PcDNA3-hNGF真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人神经生长因子(h NGF)真核表达载体pc DNA3-h NGF,检测其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法利用PCR扩增h NGF全长c DNA,构建真核表达载体pc DNA3-h NGF,经测序证实后将其转染至大鼠骨髓基质干细胞中,利用Western blot方法检测h NGF的表达情况。结果 DNA测序结果显示构建的pc DNA3-h NGF表达载体与实验设计相符。Western blot检测显示该重组载体转染大鼠BMSCs 72h后,有h NGF的过表达。结论构建的pc DNA3-h NGF能在骨髓基质干细胞过表达h NGF蛋白,本研究为应用神经生长因子修饰的骨髓基质干细胞进行骨折治疗奠定了基础。     

大鼠骨髓基质干细胞体外诱导分化为类许旺细胞

目的 研究大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞的方法。方法 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子等依次按顺序诱导。神经胶质纤维酸性蛋白、S—100免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后不同时间的细胞阳性表达率。结果 诱导后骨髓基质干细胞形态改变，胞体呈椭圆形，有2—3个纤细的细胞突起，成纵形栅栏状排列，免疫细胞化学染色神经胶质纤维酸性蛋白表达率为42．5％-68.7％、S—100表达率为39．6％-60.2％。结论 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、HRG可以诱导大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞。     

改良法体外诱导骨髓基质干细胞分化为类许旺细胞

目的　探讨一种较为有效的诱导方法将骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为类许旺细胞。　方法　用Dezawa所述方法 (称为传统诱导法 )加以改良成将所有诱导剂一起联合半量间隔诱导两次的方法 (称为改良诱导法 ) ,诱导后的细胞从形态学、抗S 10 0和抗GFAP细胞免疫化学染色的阳性率、MTT细胞活性测定及流式细胞仪检测细胞DNA含量来比较此两种方法对细胞的综合作用。　结果　改良法诱导的细胞在形态上更具有许旺细胞的长梭形外观 ,抗S 10 0及抗 GFAP阳性率分别由5 8 1%和 60 3 %提高到 79 4%、81 2 % (P <0 0 5 ) ;MTT法细胞活性测定表明改良法对细胞活性影响小(P <0 0 1) ;流式细胞仪DNA含量测定显示S期DNA含量较高 (P <0 0 5 )。　结论　改良法体外诱导骨髓基质干细胞为类许旺细胞具有诱导效果更好 ,对细胞损害小的优越性。     

人TGF-β1基因腺病毒载体的构建及对骨髓基质干细胞的定向诱导分化作用

目的构建人转化生长因子β1(TGF-β1)基因腺病毒真核表达载体,并观察感染骨髓基质干细胞(MSCs)后目的基因的表达和对细胞生物学行为的影响。方法以复制缺陷的腺病毒Adeno-X为基因载体,制备携带TGF-β1基因的高滴度腺病毒液感染人MSCs,通过免疫细胞化学、原位杂交、己糖醛酸水平检测及甲苯胺蓝染色等方法鉴定外源基因的表达,分析TGF-β1基因转染对MSCs定向软骨分化的调控机制。结果腺病毒感染MSCs后免疫细胞化学染色证实外源基因编码蛋白的表达,通过原位杂交检测出Ⅱ型胶原蛋白基因mRNA,细胞培养液中己糖醛酸水平明显升高。结论成功构建人TGF-β1基因腺病毒表达载体,证实其在MSCs中的表达和具有向软骨细胞定向分化的诱导作用,为软骨缺损修复的局部基因治疗奠定实验基础。     

骨髓基质干细胞分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcellsBMSCs) ,又称骨髓间充质干细胞 ,是存在于骨髓中非造血干细胞的另一种干细胞。自 1968年Friendenstein利用BMSCs的粘附性特点 ,对其进行分离、培养 ,及多分化潜能研究以来〔1〕,BMSCs成为现代生物学和医学领域研究的热点。现普遍认为BMSCs是中胚层发育的早期细胞 ,具有多向分化潜能 ,不仅能分化为造血实质 ,支持造血 ,还可分化为多种造血以外的组织细胞 ,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。在实验条件控制下能分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞、肝…     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的 体外诱导犬骨髓基质干细胞(BMSCs)定向分化为软骨细胞，探讨体外诱导成软骨的方法和条件。方法 自犬肋骨取骨髓2～3ml，体外行原代和传代培养扩增，顺序加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)，以培养瓶内较高细胞浓度培养，诱导BMSCs分化为软骨细胞。甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果 诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性；Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论 应用bFGF和TGF-β1体外可以诱导犬BMSCs分化为软骨细胞，诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

