5-氮杂-2'-脱氧胞苷诱导肝癌细胞HepG2 RUNX3基因表达及增强药物敏感性

UNX3(PEBP2aC/CBFK3/AML2)为新近克隆的一种候选抑癌基因,该基因在人类多种肿瘤中存在甲基化异常,而抑癌基因启动子及其CpG岛胞嘧啶高甲基化可导致基因表达失活.     

白血病Reh、HL-60、K562细胞系RUNX 3 基因P2启动子甲基化状态与RUNX 3 基因表达

目的: 研究人白血病Reh、HL-60与K562细胞系RUNX 3 基因P2启动子甲基化状态及RUNX 3 基因的表达,分析P2启动子甲基化与基因表达之间的关系。方法: 运用甲基化特异性PCR(MSP)和RT-PCR检测Reh、HL-60与K562细胞系RUNX 3 基因P2启动子的甲基化状态及RUNX 3 基因的表达。结果: Reh及K562细胞系RUNX 3 基因P2启动子甲基化特异性扩增呈阳性,非甲基化特异性扩增呈阴性,RT-PCR扩增呈阴性;而HL-60细胞系相反,甲基化特异性扩增呈阴性,而非甲基化特异性扩增呈阳性,RT-PCR扩增阳性。结论: Reh及K562细胞中存在RUNX 3 基因P2启动子的甲基化,且在不同类型白血病细胞系中的甲基化状态不同。     

5-氮杂胞苷对结肠癌细胞CHD5基因表达及细胞增殖活性的影响

目的研究甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-氮杂胞苷,AZA)对人肿瘤相关基因CHD5(染色质解旋酶DNA结合蛋白5)在结肠癌细胞中的基因转录的诱导作用以及其对细胞增殖的影响。方法 5μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用于Lovo和SW480细胞,连续作用72 h后,用荧光定量PCR(qPCR)检测两种结肠癌细胞系中CHD5mRNA的表达,重亚硫酸盐测序(BSP)法分析启动子区的甲基化状况,MTT法分析5-氮杂胞苷对Lovo和SW480细胞增殖的影响。结果 5μmol/L 5-氮杂胞苷处理Lovo和SW480细胞72 h后,Lovo和SW480细胞中CHD5基因的发生了去甲基化,其mRNA重新表达,细胞生长受到抑制。结论 5-氮杂胞苷能够反转CHD5基因的甲基化状态,调控CHD5 mRNA表达,并能有效地抑制结肠癌细胞的增殖。     

5-Aza-CdR抑制HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对DLK1基因及肝癌细胞系HepG2增殖、侵袭的影响.方法 不同浓度的5-Aza-CdR及PBS作用HepG2细胞后,RT-PCR、Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平;MTT、Transwell和流式细胞术检测HepG2细胞的生长、侵袭力及细胞周期的变化.结果 HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,DLK1 mRNA、蛋白表达量降低;MTT试验显示细胞生长速度依5-Aza-CdR浓度出现不同程度减慢;流式结果表明G1期细胞减少,S期细胞增加,出现S期阻滞;Transwell证实侵袭能力显著降低(P＜0.05).结论 去甲基化药物5-Aza-CdR能有效地抑制DLK1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖、侵袭能力.     

5-脱氧杂氮胞苷对HepG2肝癌细胞恶性表型及caspase-3和bcl-2表达的影响

目的 观察5-脱氧杂氮胞苷(5-aza-CdR)对HepG2细胞株生长抑制和凋亡的影响。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测5-aza—CdR对HepG2细胞的生长抑制;通过Giemsa染色观察细胞贴壁克隆形成率;用流式细胞术分析5-aza-CdR对细胞凋亡的影响;用免疫细胞化学方法检测caspase-3和bcl-2蛋白的表达变化。结果 5-aza-CdR可抑制HepG2细胞株生长,并呈剂量依赖性,第4天时的抑制率最大,可达60．2%,细胞贴壁克隆形成率从36,3vh,下将至17,3％;流式细胞术结果表明8μmol／L5-aza-CdR作用第4天凋亡率为10．26％,与对照相比差异有统计学意义;caspase-3蛋白表达明显增加,而bcl-2蛋白表达则明显下调。结论 5-aza-CdR可抑制HepG2细胞增殖并能促进凋亡,其机制可能是通过恢复某些抑癌基因表达,上调caspase-3蛋白并下调bcl-2蛋白表达。     

