株HIV—1Gag—gp120融合蛋白的重组鸡痘病毒的构建

目的用重组鸡痘病毒表达中国流行株HIV-1Gag-gp120融合蛋白.方法在以鸡痘病毒282E4株为基础构建的重组表达质粒pUTAL的ATI-P7.5复合启动子下游,插入编码中国流行株HIV-1Gag-gp120嵌合基因,构建了重组表达质粒pUTALGP.重组质粒与FPV共转染CEF细胞,进行了同源重组.通过PUdR加压筛选,X-gal染色,获得重组鸡痘病毒vUTALGP.结果经Westernblot检测表明,重组病毒表达了Gap-gp120融合蛋白,其分子量分别为110×103、69×103、48×103、24×103.电镜观察可见Gag蛋白在CEF细胞中形成的反转录病毒样粒子.重组病毒免疫小鼠,能够诱导HIV-1特异的血清抗体反应.结论重组鸡痘病毒成功的表达了Gag-gp120融合蛋白,并进行了正确的加工.     

含密码子优化型HIV-1 gp120基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

目的 构建能表达野生型和密码子优化型人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)B亚型中国流行株gp120基因的非复制型腺病毒。方法 按哺乳动物细胞偏好的密码子对HIV-1B亚型中国流行株Ch gp42的gp120基因进行优化，合成优化基因。将野生型和密码子优化的gp120基因插入穿梭质粒，再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E．coli BJ5183，获得重组子，转染293细胞后获得重组病毒。分别以两种重组腺病毒疫苗免疫小鼠，ELISA检测小鼠血清中的特异性抗体，乳酸脱氢酶法检测小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。结果 获得两株重组腺病毒rAd-wt．gp120和rAd．mod．gp120，能正确表达Gp120。rAd-mod．gp120比rAd-wt．gp120蛋白表达水平明显提高。重组腺病毒免疫小鼠后能产生HIV-1特异性的抗体及CTL反应，rAd-mod．gp120组明显优于rAd-wt．gp120组。结论 成功构建了表达野生型和密码子优化的HIV-1 gp120基因的重组腺病毒，能诱导HIV-1特异性体液和细胞免疫反应。     

共表达HIV-1 gp120与IFN-α重组鸡痘病毒诱导特异性CTL的初步研究

目的:探讨共表达HIV -1gp12 0与IFN- α重组鸡痘病毒诱导小鼠产生特异性的CTL杀伤活性。方法:将重组鸡痘病毒经肌肉注射免疫BALB c小鼠后,制备小鼠脾淋巴细胞悬液。以免疫小鼠的脾淋巴细胞为效应细胞,以表达HIV- 1结构蛋白的P815细胞为靶细胞,用乳酸脱氢酶释放法测定免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性。结果:重组病毒可有效地诱导特异性CTL的产生,且重组病毒免疫组小鼠脾特异性CTL对靶细胞的杀伤活性显著高于FPV对照组(P <0 .0 1)和PBS对照组(P <0. 0 1)。结论:共表达HIV- 1gp12 0和IFN -α的重组鸡痘病毒可激发强烈的细胞免疫,可作为我国HIV- 1疫苗候选株。     

在鸡痘病毒中共表达HIV-1 gp120与IL-2基因

外膜蛋白gp120是HIV—1主要结构蛋白之一，它的V3区存在着中和抗体决定簇、CTL决定簇，以及对巨噬细胞和脑组织纤维特异性识别的区，与HIV—1可诱导中和抗体应答、特异性细胞毒反应及分子致病机制密切相关。针对V3环的抗体可干扰gp120和CCR5之间的结合，这一发现为艾滋病的预防和治疗提供了新的途径。现已证明，多数细胞因子具有良好的免疫佐剂性能，对免疫应答具有刺激作用。本研究拟利用我国鸡痘病毒疫苗株为载体，构建可共表达HIV-1 gp120与IL-2基因的重组鸡痘病毒载体，为开发HIV重组病毒活载体疫苗提供一种安全的新途径。     

H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒构建

目的 构建表达H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒活载体疫苗候选株.方法 筛选流感病毒主要抗原(HA NA NP M)优势抗原表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构合成流感多表位基因(Epi),以H5、H7 HA融合表达基因为骨架,将多表位基因插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒,定向克隆至鸡痘病毒表达载体pUTA-2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA.应用脂质体介导的转染法,将该重组鸡痘病毒中间转移载体与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压筛选挑斑纯化后传代,并对重组以鸡痘病毒进行PCR和IFA检测和Western blot分析.结果 成功构建了重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA,PCR、IFA和Western blot检测阳性.结论 筛选出稳定共表达H5H7HA基因和通用多表位基因的重组鸡痘病毒vUTA2-H7HA-Epi-H5HA株,该重组鸡痘病毒的构建为跨种通用型流感病毒活载体疫苗的研究奠定了物质基础.     

