不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究

目的　研究甘油作为冷冻保护剂、不同基因型小鼠对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法　采用 6 5mol L的甘油作为冷冻保护剂 ,采用二步法对CBA、NOD、C57BL 6J、ICR及CD1小鼠 3 5d的胚胎进行玻璃化冷冻 ,并比较了不同品系小鼠胚胎的复苏率及移植受孕率。结果和结论　CBA、NOD、C57BL 6J,ICR及CD1的复苏率分别为 5 7 6 %、4 8%、31 3%、86 5 %及 88% ,移植受孕率为 2 1%、2 3 5 %、11%、38%和 35 5 % ,封闭群小鼠的胚胎复苏率、移植受孕率均显著高于近交系小鼠。这提示胚胎的复苏率及移植受孕率可能与小鼠的不同基因型有关。五个品系中 ,桑椹胚及早期囊胚的体外复苏率均显著高于扩张囊胚。这说明不同基因型及胚胎的不同发育阶段对胚胎玻璃化冷冻效果有影响     

常规法与玻璃化法冷冻保存小鼠胚胎的比较

常规法冷冻保存小鼠胚胎成活率为73.3%,将解冻后120枚胚胎移植于12只受体鼠获38只仔鼠;玻璃化法冷冻保存小鼠胚胎成活率为71.8%,将解冻后120枚胚胎移植于受体鼠获36只仔鼠。两种方法比较,玻璃化法操作简便、快速、经济是一种值得推广的保存小鼠胚胎的新方法。     

小鼠胚胎玻璃化冷冻保存影响因素的研究

胚胎置玻璃化1液(VS-1)(含10%甘油 20%1.2一丙二醇 20?S的PBS液)中平衡10或17min后装管置4℃或18℃玻璃化2液(VS-2)(含25%甘油 25%1.2一丙二醇 20?S的PBS液)中。随即投入液氮冷冻保存。结果显示:在VS-1液中平衡10min组的胚胎获较高成活率;4℃的VS-2液显著地改善囊胚冷冻后成活率;桑椹胚冷冻效果优于囊胚。将解冻后120枚胚胎移植于12只受体鼠,获36只成活仔鼠。     

HBV—C转基因小鼠快速胚胎冷冻方法的建立

目的 建立用于转基因小鼠种质保存的快速胚胎冷冻方法。方法 用乙二醇作为抗冻保护剂,对携带HBV—C基因的转基因小鼠模型进行了玻璃化胚胎冷冻保存的研究。结果 发现含体积分数30％乙二醇的冷冻液可达到最佳的冷冻效果,有81．54％的冷冻胚胎在体外可进一步发育,其中69．81％达到孵化阶段,比较不同发育阶段的胚胎的冷冻效果发现,致密桑椹胚解冻后的孵化率显著高于囊胚。不同的装管方法对胚胎的回改率也有影响,五段法的胚胎回收率显著高于二段法。将解冻后形态正常的胚胎82枚移植给8只假孕母鼠,5只怀孕,怀孕率为62．5％,产下28只小鼠,产仔率为54．9％。结论 一步法玻璃化冷冻方法可用于转基因小鼠的种质保存。     

小鼠胚胎玻璃化冷冻的研究进展

玻璃化冷冻是继常规冷冻方法之后发展起来的一种冷冻方法,它操作简单且不需要高精度的冷冻仪。玻璃化冷冻的效果与玻璃化溶液的种类、冷冻方法及胚胎的不同品种及时期有关。本文综述了近年来有关胚胎玻璃化冷冻的研究进展。     