5-氮-2’-脱氧胞苷对人卵巢癌细胞SKOV3凋亡及HMLH1和HMSH2表达的影响

目的探讨5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对人卵巢癌细胞系SKOV3增殖、凋亡及错配修复基因HMLH1和HMSH2表达的影响。方法用0.5、5和50μmol/L特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理SKOV3细胞3d,继续常规培养7d后,采用四唑盐(MTT)比色法检测生长活性,流式细胞术分析细胞的凋亡,半定量RT-PCR检测细胞HMLH1和HMSH2 mRNA的表达水平。结果人卵巢癌细胞系SKOV3经0.5、5和50μmol/L5-Aza-CdR处理后,均能明显抑制肿瘤细胞生长。各组细胞的凋亡率分别为10.59%±1.57%、17.52%±1.72%、34.10%±1.45%,显著高于对照组的5.35%±0.86%(P<0.01);且凋亡率与5-Aza-CdR剂量成正相关(F=227.6,P<0.01)。在SKOV3中HMLH1和HMSH2呈弱表达,经5-Aza-CdR处理后mRNA表达量有不同程度的增加,且与药物存在剂量依赖性。结论5-Aza-CdR可逆转卵巢癌细胞系中存在的HMLH1和HMSH2甲基化,DNA错配修复基因甲基化与卵巢癌的发生、发展有关。     

早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响

目的:克隆人早期B细胞因子3 (EBF3)基因,构建真核表达载体pEGFP/EBF3,研究人EBF3对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响.方法:提取人胎盘组织总RNA,采用RT-PCR技术克隆人EBF3基因,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒双酶切鉴定,并进行序列测定.将重组质粒转染HepG2细胞,Western blot确证EBF3-EGFP融合蛋白的表达及亚细胞定位,流式细胞术分析转染细胞周期.结果:成功获得全长人EBF3基因,经双酶切和序列测定鉴定,真核表达质粒pEGFP/EBF3构建正确,将pEGFP /EBF3导入HepG2细胞24小时后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24小时和48小时细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白.转染pEGFP/EBF3后48小时和72小时,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达质粒pEGFP/EBF3,pEGFP /EBF3转染组S期细胞比例高于pEGFP-N1转染组,提示EBF3对人肝癌细胞株HepG2细胞有促进增殖作用.     

SD118-2对人HepG2细胞凋亡影响及机制探讨

目的观察化合物SD118-2对人HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法取对数生长期人HepG2细胞,分为对照组和给药组。给药组分别给予7 mg/L SD118-2处理12、24和48 h,对照组给予相同浓度DMSO。用MTT法检测细胞增殖率,DAPI荧光染色法观察SD118-2处理后细胞形态,流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率及周期阻滞,用流式细胞仪JC-1染色法检测线粒体膜电位(ΔΨm),Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、PARP和C-PARP表达。结果 SD118-2呈时间依赖性抑制人HepG2细胞生长、降低线粒体膜电位、诱导细胞凋亡、阻滞细胞G2期;抗凋亡蛋白BCL-2表达呈时间依赖性减少,促凋亡蛋白BAX、C-PARP表达呈时间依赖性增加;SD118-2对正常肝脏细胞增殖几乎无影响。结论化合物SD118-2具有诱导人HepG2细胞凋亡的作用,并能使细胞周期进程发生变化。     

5-杂氮-2'脱氧胞苷对肝癌细胞SMMC-7721 miR-1247-5p基因表达及其启动子区甲基化的影响

目的观察正常人肝细胞系LO_2和肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p的表达,研究去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p表达及其基因启动子区Cp G岛甲基化水平的影响。方法用不同浓度(0、5和10μmol/L)去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷处理SMMC-7721细胞,用甲基化特异性PCR法检测miR-1247-5p基因启动子区甲基化水平;用SYBR Green qReal Time PCR法检测miR-1247-5p的表达。结果与正常人肝细胞系LO_2相比,肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p表达降低(P0.05)且其基因启动子区Cp G岛甲基化水平高;经去甲基化药物干预后miR-1247-5p的表达较对照组有明显上调(P0.01),且其基因启动子区Cp G岛甲基化水平降低。结论 miR-1247-5p基因甲基化调控可能参与了肝癌的发生。     

