改善人工神经支架材料粘附性的研究

目的 探讨改善人工神经支架材料表面粘附性的方法。方法 对聚羟基乙酸细丝支架进行化学和/或生物学修饰处理,通过体外培养方法比较SD乳鼠许旺细胞在不同聚羟基乙酸细丝表面贴壁生长情况。结果 在经化学处理及生物学修饰的聚羟基乙酸细丝表面许旺细胞能良好贴壁生长,仅予生物学修饰的支架材料次之,未经处理的支架材料上罕有许旺细胞粘附。结论 人工神经构建中支架材料表面的粘附性是至关重要的因素,对聚羟基乙酸进行化学处理后再行生物学修饰是改善其粘附性的简单可行、效果确切的方法。     

运用组织工程学原理构建许旺细胞三维培养体系

目的 探讨普通重力和模拟微重力条件下构建许旺细胞三维培养体系的方法。方法 对聚羟基乙酸细丝支架进行化学改性处理后再以层粘连蛋白进行生物学修饰;分别在普通重力和模拟微重力条件下把原代许旺细胞悬液接种在支架材料上,观察许旺细胞的粘附生长情况。结果 两种重力条件下许旺细胞在聚羟基乙酸支架表面都能良好贴壁生长,培养2d时细胞生长稳定、密度适中;模拟微重力条件下许旺细胞在支架表面的分布更均匀。结论 普通重力和模拟微重力环境都适宜构建许旺细胞的三维培养体系,模拟微重力环境可能为有利。     

许旺细胞在支架材料中的三维生长与迁移的研究

目的 研究许旺细胞在聚乳酸(PLA)无纺纤维布及聚羟基乙酸(PLGA)纤维丝上的粘附、三维生长及迁移情况。方法 将许旺细胞／ECM凝胶悬液与PLA无纺纤维布及经胶原、多聚赖氨酸和ECM预处理的PLGA纤维丝复合培养，相差和激光扫描共聚焦显微镜观察许旺细胞在纤维丝中的三维生长和迁移。结果 许旺细胞／ECM悬液，与PLA无纺纤维布复合，随着凝胶的形成，大部份许旺细胞滞留在纤维网孔中，多数细胞和纤维丝贴附，形成多层排列的类似Beungner带状的许旺细胞柱。许旺细胞能贴附在PLGA纤维丝上生长并沿纤维丝移行，ECM凝胶能显著增加贴附和移行细胞数量。结论 ECM凝胶能促进许旺细胞在支架中的黏附、生长与迁移，是构建组织工程化人工神经的良好整合材料。     

聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管和骨髓间充质干细胞构建组织工程神经

[目的]用聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly lactide-co-glycolide acid,PLGA)为原料制备新型神经导管,同时对兔骨髓间充质干细胞与PLGA构建组织工程神经的可行性进行观察.[方法]以聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物和壳寡糖为原料,采用静电纺丝工艺制备中空的PLGA神经导管.通过扫描电镜观察材料的微观结构,排水法测定材料的孔隙率.将兔的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养后与导管共培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况,MTT方法检测细胞在材料上的增殖活性.[结果]PLGA神经导管管壁具有疏松多孔结构,管壁纤维直径为18 μm左右,孔隙率为85.4%±1.6%,MTT结果显示导管无细胞毒性.兔骨髓间充质干细胞在导管表面生长良好.[结论]PLGA神经导管具有良好的孔隙率,生物相容性好,是构建组织工程神经的良好材料.     

用组织工程方法桥接周围神经缺损的实验研究

目的 寻找修复周围神经缺损的新的有效替代材料。方法 将体外培养扩增的许旺细胞接种在生物可吸收材料聚羟基乙酸纤维支架上培养２周,形成一种新的神经桥接物,并对其进行了观察和动物移植试验。结果 发现接种的许旺细胞可在聚羟基乙酸纤维上良好吸附、迁移形成一种新型的、非管状的、具有三维纵向细胞排列和导层粘蛋白通道的组织工程化神经桥接物,用其修复近交的Ｗｉｓｔａｒ大鼠１５ｍｍ坐骨神经缺损时,取得了接近自体神经移     