腺病毒介导VEGF基因在人骨髓基质干细胞中的表达

[目的] 体外培养人骨髓基质干细胞(hBMSc),将VEGF165基因腺病毒载体共转染hBMSc,观察其表达.[方法] 共转染实验分为3组:VEGF165和eGFP转染组、空腺病毒载体转染组和未转染组.取重组腺病毒Ad-VEGF165(MOI=20 pfu/cell)感染hBMSe.荧光显微镜下观察eGFP的表达,判断感染效率及细胞生长情况,RT-PCR检测,ELISA和Westernblot检测分别用于观察基因转染的表达.[结果] MOI=20 pfu的转染率已达80%以上,取此值为转染滴度.提取出的总RNA质量较好.以双链cDNA为模板扩增VEGF165基因,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,均可见到549 bp(GAPDH)2条带.转染组可见VEGF165表达,空载体组和空白对照组未检测到VEGF165表达.ELISA结果显示基因转染组与转染空载体组和未转染组结果差异呈显著性(P<0.05).Western blot显示:转染组在50 KD处出现特征性条带,而空载体组和空白对照组未见条带.[结论] 外源性VEGF基因在人骨髓基质干细胞(hBMSc)内获得稳定表达,在本实验条件下培养的hBMSc具有典型成骨细胞的形态学特征和较强的生物学活性,向成骨细胞方向分化效率较高,细胞数量可以满足骨组织工程研究的要求.     

嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的诱导分化作用研究

[目的]探讨大鼠嗅神经鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞的诱导分化作用。[方法]通过差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞，在接种培养后的9～12d，收集并制备嗅鞘细胞条件培养液，与纯化培养第3代的骨髓基质干细胞共培养，观察其诱导分化后的形态学变化，免疫荧光染色鉴定诱导分化结果。[结果]发现大鼠嗅鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞有明显的诱导分化作用，在72h时荧光显微镜下观察并计算MAP-2和GFAP阳性细胞的比率分别为55％、23％。[结论]大鼠嗅鞘细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠骨髓基质干细胞向神经样细胞分化的作用。     

TNFR Ⅰ-IgGFc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及其在骨髓基质干细胞的表达

目的 构建携带人肿瘤坏死因子受体Ⅰ胞外区和IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(Ad-TNFRⅠ-IgGFc),体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨转TNFRⅠ-IgGFc基因的BMSCs治疗类风湿关节炎的可行性.方法 将TNFR Ⅰ-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,重组产生Ad-TNFRⅠ-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染培养至第2代BMSCs,利用RT-PCR、原位杂交、免疫组化方法,检测转染后细胞中TNFRⅠ-IgGFc的转录和表达.结果 成功构建了Ad-TNFRⅠ-IgGFc,感染性滴度达3×1010 TCID50/mL,转染后BMSCs在mRNA和蛋白水平均有TNFRⅠ-IgGFc表达.结论 构建的Ad-TNFRⅠ-IgGFc可有效转染BMSCs,并在其中高效表达,为将表达TNFRⅠ-IgGFc基因的BMSCs用于类风湿关节炎治疗的实验研究提供了基础.     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为表皮细胞的实验观察

目的:研究表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)加条件培养基体外诱导大鼠 MSCs 向表皮细胞定向分化的可行性。方法:采用 Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液分离扩增大鼠骨髓 MSCs,免疫细胞化学染色及流式细胞仪进行鉴定。传至第3代的大鼠 MSCs 用表皮生长因子(EGF)、条件培养基等定向诱导 MSCs 分化为表皮细胞;免疫细胞化学对细胞角蛋白 CK5/8、19(Cytokeratin5/8、19)阳性表达细胞进行检测。结果:从大鼠骨髓中分离培养的 MSCs 增殖能力强,细胞表面标志 CD34、CD45阴性,CD29、CD44阳性,流式细胞仪检测显示细胞纯度高,诱导后7d 细胞免疫化学显示角蛋白5/8、19染色阳性,具有表皮细胞特征。结论:从大鼠骨髓中分离培养出的问充质干细胞,具有自我更新和增殖能力强的特点,经诱导可定向分化表达角蛋白。     