扶正解毒通络方对人肝癌HepG2 细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制研究

目的:探讨扶正解毒通络方对人肝癌HepG2 细胞增殖、凋亡的影响及其机制。方法:MTT 法观察细胞增殖能 力;RT鄄PCR 检测细胞内Bax 和Bcl鄄2 mRNA 水平;免疫印迹(Western blot)检测细胞中Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53 及Fas 蛋白水平。结果:扶正解毒通络方能明显诱导减少HepG2 细胞内Bcl-2 基因转录,增加Bax 基因转录;扶正解毒通络方 能明显诱导减少HepG2 胞内Bcl-2 蛋白表达,增加Bax、活化的caspase-3、SIRT3、P53 及Fas 蛋白表达。结论:与正常对照组比 较,正常血清组人肝癌细胞HepG2 细胞内Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、基因及蛋白表达水平无明显改变;与正常血清组比较, 扶正解毒通络方低、中和高剂量含药血清和阳性对照组HepG2 细胞内Bcl鄄2 基因转录减少,蛋白表达减少;Bax 基因转录增 加,蛋白表达增加,活化的caspase鄄3 蛋白表达增加。     

蛋氨酸脑啡肽联合5-氟尿嘧啶对肝癌细胞HepG2的增殖和凋亡的影响

目的 探讨蛋氨酸脑啡肽(methionine enkephalin,MENK)及蛋氨酸脑啡肽联合5-氟尿嘧啶对肝癌细胞HepG2的增殖和凋亡的影响.方法 采用MTS法检测细胞生长的抑制作用;Hoechst33258荧光染色法观察用MENK及MENK联合5-氟尿嘧啶处理后的HepG2细胞的形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 MENK(5 mmol/L)及MENK联合5-氟尿嘧啶(5 mmol/L+0.05 mmol/L)在用药24h后,对肝癌HepG2细胞具有显著的生长抑制作用(t=14.58、40.37,P＜0.05),在用药48 h后,抑制作用也非常明显(t=13.14、29.85,P＜0.05);Hoechst33258荧光染色后,MENK及MENK联合5-氟尿嘧啶处理组的细胞出现典型的凋亡形态学变化;流式细胞仪检测结果显示,与空白组比较,MENK组细胞凋亡率为15.6％(t=3.942,P＜0.05),MENK联合5-氟尿嘧啶处理组的细胞凋亡率为47.7％(t=17.19,P＜0.05).结论 MENK及MENK联合5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞HepG2的生长具有抑制作用,并诱导细胞凋亡,且联合用药组的抑制作用强于单独用药组.     

RUNX3基因表达对判断人乳腺癌预后的价值

目的探讨乳腺癌组织中RUNX3基因的表达及其与乳腺癌生物学特征和预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测RUNX3蛋白在88例乳腺癌、40例乳腺纤维腺瘤和40例乳腺增生病组织中的表达。结果（1）RUNX3在乳腺癌中的阳性表达率为35．23％,明显低于在乳腺纤维腺瘤（85％）及乳腺增生病（87．5％）组织中的表达率,差异具有统计学意义（P〈0．05）。（2）RUNX3蛋白表达与乳腺癌有无浸润、临床分期、淋巴结转移、ER、PR表达相关,而与病人的年龄、肿瘤类型、病理分级无关。（3）RUNX3表达阳性者的：生存率高于表达阴性者的生存率（P〈0．05）。RUNX3阳性表达者,术后生存时间长。结论（1）乳腺癌组织中RUNX3蛋白表达降低,证明RUNX3基因可能作为一个抑癌基因参与乳腺癌的发生。（2）随着乳腺癌的临床进展,RUNX3表达下降。（3）RUNX3在乳腺癌中的表达对评价患者的预后有一定价值。     

CRNDE过表达促进人肝癌细胞系HepG2增殖和迁移

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)结直肠差异性表达基因(CRNDE)对HepG2细胞增殖和迁移能力的影响及作用机制。方法构建CRNDE过表达质粒,进行慢病毒包装后感染HepG2细胞。实验分别设置阴性对照组(LV5/NC)和CRNDE过表达组(LV5/CRNDE)。应用2.5μg/mL嘌呤霉素干预4~5周,筛选出CRNDE过表达HepG2细胞系;CCK8和细胞划痕实验检测细胞的增殖及迁移能力变化;real-time PCR和Western blot检测两组细胞E-cadherin、N-cadherin、Bax和Bcl-2 mRNA及蛋白表达变化。结果与LV5/NC组相比,LV5/CRNDE组CRNDE表达显著升高(P<0.01),且LV5/CRNDE组细胞的增殖和迁移能力均显著提高(P<0.01);同时,LV5/CRNDE组细胞E-cadherin和Bax表达均明显降低(P<0.01),而N-cadherin和Bcl-2表达则明显升高(P<0.01)。结论CRNDE可通过促进N-cadherin和Bcl-2表达,抑制E-cadherin和Bax表达,进而增强HepG2细胞的增殖和迁移能力。     