共表达HIV-1 gag-gp120与IL-6重组鸡痘病毒和核酸疫苗的联合免疫研究

目的探讨共表达HIV-1 gag-gpl20与IL-6重组鸡痘病毒和核酸疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法以重组鸡痘病毒首免，以表达相同抗原的核酸疫苗质粒追加免疫，检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果联合免疫组脾特异性CTL杀伤活性比重组鸡痘病毒单独免疫组、核酸疫苗单独免疫组、鸡痘病毒疫苗株对照组和空白质粒对照组高，血清抗体水平显著高于空白质粒对照组和鸡痘病毒疫苗株对照组，但与重组鸡痘病毒单独免疫组、核酸疫苗单独免疫组之间差异无显著性。结论重组鸡痘病毒和核酸疫苗的联合免疫可诱导小鼠产生更强的细胞免疫应答。     

含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫的研究

目的 探讨含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒(rAAV)和重组腺病毒(rAdV)疫苗在BALB／c小鼠中联合免疫的效果。方法 将密码子优化的HIV-1 gp120基因分别插入腺相关病毒(AAV)和腺病毒(AdV)载体质粒，构建含该基因的rAVV和rAdV载体疫苗。将两种疫苗以不同的联合方式免疫BALB／c小鼠，ELISA检测小鼠血清中的gp120特异性抗体，细胞内细胞因子染色法检测小鼠的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。结果 两种重组病毒均可表达目的基因gp120；在小鼠体内两种重组病毒联合免疫可诱导特异性的CTL应答和血清1gG抗体反应，但用rAAV初免2次，再用rAdV加强3次所诱发的CTL和血清1gG反应最强。结论 rAAV和rAdV疫苗联合免疫可在小鼠体内诱导特异性的CTL应答和血清1gG抗体反应。     

HIV-1中国流行株gag与hIL-2在重组痘苗病毒中的共表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

目的：将HIV-1中国流行株B亚型gag基因、gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达，以期获得重组痘苗病毒，观察细胞因子的佐剂作用，与核酸疫苗混合免疫，评价免疫效果，为新型艾滋病疫苗研制开发打下基础。方法：将HIV-1中国流行株 gag基因、gag和hIL-2基因片段插入到 pJ38载体启动子下游，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒，SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫Balb/c小鼠，进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4 、CD8 T细胞数目以及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果：获得了重组痘苗病毒 vJ38gag和 vJ38gag-IL-2。与 vJ38-gag相比，vJ38gag-IL-2，具有更好的免疫原性，重组痘苗病毒免疫3次的效果好于重组病毒免疫2次，以2rVV-DNA混合免疫效果最好。结论：重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。细胞因子IL-2发挥了免疫佐剂的作用。     

表达HIV-1 gag-polΔ和gp140TM蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及免疫效果研究

目的 构建表达人免疫缺陷病毒Ⅰ型gag-polΔ和gp140TM基因的非复制型重组腺病毒。方法 首先将HIV-1的gag-polΔ和gp140TM基因插入穿梭载体，再与腺病毒骨架质粒pAd Easy-1共转化E．coli BJ5183，获得重组子。转化293细胞后获得重组病毒。重组腺病毒与DNA疫苗联合免疫小鼠，ELISA检测小鼠血清中的抗体。结果 获得两株重组腺病毒vAd-gag-polΔ和vAd-gp140TM，能正确表达Gp140TM、Gag蛋白以及经剪切加工的P24蛋白，与DNA疫苗联合免疫小鼠后能产生高滴度的HIV-1特异性的抗体。结论 成功构建了表达HIV-1结构基因的重组腺病毒，能有效诱导HIV-1特异性抗体。     

Construction and characterization of recombinant fowlpox virus coexpressing HIV-1(CN) gp120 and IL-2

The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) has now become one of the most serious infectious disease in the world, the safe and effective AIDS vaccines would be the best tools to control the disease. Fowlpox virus has been studied recently as a potential vector for the delivery of heterologous vaccine antigen. In this study, a recombinant fowlpox virus coexpressing gp120 of Chinese prevalent HIV-1 strain and IL-2 was constructed and the cellular immune responses against HIV-1 gp120 in BALB/c mice were evaluated. Chinese vaccine strain 282E4 of fowlpox virus was used as the vector to construct the recombinant fowlpox virus (rFPV) coexpressing HIV-1 gp120 and IL-2 via homologous recombination, and the recombinant virus was identified by PCR and Western blotting. The specific DNA fragment was amplified by PCR from the genomes of rFPV. Western blotting analysis showed that HIV-1 gp120 and IL-2 was expressed not only in chicken embryo fibroblast (CEF) cells infected by rFPV, but also in mammalian cells infected by rFPV. After the recombinant fowlpox virus was inoculated into BALB/c mice, specific CTL activities in the immunized mice were detected in the spleen. The results demonstrated that rFPV had good immunogenicity and could induce BALB/c mice to produce specific cellular immunity. IL-2 played a role of immunoadjuvant and enhanced the cellular immune response. The study provides the basis for the preparation of a Chinese vaccine candidate against HIV-1.     

