胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒构建及在大鼠脊髓内的表达

目的:构建胰岛素样生长因子1的真核细胞表达质粒,分析pcDNA3.1-hIGF-1体内转基因的可行性。方法:实验于2004-06/09在吉林大学基础医学院动物实验室完成。①选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,随机数字表法分为胰岛素样生长因子1组、模型对照组、正常对照组,4只/组。②聚合酶链法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出胰岛素样生长因子1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的人源性胰岛素样生长因子基因序列。③胰岛素样生长因子1组应用直接注射法将阳离子脂质体和pcDNA3.1-hIGF1混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中;模型对照组注射等剂量pcDNA3.1和阳离子脂质体混合液。正常对照组未作任何处理。1周后应用免疫组化法观察人源性胰岛素样生长因子在大鼠脊髓中的表达。结果:实验选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,全部进入结果分析。①聚合酶链反应片段鉴定结果:琼脂糖电泳显示,扩增带大小与预期的人源性胰岛素样生长因子cDNA相同。②重组的真核表达质粒的鉴定结果:酶切鉴定显示,重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。③基因转染后各组胰岛素样生长因子1免疫组化测定结果:基因转染1周后,胰岛素样生长因子1组脊髓组织内阳性细胞数明显高于模型对照组和正常对照组(48.2±5.3,29.3±4.2,23.8±8.3,P<0.01)。结论:阳离子脂质体介导pcDNA3.1-hIGF1体内转基因的方法是可行的。     

人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的：构建胰岛索样生长因子1（insulin growth faetor 1，IGF-1）的真核细胞表达质粒，转染神经胶质瘤细胞（C6细胞），建五hIGF-1稳定表达细胞株，为进一步观察胰岛索样生长因子1基因体内转染后对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响打下基础。方法：实验于2004-05／09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室进行，用聚合酶链反应方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF—1cDNA，然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中，酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的hIGF-1基因序列；使用C6细胞株，用脂质体方法转染C6细胞。经G418筛选，形成阳性细胞克隆。继续培养4周，进行Western blot检测。结果：重组的真核细胞表达质粒pcDNA3．1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。Western blot检测结果证实转染的hIGF-1基因在C6细胞内成功表达。结论：实验所构建的重组真核细胞表达载体pcDNA3．1-hIGF-1能够稳定表达有活性的hIGF-1，实验结果对进一步观察脊髓损伤后胰岛素样生长因子1抑制神经细胞凋亡的作用有一定意义。     

人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的构建胰岛素样生长因子1(insulin growth factor1,IGF-1)的真核细胞表达质粒,转染神经胶质瘤细胞(C6细胞),建立hIGF-1稳定表达细胞株,为进一步观察胰岛素样生长因子1基因体内转染后对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响打下基础。方法实验于2004-05/09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室进行。用聚合酶链反应方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF-1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的hIGF-1基因序列;使用C6细胞株,用脂质体方法转染C6细胞。经G418筛选,形成阳性细胞克隆。继续培养4周,进行W estern blot检测。结果重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。W estern blot检测结果证实转染的hIGF-1基因在C6细胞内成功表达。结论实验所构建的重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-hIGF-1能够稳定表达有活性的hIGF-1,实验结果对进一步观察脊髓损伤后胰岛素样生长因子1抑制神经细胞凋亡的作用有一定意义。     

Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤中的表达

目的：构建Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体pcDNA3．1／Ⅰ型胰岛素样生长因子，并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达情况。 方法：实验于2003-07／12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室完成。利用原核表达质粒pUChIGF-I，通过分子克隆技术扩增Ⅰ型胰岛素样生长因子基因，将其克隆至真核表达载体pcDNA3．1中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1／Ⅰ型胰岛素样生长因子。取20只Wistar大鼠，全麻后背部浸入95℃水浴锅中，烫伤12s，造成30％Ⅲ度烫伤，烫伤后随机分为两组（n=10），即cDNA3．1／Ⅰ型胰岛素样生长因子组及pcDNA3．1组。①pcDNA3．1／Ⅰ型胰岛素样生长因子组：烫伤后当天及第1，2，3，4周后于大鼠左后背部创面边缘（距创面边缘0．5cm）皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL（3．6μg pcDNA3．1／Ⅰ型胰岛素样生长因子（2μL）＋10μL脂质体＋180μL生理盐水]。②cDNA3．1组：注射时间和方法同前，脂质体和质粒混合物为3．0μg pcDNA3．1（2μL）＋10μL脂质体＋180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠，取注射点附近皮肤，应用免疫组化方法检测Ⅰ型胰岛素样生长因子基因的表达情况。 结果：20只大鼠全部进入结果分析，无脱失。①大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致。DNA测序结果表明Ⅰ型胰岛素样生长因子基因已分别正确插入到pcDNA3．1质粒，提示成功构建了重组真核表达载体。②pcDNA3．1／Ⅰ型胰岛素样生长因子组大鼠皮肤组织中Ⅰ型胰岛素样生长因子呈现强阳性表达，pcDNA3．1组大鼠呈表达缺失或弱阳性表达。 结论：应用分子克隆技术可以成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1／Ⅰ型胰岛素样生长因子，Ⅰ型胰岛素样生长因子在烫伤大鼠皮肤中呈阳性表达。     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验 人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的：探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达，并初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法：实验于2002-07／2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子Ⅰ／GS质粒。将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后，抽提纯化质粒，并对质粒进行测序鉴定。②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞，通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达。③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后，检测各混合液的吸光度，以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量。结果：①质粒鉴定结果：质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带，符合质粒的电泳图谱；质粒的测序结果和胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列完全吻合。②胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞中的表达：质粒转染软骨细胞后，反转录-聚合酶链反应能见到298bp的胰岛素样生长因子ⅠmRNA片断的表达；Western-blot可见7．6ku的胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达条带。③转胰岛素样生长因子Ⅰ基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响：转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是（5．23&;#177;0．62）mg／L和（2．47&;#177;0．31）mg／L．两组比较，差异有显著性意义（t=2．88，P〈0．05）；转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为（9．92&;#177;1．04）mg／L和（4．56&;#177;0．51）mg／L，两组比较，差异有显著性意义（t=6．47，P〈0．05）。结论：胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达，并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖，具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力。转胰岛素样生长因子Ⅰ基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据。     

胰岛素样生长因子Ⅱ基因转染骨髓基质细胞后的生物学活性

目的：将人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的真核表达载体pcDNA3-胰岛素样生长因子Ⅱ，转染兔骨髓基质细胞，使其在该细胞中瞬时表达，并观察该表达载体促进骨髓基质细胞增殖的生物学活性。方法：实验于2004—08／12在解放军总医院骨科研究所完成。①骨髓基质细胞培养：取4周龄雄性新西兰大白兔1只用于骨髓基质细胞提取。培养的第2代细胞用于实验。②基因转染：将人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的真核表达载体pcDNA3-胰岛素样生长因子Ⅱ，转染兔骨髓基质细胞，对照组则为空载体pcDNA3。③转染与非转染骨髓基质细胞胰岛素样生长因子ⅡmRNA表达：采用反转录-聚合酶链反应检测。④转染细胞的增殖状况检测：采用四甲基偶氮唑盐法测定各组吸光度（A）值（A值越大表示细胞增殖越强）。结果：①转染与非转染骨髓基质细胞胰岛素样生长因子ⅡmRNA表达：琼脂糖凝胶电泳的结果显示，未转染和转染pcDNA3质粒的细胞仅出现内参照β-肌动蛋白的条带，而转染的细胞出现胰岛素样生长因子Ⅱ和β-肌动蛋白的两条带。（2）转染细胞的增殖状况：24，48，72h各时间点单纯骨髓基质细胞组和转染胰岛素样生长因子Ⅱ的骨髓基质细胞组细胞增殖均显著高于与对照组（72h：1.233&;#177;0.45，1．575&;#177;0.45，0．482&;#177;0．04，P〈0．01）；转染胰岛素样生长因子Ⅱ的骨髓基质细胞组显著性高于单纯骨髓基质细胞组（P〈0．01）。结论：将具有多重生物学效应的胰岛素样生长因子Ⅱ基因转入软骨组织工程最佳种子细胞-骨髓基质细胞，明确胰岛素样生长因子Ⅱ促进骨髓基质细胞增殖分化效应，并初步证实了其促进种子细胞的成骨活性。     

