旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

旋毛虫抗原基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定

目的原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr)43 000抗原基因(Ts43)并对重组蛋白进行抗原性鉴定。方法将旋毛虫抗原基因Ts43克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Ts43,经测序分析正确后转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting analysis)鉴定重组蛋白的抗原性。结果SDS-PAGE结果显示表达产物为Mr 41 000的重组融合蛋白,IPTG诱导4 h时表达量最大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的14.7%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、乡土旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,与人芽囊原虫、微小隐孢子虫感染小鼠和正常小鼠血清和正常人血清无交叉反应,但与棘球蚴病、囊尾蚴病、日本血吸虫病、并殖吸虫病及华支睾吸虫病患者血清均有交叉反应。结论旋毛虫Ts43基因的重组蛋白具有较好的抗原性,但与某些寄生虫病患者血清有交叉反应。     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的 在体外真核细胞COS7中表达重组质粒pcDNA3．1／Ts87，为旋毛虫病DNA疫苗的研究奠定基础。方法 将重组质粒pcDNA3．1／Ts87：经脂质体Lipofectamine介导，体外转染真核细胞COS7，通过细胞免疫组化，细胞裂解物的SDS—PAGE电泳和Western—blot分析检测表达产物。结果 重组质粒能够在COS7中表达出约38ku的目的蛋白，并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。结论 构建的重组质粒可在体外真核细胞COS7中成功表达。     

旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的　在体外真核细胞 COS7中表达重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87,为旋毛虫病 DNA疫苗的研究奠定基础。　方法　将重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87经脂质体 L ipofectamine介导 ,体外转染真核细胞 COS7,通过细胞免疫组化 ,细胞裂解物的 SDS- PAGE电泳和 Western- blot分析检测表达产物。　结果　重组质粒能够在 COS7中表达出约 38ku的目的蛋白 ,并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。　结论　构建的重组质粒可在体外真核细胞 COS7中成功表达。     

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的　获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。　方法　旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入PET-28a(+)表达载体,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物,SDS-PAGE、ELISA和Westernblotting对表达产物进行分析鉴定,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果　SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子量约为40kDa的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。　结论　获得一个新的旋毛虫成虫Ts87基因重组蛋白,该蛋白具有特异的抗原性。     

旋毛虫钙网蛋白的表达和生物学特性鉴定

目的 克隆表达旋毛虫钙网蛋白(TsCRT),并对其生物学特性进行鉴定。方法 通过RT-PCR扩增TsCRT基因,构建重组质粒pMD19T-TsCRT,测序正确后亚克隆至表达载体pQE80L,构建重组表达载体pQE80L-TsCRT,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过Western blot、qPCR和免疫荧光试验(IFT)鉴定rTsCRT的反应原性及其在不同虫期的表达与组织定位,通过动物免疫试验观察rTsCRT的免疫原性。结果 成功构建重组表达载体pQE80L-TsCRT,转化DE3后经IPTG诱导表达相对分子质量为47×10³的rTsCRT蛋白。用纯化的rTsCRT免疫小鼠3次,血清抗体效价达1∶10⁵。Western blot显示,rTsCRT可被抗rTsCRT血清和旋毛虫感染小鼠血清识别。qPCR检测显示,TsCRT在旋毛虫肌幼虫、肠道感染性幼虫、成虫和新生幼虫期均有转录和表达。IFT试验显示,TsCRT主要定位在旋毛虫的表皮和胚胎中。结论 TsCRT在旋毛虫不同虫期均有表达,重组...     