小鼠原核胚玻璃化冷冻保存技术的研究

目的　原核胚是转基因等生物技术所必需的主要材料 ,其冷冻保存使操作不受时间和空间的限制。另外 ,冷冻保存还可以避免体外培养过程中的细胞发育阻断期。方法　在室温 (2 0℃或 2 5℃ )条件下 ,以乙二醇、DMSO为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液 (EFS、EDT、EDFS) ,不借助冷冻仪 ,对小鼠原核胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存。结果　 2 0℃室温条件下 ,用EDFS4 0平衡 1min一步法冷冻解冻后的原核胚 ,经培养后囊胚发育率最高仅为 4 7% ,与新鲜原核体外培养的对照组 (75 % )的差异极显著 (P <0 0 1) ;当原核在 10 %E +10 %D溶液中预处理 5min ,移入EDFS30中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后的囊胚发育率达 6 8%。而室温升至 2 5℃ ,二步法冷冻保存后原核胚的囊胚发育率高达 77% ,与对照组差异无显著性 (P >0 0 5 )。用最佳冷冻组的原核胚或解冻后培养到囊胚移植给受体母鼠均获得产仔。结论　本研究对小鼠原核胚实施玻璃化冷冻保存 ,经体外培养和移植结果与对照组无显著性差异 ,证明了本方法的可行性     

平皿-微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

目的 :使用平皿 微滴法玻璃化冷冻小鼠 8～ 12细胞胚胎 ,检验该方法对胚胎的冻存效果。方法 :胚胎在EG2 0 中平衡 3min ,EFS4 0 中平衡 1min ,将含有胚胎的小于 0 .5 μl的EFS4 0 微滴吹于 35mm平皿上并立即直接浸入液氮保存。结果 :解冻后胚胎回收率达到 98.1% ,透明带无破损 ,冷冻后存活率为 95 .2 %。冻融胚胎体外发育和体内发育能力与对照组胚胎比较差异无显著性 (84 .3%对 90 .1% ,12 .1%对 13.5 % ,P >0 .0 5 )。结论 :小鼠 8～ 12细胞胚胎可以用平皿 微滴法有效地进行玻璃化冻存。     

平皿—微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

目的：使用平皿－微滴法玻璃化冷冻小鼠8－12细胞胚胎，检验该方法对胚胎的冻存效果。方法：胚胎在EG20中平衡3min，EFS40中平衡1min，将含有胚胎的小于0.5μl的EFS40微滴吹于35mm平皿上并立即直接浸入液氮保存。结果：解冻后胚胎回收率达到98．1％，透明带无破损，冷落后存活率为95．2％。冻融胚胎体外发育和体内发育能力与对照组胚胎比较差异无显著性（84．3％对90．1％，12．1％对13．5％，P＞0．05）。结论：小鼠8－12细胞胚胎可以用平皿－微滴法有效地进行玻璃化冻存。     

近交系小鼠胚胎玻璃化冷冻技术研究

目的 对近交系小鼠体内受精的胚胎在三种不同处理温度(20℃、25℃、28℃)进行玻璃化冷冻保存。方法 不同温度下,胚胎在10％EG溶液中预处理5min,再投入EFS40玻璃化溶液中1min,平衡后冷冻。结果 与20℃和28℃相比,三个品系小鼠的胚胎都在25℃冷冻时获得最佳效果,解冻后培养观察发育率分别是87．77％、90．00％、87．18％。结论 该结果对近交系小鼠胚胎保存具有重要意义。     

单胚胎玻璃化冷冻对小鼠胚胎体外发育的影响

目的:比较单胚胎玻璃化冷冻与慢速冷冻对小鼠分裂期胚胎损伤和体外发育的影响,探讨使用玻璃化冷冻保存大量胚胎的可行性。方法:选择8-细胞胚胎随机进行改良的玻璃化和慢速冷冻,复苏后培养至囊胚孵出,计数胚胎复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、细胞团数、孵出率,并进行组间比较分析。结果:玻璃化冷冻组复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、孵出率、细胞团数分别为100%、12.7%、75.7%、66.4%、112,慢速冷冻组分别为87.1%、31.0%、35.5%、58.7%、78,除囊胚孵出率其余各指标两组间差异均具有统计学意义。结论:单胚胎玻璃化法冻存小鼠分裂期胚胎复苏后细胞成活率高,结构完整,更好的保持了胚胎的发育潜能。     