应用完整原位杂交技术检测人食管癌EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达

目的：探讨人食管癌EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体的表达，及其对反义寡核苷酸胰岛素样生长因子1受体mRNA表达的影响和食管癌发生、转移的意义。方法：实验于2004-09／12在河南省肿瘤病理重点实验室完成。体外分5组培养人食管癌EC9706细胞，其中4组分别用设计合成的3条封闭胰岛素样生长因子1受体不同基因位点的反义寡核苷酸1～3及1条无关寡核苷酸转染．另一组不转染。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA表达情况。结果：①胰岛素样生长因子1受体mRNA在食管癌EC9706细胞中呈阳性表达。②3条胰岛素样生长因子1受体反义寡核苷酸转染组EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达无差异（2．66&;#177;0．21，2.63&;#177;0.23，2.65&;#177;0.22，P&;gt;0．05)，但均显著低于无关寡核苷酸组及无转染组(5．67&;#177;2．86，5．02&;#177;2．75，P&;lt;0．05)结论：胰岛素样生长因子1受体反义寡核苷酸转染人食管癌EC9706细胞后，可体外抑制EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达，从而抑制食管癌的发生和转移。为临床预防食管癌的发生、发展和转移提供了理论依据。     

Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤中的表达

目的:构建Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子,并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达情况。方法:实验于2003-07/12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室完成。利用原核表达质粒pUChIGF-I,通过分子克隆技术扩增Ⅰ型胰岛素样生长因子基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子。取20只Wistar大鼠,全麻后背部浸入95℃水浴锅中,烫伤12s,造成30%Ⅲ度烫伤,烫伤后随机分为两组(n=10),即cDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组及pcDNA3.1组。①pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组:烫伤后当天及第1,2,3,4周后于大鼠左后背部创面边缘(距创面边缘0.5cm)皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL眼3.6μgpcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子穴2μL雪 10μL脂质体 180μL生理盐水演。②pcDNA3.1组:注射时间和方法同前,脂质体和质粒混合物为3.0μgpcDNA3.1穴2μL雪 10μL脂质体 180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠,取注射点附近皮肤,应用免疫组化方法检测Ⅰ型胰岛素样生长因子基因的表达情况。结果:20只大鼠全部进入结果分析,无脱失。①大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致,DNA测序结果表明Ⅰ型胰岛素样生长因子基因已分别正确插入到pcDNA3.1质粒,提示成功构建了重组真核表达载体。②pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子组大鼠皮肤组织中Ⅰ型胰岛素样生长因子呈现强阳性表达,pcDNA3.1组大鼠呈表达缺失或弱阳性表达。结论:应用分子克隆技术可以成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1/Ⅰ型胰岛素样生长因子,Ⅰ型胰岛素样生长因子在烫伤大鼠皮肤中呈阳性表达。     

CYP2J3基因对果糖诱导的高血压及胰岛素抵抗的调节作用

目的：观察细胞色素P450-CYP2J3基因对果糖诱导的高血压和胰岛素抵抗的干预作用。 方法：实验于2004—07／2005—02在华中科技大学附属同济医院综合科实验室完成。选择雄性SD大鼠30只，摄入果糖诱导高血压和胰岛素抵抗模型，经尾静脉注入pcDNA3．1-CYP2J3重组质粒。30只大鼠随机数字表法分为pcDNA3．1-CYP2J3质粒干预对照组、pcDNA3．1质粒干预对照组、空白对照组，pcDNA3．1-CYP2J3质粒干预组、pcDNA3．1质粒干预组，各6只。各组大鼠给予正常饲料和饮水。基因注入1周测量血压，1次／周，每次测量5次，取平均值。基因注入2周测胰岛素抵抗相关指标。 结果：纳入动物30只，均进入结果分析,（1）PCDNA3．1-CYP2J3质粒干预组大鼠在CYP2J3基因导入后第7天出现血压明显下降，最大降压效应在导入基因后第14-21天，其降压效应持续3周以上，与pcDNA3．1质粒干预对照组对比血压下降，差异有显著性意义[分别为（125．7&;#177;0．5），（137．8&;#177;0．6）mmHg，P〈（0．05]。（2）CYP2J3基因导入2周后，PCDNA3．1-CYP2J3质粒干预组大鼠血浆胰岛素水平与PCDNA3．1质粒干预组相比明显降低[分别为（9．89&;#177;0．41），（14．22&;#177;0．55）mlU／L，P〈0．05]，接近各个对照组。 结论：果糖可以诱导大鼠发生高血压和胰岛素抵抗，CYP2J3基因导入后可以降低果糖诱导的高血压并改善胰岛素抵抗。     