不同浓度壳聚糖涂层PLGA材料与许旺细胞相容性研究

目的：研究不同浓度壳聚糖涂层聚乳酸／羟基乙酸共聚物（PLGA）材料与许旺细胞（sc）的生物相容性,为构建适合神经再生的导管支架提供研究基础。方法：采用双酶法培养扩增sc,用质量百分比浓度分别为1％,3％,5％,7％的壳聚糖涂层于PLGA材料。将SC与材料浸提液联合培养,并设立对照作比较,观察细胞生长增殖情况,分别在1,3,5,7天取材MTT法检测细胞相对增殖率。将sC接种在各组材料上,用相差显微镜和扫描电镜观察细胞在材料上粘附和生长情况。结果：材料浸提液对sc生长及细胞形态无明显影响,浓度为1％和3％壳聚糖涂层PLGA材料浸提液在第5天和第7天细胞相对增殖率要高于以5％和7％壳聚糖涂层。sc在壳聚糖涂层PLGA材料上粘附紧密,生长增殖良好。结论：壳聚糖涂层PLGA材料与sc生物相容性良好,采用质量浓度为1％～3％壳聚糖涂层有利于sc粘附增殖,较适合构建神经导管组织工程材料。     

可降解材料对外周神经的毒性作用研究

目的 研究聚乳酸、聚羟基乙酸和壳聚糖等可降解材料对正常外周神经有无毒性作用，为研制组织工程化神经筛选相容性好的支架材料。方法 取15只SD大鼠，随机分成3组，打开坐骨神经外膜后，分别将聚乳酸、聚羟基乙酸和壳聚糖植入神经束之间。术后7周取材，观察坐骨神经组织结构的变化以及材料在神经组织内引起的异物反应。结果各组的神经干内均有纤维结缔组织轻度增生，但神经束的形态结构无明显变化；各种材料周围均有纤维假膜形成，假膜内有淋巴细胞和巨噬细胞浸润，而包裹壳聚糖的假膜最厚，细胞浸润最明显。结论 聚乳酸、聚羟基乙酸和壳聚糖对外周神经均无毒性，可作为组织工程化神经的支架材料，但壳聚糖引起的异物反应较聚乳酸和聚羟基乙酸明显。     

修饰后的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物支架与人胚雪旺细胞联合培养的实验研究

目的：探索人体组织工程神经构建的方法。方法：应用鼠尾胶和层粘蛋白包埋纤维状的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物支架与人胚雪旺细胞培养2周，观察细胞在支架上的吸附迁移和生长情况，结果：人雪旺细胞能在共聚物纤维上迁移包裹，雪旺细胞均匀分布于以鼠尾胶和层粘蛋白共同包埋后的纤维之间及吸附在纤维表面，且基质分泌旺盛，结论：人胚雪细胞在修饰后的polyglytin纤维上得到大量扩增，形成的三维立体结构具有人工神经的基本特性。     

聚乳酸管与不同数量高分子材料丝构建人工神经体外研究

目的 探讨不同数量的高分子材料丝对许旺细胞活性的影响。方法 以粘附有许旺细胞的不同数量的高分子材料细丝加入聚乳酸管中，在体外用免疫组化染色和细胞端粒酶活性测定等观察许旺细胞活力情况。结果 在直径为1.8mm，厚度为0.3mm的聚乳酸管中放入480根直径约10μm的高分子材料细丝时许旺细胞活力比放入240根、960根和不放丝组好。结论 在直径为1.8mm厚度为0.3mm的PLA管中加入粘附有许旺细胞的高分子材料细丝构建人工神经时以加入480根丝为最好。     

nHA-PLGA支架材料与兔软骨细胞体外培养的生物相容性研究

目的 研究新型多孔复合支架材料纳米羟基磷灰石(nHA)-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)的生物相容性,探讨其作为骨组织工程支架的可行性.方法 将胎兔膝关节软骨细胞接种于制备的nHA-PLGA复合支架上,体外共同培养后采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测软骨细胞增殖活性,倒置荧光显微镜、扫描电镜观察支架材料表面和孔隙内软骨细胞黏附情况,流式细胞术检测软骨细胞周期情况.结果 实验组(A组)复合支架材料上细胞增殖活性与空白对照组(B组)相比,无统计学差异(P＞0.05);倒置荧光镜、扫描电镜观察显示A组细胞在复合支架材料表面和孔隙内大量黏附、生长,其数量随着共培养时间增加呈几何级增长;流式细胞仪检测显示A组与B组细胞周期差异无统计学意义(P＞0.05).结论 nHA-PLGA多孔复合支架生物相容性好,是一种性能良好的骨组织工程支架材料.     