胸腺肽对HBV转基因小鼠表达HBV DNA的影响

应用胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠进行腹腔内注射（３ｍｇ／只）连续３个月，同时设促肝细胞生长素及生理盐水对照组，定期取血检测ＨＢＶＤＮＡ，结果发现胸腺肽组ＨＢＶＤＮＡ阴转率为２２％～５５％，停药２２ｄ后阴转率为２２％，而对照组小鼠ＨＢＶＤＮＡ无阴转，结果提示胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠表达ＨＢＶＤＮＡ有抑制作用。     

OPS两步法玻璃化冷冻小鼠8-细胞胚胎生存发育率的研究

目的为实验动物、家畜和人类胚胎的冷冻保存探索简易、高效的玻璃化冷冻程序。方法以小鼠8-细胞胚胎为材料,在25℃室温和37℃恒温台条件下,利用玻璃化冷冻溶液EDFS30, 对小鼠8-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存,解冻后培养60 h后的囊胚发育率为其体外发育能力的考核指标,同时对解冻后培养1-3 h的胚胎进行移植以判定其体内发育潜力。OPS(Open-pulled straw)两步法冷冻保存,即胚胎首先移入预处理液(10％EG 10％DMSO)中平衡30 s,再移入玻璃化溶液中吸入OPS平衡15、25、35、45和60 s连同胚胎直接投入液氮中冷冻保存。结果小鼠胚胎8-细胞冷冻后囊胚发育率最佳组高达95．6％,与对照组(96．8％)差异无统计学意义(P> 0．05)。利用最佳冷冻组获得的165枚胚胎移植于11只假孕63-67 h的受体母鼠,结果有4只妊娠,产仔23只,妊娠产仔率为38．3％(23/60),与对照组37．9％(22/58)差异无统计学意义(P>0．05)。结论 EDFS33为玻璃化冷冻液,OPS两步法能有效地冷冻保存小鼠8-细胞胚胎。     

shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用

目的观察shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用。方法将质粒DNA采用Hydrodynamic技术注入HBV转基因小鼠体内,观察血清ALT和AST水平、血清HBsAg和肝组织HBcAg表达和HBVmRNA的变化。结果在注射质粒后,ALT和AST呈一过性升高,3天后降至正常;血清HBsAg和肝细胞内HBcAg表达减少,蛋白抑制至少持续14天;质粒注射后第5天,实验组肝脏HBVmRNA与注射前相比明显减少,而对照组HBVmRNA信号无明显变化。结论shRNA表达质粒对HBV转基因小鼠HBV有抑制作用。     

小鼠扩张囊胚颗粒法玻璃化冷冻保存技术研究

在２５℃室温下,用ＥＦＳ３０玻璃化溶液,对小鼠扩张囊胚进行颗粒法玻璃化冷冻保存。结果,胚胎在ＥＦＳ３０溶液中平衡１ｍｉｎ后滴入液氮中,解冻后的胚胎发育率达１００％,囊胚孵化率达７６％。而在１０％乙二醇溶液中将胚胎预处理５ｍｉｎ,再移入ＥＦＳ３０中平衡１ｍｉｎ后冷冻保存的胚胎,解冻后的发育率和囊胚孵化率分别为９８％和６３％。上述２组的胚胎发育率与对照组无明显差异,而囊胚发育率均明显低于对照组（Ｐ＜０．０１）。上述２组胚胎解冻后植入假孕小鼠子宫后的受体妊娠率分别为９０％和８１％,产出率分别为７１％和５８％,与对照组（６１％）相比均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。     