TIP-6通过诱导细胞自噬抑制培养的HepG2细胞和正常肝细胞增殖

目的:研究7-(4-甲氧基苯基)-5,8a-二苯基-1,2,3,7,8,8a-六氢咪唑[1,2-a]吡啶(TIP-6)对培养的人肝癌HepG2细胞和人正常肝细胞L02增殖的影响.方法:用MTT法和台盼蓝染色法检测TIP-6对细胞增殖的影响;相差显微镜观察细胞形态学的变化;流式细胞术(FCM)分析细胞周期改变;吖啶橙荧光染色观察自噬泡的变化;Annexin V/7-AAD和DAPI染色检测细胞凋亡;DNA电泳检测凋亡梯形带的产生.细胞免疫化学法测定NF-κB的表达.结果:TIP-6浓度为90～200 μLmol/L时,细胞增殖受到抑制,且与浓度、时间有关;当浓度为200 μmol/L、处理72 h时,两种细胞增殖数分别只有对照的12.10%和18.75%,空泡化也随剂量和时间的增加而加剧,空泡数目越来越多、体积越来越大;FCM结果显示,细胞被阻滞在G2/M期,且HepG2比L02细胞敏感.吖啶橙荧光染色证实自噬及自噬性细胞死亡会随着化合物浓度和时间增加而增多;Annexin V/7-AAD、DAPI染色及DNA电泳均证实凋亡并非TIP-6诱导HepG2及L02细胞增殖抑制的主要形式;细胞免疫化学法的结果显示,随着核转录因子NF-κB表达量的上调,自噬泡会随之增加,细胞增殖却相应减少.结论:TIP-6可能诱导自噬抑制培养的肝癌细胞和肝细胞增殖.自噬性细胞死亡可能与NF-κB蛋白的活化有关.     

miR-30a抑制人骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力

目的探讨miR-30a对人骨肉瘤细胞143B侵袭、迁移和细胞活力的影响。方法过表达或抑制miR-30a分别处理人骨肉瘤细胞143B。划痕实验观察细胞划痕愈合能力;Transwell实验检测143B细胞迁移和侵袭能力;MTT实验检测细胞活力;定量PCR实验确认过表达miR-30a腺病毒有效性并且检测RUNX2 mRNA表达;Western blot检测细胞中RUNX2总蛋白表达。结果过表达miR-30a抑制了骨肉瘤细胞143B迁移和侵袭(P0.05),在72 h时,miR-30a明显抑制细胞活力(P0.01);抑制miR-30a的内源性表达后,143B细胞的迁移和侵袭能力增加(P0.05),细胞活力也表现出上升水平(P0.01);同时过表达miR-30a可以抑制RUNX2的蛋白表达,抑制内源性miR-30a后RUNX2蛋白水平表达增加(P0.05)。荧光素酶活性检测,miR-30a可以靶向于RUNX2(P0.01)。结论 miR-30a抑制骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力,其作用可以能是通过抑制RUNX2的表达来实现。     

The role of alkaline phosphatase in intracellular lipid accumulation in the human hepatocarcinoma cell line,HepG2

Inhibition of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNALP) decreases intracellular lipid accumulation in human preadipocytes and the murine preadipocyte cell line, 3T3-L1. Therefore, the current study was performed to determine if TNALP is required for intracellular lipid deposition in the human hepatocyte cell line, HepG2. Intracellular lipid accumulation, TNALP activity and peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) γ gene expression were measured in HepG2 and 3T3-L1 cells in the presence and absence of the TNALP inhibitors levamisole and histidine. Sub-cellular TNALP activity was localized using cytochemical analysis. Both PPARγ gene expression and TNALP activity increased during intracellular lipid accumulation in HepG2 and 3T3-L1 cells. Inhibition of TNALP blocked intracellular lipid accumulation but did not alter expression of the PPARγ gene. In HepG2 cells, TNALP co-localized with adipophilin on the lipid droplet membrane. These data suggest a role for TNALP in lipid droplet formation, possibly downstream from PPARγ, within HepG2 and 3T3-L1 cells.     