神经营养因子对成年大鼠脊髓损伤后皮质脊髓束再生的影响

背景：胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对脊髓运动神经元的存活有明显的保护作用，但GDNF对成年大鼠脊髓损伤后皮质脊髓束再生是否有促进作用仍不清楚。目的：研究胶质细胞源性神经营养因子对脊髓损伤后皮质脊髓束再生的保护作用。设计：随机对照实验。地点和材料：本实验在第二军医大学神经生物实验室完成。实验动物采用雄性成年SD大鼠64只，体质量250～300g。干预：采用Nystrδm法制备大鼠胸髓后路压迫损伤模型，压迫质量为50g，时间为5min，造成大鼠胸段脊髓急性重度损伤。脊髓损伤后24h，对照组注射6μL阳离子脂质体DC-Chol和2μg pCDNA3的混合物，实验组将6μL DC-Chol和2μg重组质粒pEGFP-GDNF cDNA混合后注入大鼠损伤脊髓。主要观察指标：应用RT-PCR技术和荧光显微镜检测GDNF体内转基因后在局部的表达，通过辣根过氧化物酶(HRP)顺行追踪技术和神经微丝(NF)免疫组化活性的变化来评价GDNF基因体内转染对大鼠皮质脊髓束再生的影响。结果：GDNF基因体内转染1周后发现在基因注射局部有转录和蛋白水平表达，4周后在脊髓损伤周围仍检测到GDNF蛋白表达。脊髓损伤后4周，实验组脊髓损伤区皮质脊髓束HRP标记明显多于对照组，仅在实验组可见部分神经纤维穿过损伤区至远端5～9mm。损伤区NF阳性轴突数(524．33&;#177;80．55／低倍视野)较对照组(309．84&;#177;56．65／低倍视野)明显增多(P&;lt;O．01)，GFAP阳性细胞数(186．68&;#177;16．25)明显少于对照组(239．78&;#177;21．44)(P&;lt;O．01)。结论：阳离子脂质体介导GDNF体内转基因能促进近端皮质脊髓束再生和神经骨架蛋白的修复，提示神经营养因子基因治疗可用来治疗创伤性脊髓损伤。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的 原核表达获得大量人regucalcin（RGN）蛋白。方法 用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术从人。肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）中扩增RGN全长cDNA，将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T，测序鉴定准确后，进行酶切，将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b（＋）构建成重组质粒pET42b（＋）-RGN。将pET42b（＋）-RGN先转化入大肠杆菌DH5α，提取质粒经双酶切鉴定正确后，再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与免疫印迹分析，鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化，达电泳纯。结果 构建了重组质粒pET42b（＋）-RGN并获得高效表达，RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后以包涵体形式存在，表达的蛋白质相对分子质量为34000。结论 人RGN蛋白在pET42b（＋）原核表达载体可获得高效表达，为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的原核表达获得大量人regucalc in(RGN)蛋白。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)中扩增RGN全长cDNA,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T,测序鉴定准确后,进行酶切,将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b( )构建成重组质粒pET42b( )-RGN。将pET42b( )-RGN先转化入大肠杆菌DH5α,提取质粒经双酶切鉴定正确后,再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析,鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经N i2 亲和层析纯化,达电泳纯。结果构建了重组质粒pET42b( )-RGN并获得高效表达,RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式存在,表达的蛋白质相对分子质量为34 000。结论人RGN蛋白在pET42b( )原核表达载体可获得高效表达,为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

Ecdysone-controlled expression of transgenes

Inducible expression systems show great potential for use in human gene therapy and systems based on insect ecdysone receptors are particularly promising candidates. This article describes such systems and reviews actual and potential uses of ecdysone-controlled transgenes in vitro and in vivo. The ligand specificity of ecdysone receptor-based systems is considered, along with the safety and efficacy of the ecdysteroid and non-steroidal compounds used to activate them.     

Ecdysone-controlled expression of transgenes

Inducible expression systems show great potential for use in human gene therapy and systems based on insect ecdysone receptors are particularly promising candidates. This article describes such systems and reviews actual and potential uses of ecdysone-controlled transgenes in vitro and in vivo. The ligand specificity of ecdysone receptor-based systems is considered, along with the safety and efficacy of the ecdysteroid and non-steroidal compounds used to activate them.