椎间盘髓核细胞中Sox9与Ⅱ型胶原基因表达的关系

目的：探讨椎间盘髓核组织中Sox9基阏表达的变化及其与Ⅱ型胶原基因表达的关系。方法：将30个椎间盘组织按Thompson分期分为Ⅰ～Ⅳ期．应用RT—PCR、Westernblot和免疫组化方法检测各期间盘组织巾Sox9、Ⅱ型胶原基因的mRNA和蛋白表达：应用SPSS10，0统计学软件．采用单闪素方差分析、t检验和Pearson相关性检验分析两者的相互关系。结果：椎间盘髓核组织巾Sox9mRNA的表达量在总体上低于Ⅱ型胶原，Sox9蛋白表达位于细胞核中而Ⅱ型胶原主要位于细胞间质内，Sox9在ThompsonⅠ期椎间盘的细胞核内表达很强而存Ⅳ期则很弱甚至缺失：从ThompsonⅠ-Ⅳ期两种基因的mRNA和蛋白表达水平均逐渐降低，各分期间有显著性差异（P〈0．05）。ThompsonⅠ～Ⅳ期标本巾Ⅱ型胶原与Sox9表达量的下降趋势相近。结论：Sox9和Ⅱ型胶原基因表达水平与Thompson分期密切相荚，随椎间盘退变程度加重表达逐渐降低，且两者下降趋势相近。     

慢病毒介导的Sox9基因在兔骨髓间充质干细胞的过表达促进软骨损伤修复

目的:明确在体内Sox9基因过表达的兔骨髓间充质干细胞对于关节软骨损伤修复的作用。方法:以慢病毒介导的Sox9基因转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),体外检测软骨特异性分子,将新西兰大白兔24只48个膝关节随机分为3组,动物麻醉后,双侧股骨滑车处的关节面上用直径4 mm的钻头钻孔,深度3 mm,穿透软骨下骨,造成全层关节软骨损伤,将转染后的细胞植入体内用以修复全层关节软骨损伤,实验组植入BMSCs-(Lenti-Sox9-EGFP)-藻酸钙复合物,实验对照组植入BMSCs-藻酸钙复合物,空白对照组只钻孔。术后6、12周分别进行光镜、电镜观察,以及HE、免疫组织化学染色检测软骨的修复程度。结果:经Sox9基因转染后的细胞在3 d时,Sox9基因表达最高,随后下降。转染后3 d,Ⅱ型胶原开始表达,到14 d时达到最高。表明Sox9过表达启动了兔骨髓间充质干细胞的软骨分化。组织学观察显示,实验组术后6周缺损处有透明软骨样组织填充,术后12周缺损处软骨和软骨下骨修复良好。两对照组,缺损处由纤维组织填充。免疫组织化学显示,修复组织内Ⅱ型胶原,免疫组化染色结果阳性强于两对照组。组织学评分结果显示实验组软骨损伤修复各时间点效果明显优于两对照组,差异有统计学意义。结论:Sox9基因过表达的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)促进软骨损伤的修复。     

青少年特发性脊柱侧凸患者软骨细胞中Sox9的表达及意义

目的:检测转录因子Sox9在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者软骨细胞中的表达,探讨其在AIS患者生长发育异常中的可能作用.方法:14例(男1例,女13例)年龄10～16岁(平均13.1岁)的AIS患者(AIS组),Cobb角41°～88°,平均51.4°;8例(男1例,女7例)非AIS患者(对照组),年龄10～15岁,平均12.9岁;腰椎骨折1例,脊髓室管膜瘤1例,腰椎间盘突出症1例,脊柱骨样骨瘤1例,先天性髋关节脱位4例.在行手术治疗时获取髂骨生长板软骨,采用酶消化法体外分离、培养、传代,并观察细胞形态;采用Ⅱ型胶原细胞免疫组织化学法对传至P2代的细胞行表型鉴定;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测两组软骨细胞中Sox9 mRNA及蛋白表达情况.结果:酶消化法体外单层培养软骨细胞成功;细胞传至P2代时具有软骨细胞的典型形态特征,呈多角状;Ⅱ型胶原细胞免疫组化染色呈阳性,细胞胞浆内可见棕褐色颗粒,很好地保持了软骨细胞的表型特征;AIS组患者软骨细胞中Sox9核酸表达强度为1.08±0.14,蛋白表达强度为0.38±0.14,均较对照组高(P<0.05).结论:转录因子SOx9在软骨细胞水平表达强度的异常可能与AIS患者生长发育异常有关.     

小分子干扰RNA诱导HTB-94软骨肉瘤细胞凋亡的研究

目的 利用小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒转染HTB-94软骨肉瘤细胞,观察其在人体软骨肉瘤细胞HTB-94中对肿瘤细胞生长的影响.方法 设计并合成高泳动家族性别决定基因9(Sox9)siRNA,将其转染HTB-94肿瘤细胞,观察肿瘤细胞的Sox9基因的mRNA和蛋白表达、生长曲线和细胞凋亡情况.结果 Sox9 siRNA的插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,Sox9基因的mRNA和蛋白表达降低,HTB-94肿瘤细胞的生长繁殖受到抑制,细胞凋亡增加.结论 Sox9 siRNA表达质粒可以通过稳定转染HTB-94肿瘤细胞,抑制Sox9基因的mRNA和蛋白的表达,抑制肿瘤细胞的生长繁殖,同时使肿瘤细胞凋亡.     