玻璃化冷冻保存对小鼠卵巢组织的影响

目的探讨玻璃化冷冻保存对小鼠卵巢组织内卵泡形态及卵巢组织激素分泌功能的影响。方法将23只4周龄ICR雌鼠随机分为新鲜卵巢组、去势组和玻璃化冷冻组，应用乙二醇（EG）和二甲基亚砜（DMSO）玻璃化冷冻小鼠卵巢组织。冷冻前后取部分小鼠卵巢组织行组织学观察；同时将部分新鲜和复苏组织自体移植入小鼠肾被膜下。移植术后5d开始观察小鼠的动情周期，术后30d测定小鼠血清雌激素浓度。结果冻融卵巢组织内存活的原始卵泡和初级卵泡与新鲜组织无显著差异（P〉0．05）；而次级卵泡的存活率显著下降（P〈0．01）。移植术后玻璃化冷冻组和新鲜卵巢组小鼠均出现动情周期，两组动情周期出现时间无明显差异（P〉0．05）。移植术后第30天两组小鼠血清雌激素浓度无显著差异（P〉0．05）。结论玻璃化冷冻法可以较好地保存小鼠卵巢组织内的原始卵泡和初级卵泡，且不影响卵巢组织的激素分泌。     

应用荧光原位杂交检测HBV基因在转基因小鼠染色体上的整合

目的应用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）,检测本研究中心制备的乙型肝炎病毒（HBV）转基因小鼠目的基因的整合位点。方法采用荧光原位杂交技术,以正常小鼠染色体标本为对照,通过荧光标记的探针与转基因小鼠染色体标本进行杂交,对比分析同一中期分裂相的G显带和FISH结果。结果转基因小鼠染色体检测到一对明显的荧光信号,推测其在14号同源染色体上,而对照组无信号。结论外源HBV基因以单位点形式稳定地整合到转基因小鼠的染色体上。     

不同冷冻载体对小鼠卵巢组织玻璃化冻存的影响

目的研究不同冷冻载体对小鼠卵巢组织玻璃化冻存的影响.方法将9～12周龄小鼠的卵巢组织取出,在冷冻液中平衡后,分别以闭合麦管、开放麦管与冷冻环为冷冻载体快速深低温冻存,解冻后行自体双肾被膜下移植,观察动情周期、移植21 d后取存活移植物固定,观察单位高倍视野下卵泡数、测定小鼠血清雌激素水平,对比冻存效果.结果移植后各组均有移植物存活,移植物内可见各级处于不同发育阶段的卵泡.闭合麦管、开放麦管与冷冻环组的移植物存活率分别为78.5%、78.5%、84.6%;单位高倍镜下的卵泡数分别为4.0±0.8、4.5±0.7、4.6±0.9;小鼠血清雌激素水平分别为（10.4±0.8）pg/mL、（11.0±1.6）pg/mL、（12.5±1.1）pg/mL.其中,冷冻环组在移植物存活率及小鼠血清雌激素水平与闭合麦管组相比存在显著性差异.结论采用冷冻环做载体能明显提高冻融移植后卵巢组织的存活率与雌激素分泌功能,明显提高对小鼠卵巢组织的保存效果.     

乙二醇为主体的玻璃化溶液对小鼠桑椹胚的超低温保存

本试验系统地研究了以低毒性的乙二醇为主体,添加葡聚糖和海藻配制成的玻璃化溶液（EDT20,EDT30及EDT40）,在室温（20 ℃或25 ℃）下对小鼠体内受精的桑椹胚进行玻璃化冷冻保存。毒性试验表明,30%葡聚糖溶液（D）,0.5mol/L海藻糖溶液（T）,以及两种物质的混合液即DT溶液,对胚胎均无化学毒性作用,乙二醇是化学毒性的主要来源。且随着乙二醇浓度的增加和平衡时间的延长,对胚胎的化学毒性也增大。小鼠桑椹胚的玻璃化冷冻试验中,20 ℃室温下胚胎冷冻效果好于25 ℃,但差异无显著意义（P>0.05）。在20℃室温下,胚胎于EDT30中平衡1 min,后直接投入液氮中一步法冷冻后胚胎体外发育率、移植妊娠率和产仔率分别为94.00%、45.00%、38.00%,与对照组差异均无显著意义（P>0.05）。若将胚胎在10%EG中平衡5 min,再移入EDT30中平衡30 s二步法冷冻效果最佳,解冻后囊胚发育率、移植妊娠率和产仔率分别为96.00%、57.00%、52.00%,与对照组差异均无显著意义(P>0.05)。