miR-181b对肝癌HepG2细胞增殖以及Bcl-2和SP1蛋白表达的影响

目的: 研究miR-181b对人肝癌G2细胞(HepG2)中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和转录因子SP1蛋白及mRNA表达的调节作用,探讨miR-181b对HepG2细胞增殖的影响。方法: 用人工合成的miR-181b相应的双链互补DNA片段,插入miRNASelect^TM pEGP-miR载体中,经测序鉴定后克隆microRNA的高表达质粒;用脂质体将miR-181b高表达质粒转染进HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选获得阳性克隆。用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测该细胞系中Bcl-2和SP1的mRNA和蛋白表达情况。用MTT法检测HepG2细胞增殖的变化情况。结果: Western blotting结果显示miR-181b能够减少Bcl-2和SP1蛋白质的表达,RT-PCR分析显示Bcl-2和SP1 mRNA表达减少。MTT显示转染后细胞的生长速率比未转染的细胞明显减慢。 结论: miR-181b抑制HepG2肝癌细胞增殖, 提示可能与其下调Bcl-2和SP1 的表达有关。     

中药淫羊藿苷抑制肝癌HepG2.2.15细胞增殖和免疫逃逸作用研究

目的:观察中药淫羊藿苷(ICA)对HepG2.2.15细胞增殖及对CD3AK细胞杀伤活性的影响,探讨ICA对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用,为ICA的开发应用提供新的理论和实验依据.方法:MTT法检测细胞增殖和细胞杀伤活性;流式细胞术检测细胞表面分子表达水平和细胞凋亡率.结果:50 μg/mlICA作用HepG2.2.15细胞48、72小时的增殖抑制作用明显,抑制率分别为22.04%、29.68%(P＜0.05),呈时间依赖效应.HepG2.2.15细胞经ICA处理后,FasL的表达率由16.22%显著下降至8.29%,Fas表达率由0.79%提高到1.70%(P＞0.05).ICA可明显抑制HepG2.2.15细胞诱导Jurkat细胞凋亡,凋亡率从46.66%下降为18.20%.ICA处理HepG2.2.15细胞后,不同效靶比的CD3AK细胞的杀伤活性,可分别由对照组的15.81%、35.04%、42.85%显著提高至42.58%、67.55%、88.93%(P＜0.05,P＜0.01),呈效靶比依赖效应.结论:ICA能有效地抑制HepG2.2.15细胞增殖,并有一定时间依赖效应;ICA可下调FasL的表达,上调细胞表面Fas的表达,对HepG2.2.15细胞诱导的T淋巴细胞凋亡作用有一定阻断,逆转肿瘤细胞的免疫逃逸作用;ICA显著增强HepG2.2.15细胞对CD3AK细胞杀伤的敏感性.     

Effects of model organophosphorous pesticides on DNA damage and proliferation of HepG2 cells

Organophosphorous compounds (OPs) are commonly used pesticides. The primary mechanism of OP toxicity is the inhibition of acetylcholine esterase in the nervous system leading to a variety of acute and chronic effects. Recent studies have revealed several other targets of OPs that disturb noncholinergic biological systems. We investigated whether low concentrations of model OPs-methyl parathion (PT), methyl paraoxon (PO), and dimefox (DF)-induce DNA damage and/or affect cell proliferation in human hepatoma HepG2 cells. Genotoxicity of OPs was evaluated using the comet assay. The effect on cell proliferation was tested using the MTT assay and proliferation marker Ki-67 immunocytochemistry. The effects of OPs on mRNA expression of the DNA damage responsivegenes p53, p21, GADD45alpha, and MDM2 were determined using qRT-PCR. PT induced DNA damage at lower concentrations (1 microg/mL) than PO (100 microg/mL), whereas DF did not induce DNA damage. PT and PO caused a reduction of cell proliferation at their highest concentrations (100 microg/mL), while DF increased cell proliferation at all concentrations used (0.01-100 microg/mL). PT and PO upregulated expression of DNA damage responsive genes, while DF upregulated expression of p53, downregulated expression of p21, and had no effect on the expression of MDM2 and GADD45alpha. We conclude that PT and PO are genotoxic, while DF shows mitogenic activity. An important finding of this study is that PT had higher genotoxic potential than PO, which warrants for further investigations to correctly evaluate the hazards of exposure to these chemicals.