Comparison of the biological activities of human immunodeficiency virus 1 P24 and GP41 expressed in Spodoptera frugiperda cells by use of bac-to-bac system

Recombinant transposing plasmids pFH24 and pFH41 were constructed by cloning the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) p24 and gp41 genes, respectively, into the transposing vector pFastBacHTa. Recombinant bacmids rBH24 and rBH41 were obtained by transposing pPolh/p24 and pPolh/gp41 expression cassettes from recombinant plasmids pFH24 and pFH41, respectively. Recombinant viruses rAcH24 and rAcH41 were generated by transfection of the Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with the DNAs of plasmids rBH24 and rBH41, respectively. Analysis of the expressed p24 or gp41 proteins with an antiserum to HIV-1 (HIV-1 antiserum) by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and dot blot assay showed high biological activity of these proteins; p24 was more active than gp41. Also a Western blot analysis showed stronger bands for p24 than for gp41. The high reactivities of p24 and gp41 with the HIV-1 antiserum suggest that these proteins could also be used as specific standard antigens in HIV-1 diagnostics.     

中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

目的：将中国流行株B亚型HIV－1结构蛋白基因gag和gp120的巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。方法：以酵母分泌型表达质粒pPIC9为载体，构建含HIV－1 gag和gp120嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用Sac I将pPICGP线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115，用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE和Western blot进行分析，并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果：12个酵母转化子中共筛选到了8个阳性酵母转化子，其整合率为66．7％。SDS－PAGE和Western blot分析显示，在相对分子质量（Mr）为57000处有1条特异蛋白带，且能与抗p24单抗（mAb)和抗gp120mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代10次后，其外源基因未丢失。结论：在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV－1 gag-gp120嵌合基因，且表达蛋白具有特异性，但其Mr较预计计算的值要小，说明嵌合基因中的gp120基因只有部分进行了表达。     

HIV-1 膜蛋白基因片段杆状病毒转移载体克隆及重组体的构建

目的：构建编码HIV－1外膜糖蛋白的gp120和gp41基因杆状病毒转移载体，并在昆虫细胞中表达gp120和gp41重组蛋白。方法：从HIV－1基因克隆PNL4－3（NY5／LAV）中应用聚合链反应扩增目的基因gp120和gp41，克隆到PGEM－T载体中，限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定目的基因，再经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆到杆状病毒转移载体PAC－SecG2T中，再次测序鉴定。通过在sf9昆虫细胞中同源重组、空斑筛选、病毒鉴定、SDS－PAGE、Western-blot对重组病毒和重组蛋白进行分析。结果：限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，gp120和gp41正确克隆到杆状病毒转移载体PACSecG2T中；SDS－PAGE和Eestern-blot结果表明在昆虫细胞中成功表达了HIV外膜糖蛋白gp120和gp41。结论：成功构建了PACSecG2T-gp120和PACSecG25-gp41杆状病毒转移载体，并在杆状病毒－昆虫细胞表达系统中表达了HIV－1 gp120和gp41重组蛋白，Western-blot证明具有较好的免疫原性。     

人类免疫缺陷病毒1型云南株外膜蛋白原核表达克隆的构建

目的为研究我国云南１型人类免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＨＩＶ－１）流行株外膜蛋白（ｇｐ１２０）的有关抗原表位。方法采用套式聚合酶链式反应，以来自云南流行区ＨＩＶ－１感染者的外周血单核巨噬细胞基因组为模板，进行云南流行株外膜蛋白基因（ｅｎｖ）片段的扩增，并将ｅｎｖ基因片段与原核表达载体ｐＢＶ２２０进行重组，构建成质粒ｐＹＮｅｎｖ并在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０ｂ）中获得表达。采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定。结果含重组质粒的宿主菌经３０℃２０小时培养后，转入４２℃培养５小时，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析有重组蛋白的表达。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ反应证实，该重组蛋白可与来自该流行区的ＨＩＶ－１感染者血清（含多克隆抗体）发生特异反应。结论该重组膜蛋白可作为抗原用于ＨＩＶ－１膜蛋白抗体的检测，并为进一步研究ＨＩＶ－１ｇｐ１２０的病理机制奠定了基础。     

The transmembrane domain of vesicular stomatitis virus glycoprotein suffices to anchor HIV-1 envelope gp120 expressed by a recombinant vaccinia virus

The shedding of HIV-1 glycoprotein gp120 results from the proteolytic cleavage of its precursor gp160 into gp120 and an anchoring gp41, to which gp120 is non-covalently attached. This report is directed toward the anchorage of gp120 expressed by three recombinant vaccinia virus (rvv): vPE16 expresses wild-type gp160; vvE13 the gp120-vesicular stomatitis virus G transmembrane and cytoplasmic tail (VSVGTMCT) fusion protein; and vvE14 the gp120 with 52 amino acids (aa) from the vector. In order to convert gp120 into an integral membrane protein, a gp120- VSVGTMCT chimerical gene fragment has been constructed and expressed in mammalian cells. This gp120 fusion protein expressed by an rvv, vvE13, has been shown to elicit better immunogenicity and protection against a gp160-expressing tumor cell line than the full-length envelope (env) glycoprotein gp160 in mice. The results show that gp120-VSVGTMCT expressed by vvE13 is not shed because it is membrane associated. The hydrophobic fragment of vesicular stomatitis virus G (VSVG) furnishes an anchor of the chimeric protein just as it does in the native VSVG.