Perlecan is required for the chondrogenic differentiation of synovial mesenchymal cells through regulation of Sox9 gene expression

We previously reported that perlecan, a heparan‐sulfate proteoglycan (Hspg2), expressed in the synovium at the cartilage‐synovial junction, is required for osteophyte formation in knee osteoarthritis. To examine the mechanism underlying this process, we examined the role of perlecan in the proliferation and differentiation of synovial mesenchymal cells (SMCs), using a recently established mouse synovial cell culture method. Primary SMCs isolated from Hspg2^−/−‐Tg (Hspg2^−/−;Col2a1‐Hspg2^Tg/−) mice, in which the perlecan‐knockout was rescued from perinatal lethality, lack perlecan. The chondrogenic‐, osteogenic‐, and adipogenic‐potentials were examined in the Hspg2^−/−‐Tg SMCs compared to the control SMCs prepared from wild‐type Hspg2^+/+‐Tg (Hspg2^+/+;Col2a1‐Hspg2^Tg/−) littermates. In a culture condition permitting proliferation, both control and Hspg2^−/−‐Tg SMCs showed similar rates of proliferation and expression of cell surface markers. However, in micromass cultures, the cartilage matrix production and Sox9 and Col2a1 mRNA levels were significantly reduced in Hspg2^−/−‐Tg SMCs, compared with control SMCs. The reduced level of Sox9 mRNA was restored by the supplementation with exogenous perlecan protein. There was no difference in osteogenic differentiation between the control and Hspg2^−/−‐Tg SMCs, as measured by the levels of Runx2 and Col1a1 mRNA. The adipogenic induction and PPARγ mRNA levels were significantly reduced in Hspg2^−/−‐Tg SMCs compared to control SMCs. The reduction of PPARγ mRNA levels in Hspg2^−/−‐Tg SMCs was restored by supplementation of perlecan. Perlecan is required for the chondrogenic and adipogenic differentiation from SMCs via its regulation of the Sox9 and PPARγ gene expression, but not for osteogenic differentiation via Runx2. © 2016 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 35:837–846, 2017.

     

TSEG-2基因真核表达载体的构建及其在细胞内的表达

目的 构建睾丸特异表达基因2(TSEG-2)的真核表达载体,探讨TSEG-2在细胞中的表达及其生物学功能.方法 以小鼠睾丸组织cDNA为模版,设计携带HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点的引物序列,聚合酶链反应(PCR)扩增基因片段,克隆至携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pEGFP-N1;在阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)的介导下,重组质粒转染体外培养的精母细胞株GC-2spd 48 h后,荧光显微镜下观察TSEG-2基因在细胞内的表达定位,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长活性,AO/EB荧光染色法、Hoechst 33258荧光染色法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR测定Fas、bcl-2、bax表达水平.结果 成功构建了TSEG-2与EGFP的融合表达载体pEGFP-TSEG2,转染GC-2spd细胞后可见胞质内绿色荧光蛋白表达.转染pEGFP-TSEG2 48 h后,GC-2spd细胞生长抑制39.2%(P＜0.05),出现细胞凋亡形态学改变,凋亡率为28.3%(P＜0.05);GC-2spd细胞中Fas和bcl-2的表达分别下调17.9%、64.8%(P＜0.05),而bax的表达上调25.1%(P＜0.05).结论 成功构建TSEG-2基因的真核表达载体,能在精母细胞株中表达并促进细胞凋亡.     

Sox9、CTGF及BMP-2对促进腱骨结合处早期愈合的研究

[目的]观察SRY相关高迁移组box基因9蛋白(Sox9)及结缔组织生长因子(CTGF)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)在促进腱骨结合处愈合的作用。[方法]72只成年新西兰大白兔随机分为Sox9组、CTGF组、BMP-2组及对照组。Sox9组、CTGF组、BMP-2组分别于骨与肌腱的缝合处注入浓度为200 ng/ml的Sox9、CTGF及BMP-2各2 ml,对照组只手术但不注射任何材料。建立动物模型后对四组行动物实验并分别于术后4、8及12周行组织学及生物力学检查,统计学分析结果。[结果]术后第4、8、12周,Sox9组、CTGF组的组织学愈合情况均好于对照组,生物力学分析中Sox9组、CTGF组腱骨愈合界面的横截面积均低于对照组,拉断负荷及极限拉应力均高于对照组(P0.05),而BMP-2组各项指标均与对照组差异无统计学意义。[结论]Sox9以及CTGF组能够促进腱骨结合处的早期愈合,并能够增加其生物力学强度,而BMP-2对骨肌腱结合部位愈合并无明显作用。