小鼠Lewis肺癌细胞与旋毛虫相关抗原基因sHSPs的原核表达及鉴定北大核心CSCD

目的对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞与旋毛虫(Trichinella spiralis)相关抗原基因sHSPs进行原核表达,对表达产物进行抗原性鉴定。方法利用噬菌体文库展示技术筛选旋毛虫与LLC细胞相关抗原基因并分析,获得sHSPs(DQ 986457)基因。以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增sHSPs基因,连接至表达载体pET-32a(+)后转化入感受态BL21(DE3),以IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。结果重组表达质粒pET-32a(+)-sHSPs经双酶切及测序鉴定证明克隆载体构建正确,SDS-PAGE检测其表达重组蛋白相对分子质量约为36×10~3。Western blot检测重组蛋白可被抗LLC细胞多抗血清识别。结论成功构建了pET-32a(+)-sHSPs克隆载体,其表达的重组蛋白可与抗LLC细胞多抗血清反应即具有反应原性,为该蛋白的研究奠定了基础。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的 获取旋毛虫抗原的cDNA克隆并进行蛋白的原核表达。方法 应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行筛选，并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆PET－28a( )表达载体，IPTG诱导表达后用SDS－PAGE电泳分析表达产物。结果 免疫筛选获得阳性克隆Ts87；成功构建重组表达质粒PET－28a( )/Ts87。诱导表达该融合蛋白，SDS－PAGE电泳表明，其能表达一分子质量约为40ku的融合蛋白，与预测分子质量相符。结论 筛选到cDNA克隆Ts87，与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应，PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S1蛋白的原核表达与鉴定

目的 克隆SARS冠状病毒(SARs-CoV)S1基因片段，构建原核表达载体，并在宿主菌中诱导表达带组氨酸标记的融合蛋白。方法人工合成SARS-CoV Sl基因片段，克隆至pUCm-T载体，经DNA序列分析和酶切后，将酶切片段亚克隆至原核表达载体pET-28b( )，重组子pET-28b／SARS-S1转化大肠杆菌ril，IPTG诱导表达，Western blot鉴定表达产物；纯化表达产物并用ELISA检测其抗原特异性。结果 获得了主要以包涵体形式存在的32kD的目的蛋白，Western blot鉴定其为带组氨酸标记的融合蛋白，ELISA证明其能与合成肽的抗体及病人血清中的SARS-CoV的抗体特异结合。结论 成功构建了SARS-CoV S1基因的组氨酸标记表达载体pET-28b／SARS-S1，并在ril中得到了高效表达；表达的s1蛋白具有较好的抗原特异性，便于免疫动物以获得特异抗体，为SARS-CoV的实验室快速诊断打下了基础。     

不同佐剂对旋毛虫Ts87重组蛋白免疫小鼠保护性的影响

目的 比较福氏完全佐剂（CFA）等6种佐剂对于旋毛虫Ts87重组蛋白（rTs87）免疫保护性的影响。 方法 经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定的rTs87分别与上述各种佐剂免疫ICR小鼠，每间隔2周免疫1次，共免疫3次。ELISA检测免疫小鼠血中抗原特异性IgG抗体水平。攻击感染45 d后剖杀小鼠取肌幼虫（ML）并计数，计算肌幼虫减虫率。 结果 rTs87相对分子质量（Mr）约为40 000，可被旋毛虫感染鼠血清和rTs87免疫鼠血清识别，分别与佐剂CFA（或IFA）、IMS 1312、ISA720、Quil-A及氢氧化铝免疫后均引起较强的IgG抗体反应，各佐剂免疫组减虫率分别为49.4%、49.2%、63.5%、65.1%和70.8%，与空白对照组比较有统计学意义；单纯抗原rTs87免疫组获得了23.7%的减虫率，与对照组及各佐剂免疫组差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 佐剂CFA（或IFA)、IMS1312、ISA720、Quil-A及氢氧化铝均能不同程度增强rTs87对小鼠的保护性免疫力，其中佐剂ISA720、Quil-A和氢氧化铝的保护效果更好。     

Ts21基因在旋毛虫不同期虫体的表达及特性的研究

目的观察旋毛虫Ts21基因在不同发育期虫体的表达及其特性。方法应用RT-PCR检测旋毛虫Ts21基因在成虫、新生幼虫、感染后15d的成囊前幼虫及感染后42d的成囊幼虫(肌幼虫)的转录情况;应用抗Ts21重组蛋白血清通过间接荧光抗体试验(IFA)对成囊前幼虫及肌幼虫冰冻切片抗原进行检测。应用抗Ts21重组蛋白血清对旋毛虫肌幼虫粗(可溶性)抗原及排泄分泌(ES)抗原进行Western-blot分析。结果RT-PCR发现旋毛虫成虫与感染后42d肌幼虫均扩增出一条分子量约540bp的特异性条带(Ts21基因目的条带),而新生幼虫与感染后15d成囊前幼虫则未扩增出目的条带;IFA结果表明抗Ts21重组蛋白血清只与感染后42d成囊幼虫抗原发生阳性反应,而不与感染后15d的成囊前幼虫抗原发生阳性反应。Western-blot结果显示抗Ts21重组蛋白血清只与旋毛虫肌幼虫粗抗原和ES抗原中Mr 21 000的单一蛋白条带发生阳性反应。结论旋毛虫Ts21基因的表达具有期特异性,Ts21蛋白是旋毛虫肌幼虫ES抗原中的一部分。     

旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达

目的构建和表达旋毛虫重组质粒。方法PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞。分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠。结果和结论成功构建pcD-NA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达。     

旋毛虫Ts87抗原基因在毕赤酵母中的构建及表达

目的构建旋毛虫Ts87抗原基因并在毕赤酵母中分泌表达。方法通过PCR特异性扩增Ts87抗原基因,构建重组质粒P^PICZαA-Ts87。其线性化后,转化毕赤酵母GS115,抗生素Zeocin筛选高抗性转化子,PCR筛选阳性重组菌株。表型鉴定后进行甲醇诱导表达,收集培养不同天数的上清液。斑点杂交法分析上清液以确定有无重组蛋白分泌表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)分析鉴定表达蛋白。结果与结论成功构建了P^PICZαA-Ts87毕赤酵母表达重组质粒,确定了Ts87抗原基因在毕赤酵母中获得分泌表达。     

旋毛虫Ts21重组蛋白的免疫诊断价值及免疫保护作用的研究

目的 探讨旋毛虫Ts21重组蛋白的免疫诊断价值及免疫保护作用。 方法 应用旋毛虫Ts21重组蛋白ELISA（Ts21-LISA）与肌幼虫ES抗原ELISA（ES-LISA）对旋毛虫病与其他寄生虫病患者血清及5种旋毛虫（T1、T2、T3、T4和T7）感染小鼠血清进行检测,并观察不同剂量旋毛虫感染小鼠后不同时间的血清抗体水平。将Ts21重组蛋白皮下注射免疫小鼠（20 μg/只,免疫3次,每次间隔10 d）,末次免疫后10 d,每只小鼠用300条旋毛虫肌幼虫经口攻击感染,3.5 d和42 d 后剖杀,观察肠道成虫与肌幼虫数并计算减虫率。 结果 Ts21-LISA检测旋毛虫病、并殖吸虫病、囊尾蚴病及棘球蚴病患者血清的抗体阳性率分别为94.7%（18/19）、15.8%（3/19）、9.1%（1/11）和7.7%（1/13）,与血吸虫病、华支睾吸虫病患者血清及健康人血清无交叉反应;Ts21重组蛋白与ES抗原ELISA检测旋毛虫病患者血清抗体的敏感性与特异性差异均无统计学意义（χ²=0,P＞0.05;χ²=0.358,P＞0.05）。Ts21重组蛋白与ES抗原检测T1感染小鼠血清的敏感性差异无统计学意义（χ²=0.104,P＞0.05）,与T2、T3、T4、T7感染小鼠血清的交叉反应率明显低于ES抗原（χ²=17.069,P＜0.05）。小鼠感染300条旋毛虫后4 周,应用Ts21-LISA检测的血清抗体阳性率为100%（10/10）;小鼠感染5条旋毛虫后6周,血清抗体阳性率为100%（10/10）。Ts21重组蛋白免疫小鼠用旋毛虫攻击感染后3.5 d和42 d,肠道成虫与肌幼虫减虫率分别为42.71%和49.8%。 结论 Ts21重组蛋白可用于旋毛虫病的血清学检测,但不能忽视与并殖吸虫病、囊尾蚴病及棘球蚴病患者血清的交叉反应。     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

旋毛虫Ts87基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

目的 为进一步研究和应用旋毛虫Ts87基因，本文原核表达了PET-28a( )／Ts87重组质粒，并纯化鉴定了该蛋白。方法 将Ts87基因片段克隆入原核表达载体PET-28a( )，形成重组质粒PET-28a( )／Ts87，转化后经IPTG诱导得到表达蛋白(约40kDa)，利用固定化金属离子(Ni^2 )配体亲和层析纯化目的蛋白，进行复性，并用兔人工感染旋毛虫血清鉴定表达产物。结果与结论 成功构建了PET-28a( )／Ts87，SDS-PAGE显示融合蛋白主要以包涵体形式存在，经过亲和层析得到纯化的目的蛋白，经鉴定可被人工感染旋毛虫兔血清识别。