Expansion and bioabsorption of the self-reinforced lactic and glycolic acid copolymer prostatic spiral stent

PURPOSE: Self-reinforced bioabsorbable stents can be made self-expanding due to the viscoelastic memory of the oriented bioabsorbable materials. A new self-expandable self-reinforced copolymer of lactic/glycolic acid, lactic/glycolic molar ratio 80:20 stent was developed to prevent postoperative urinary retention after procedures that induced prostatic edema. In in vitro experiments the expansion rate has been up to 100% during the first few hours at body temperature. We investigated the expansion rate and biodegradation of the self-reinforced lactic and glycolic acid copolymer prostatic spiral stent in vivo in the prostatic urethra. MATERIALS AND METHODS: A total of 39 men, 52 to 84 years old, with lower urinary tract symptoms due to benign prostatic enlargement underwent interstitial laser coagulation of the prostate. A self-reinforced copolymer of lactic/glycolic acid, lactic/glycolic molar ratio 80/20 stent was inserted into the prostatic urethra at the end of the operation. The stent lumen diameter was 4.5 mm. The location and diameter of the lumen and degradation of the stent were studied with transrectal ultrasound at 1, 2, 4 and 6 months postoperatively. At 6 months patients underwent cystoscopy. RESULTS: All except 1 patient voided on postoperative day 1. Mean lumen diameter was 7.4 mm. (range 6.2 to 8.2) at 1 month and 7.2 mm (range 6.2 to 7.5) at 2 months. At 4 months the stent was degraded into small pieces. No pieces of stent were found in the prostatic urethra on ultrasound or cystoscopy at 6 months. However, a portion of the spiral stent was found at the bottom of the bladder in 2 patients. CONCLUSIONS: The speed and expansion rate of the self-reinforced copolymer of lactic/glycolic acid, lactic/glycolic molar ratio 80/20 stent was sufficient to lock the stent in place and ensure voiding in cases of edema induced bladder outlet obstruction. Strength retention greater than 2 months was long enough to avoid later impairments of voiding.     

组织工程人口腔黏膜的制备及异体移植的临床应用

目的观察自行制备的复层组织工程人口腔黏膜移植后生长情况.方法取3月龄患儿唇裂术中切取的多余口腔黏膜组织,分离成纤维细胞与上皮细胞,分别接种于聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(polylactic/glycolic acid copolymer,PLGA)胶原复合膜上培养,后将其移至气液面进行复合,制成复层组织工程口腔黏膜.7例行口腔内良性肿瘤切除后遗留黏膜缺损的患者,缺损范围为1.8 cm×1.6 cm～3.2 cm×2.6 cm.采用组织工程口腔黏膜修复,术后观察其生长情况.1例志愿者在移植术后18和30 d分别取移植部位黏膜行组织学观察.结果制备的组织工程口腔黏膜生长良好,具有上皮层和上皮下层双层结构,之间为PLGA膜;上皮层5～6层细胞,角蛋白染色阳性,上皮下层3～7层细胞,角蛋白染色阴性.7例患者移植修复术后10 d,组织工程口腔黏膜与创面生长良好,颜色较正常黏膜深;18 d后仍可辨出移植区与正常黏膜;30 d后无法区别界限,创面均Ⅰ期愈合,无明显瘢痕组织.组织学观察:18 d创面上皮层及下方肉芽组织生长良好,毛细血管增生有上皮钉突形成,成纤维细胞卵圆形;30 d胶原化更明显,移植区结构与周边正常组织相似.结论应用组织工程口腔黏膜异体移植修复后,黏膜生长良好,但愈合组织上皮的来源还需进一步研究.     

骨髓基质干细胞与聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸/聚乙二醇体外复合培养的实验研究

目的探讨骨髓基质于细胞（marrow stromal stem cells，MSCs）与聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇[poly（lactic acid／glycolic acid／asparagic acid—co—polyethylene glycol），PLGA—ASP—PEG]的生物相容性，为构建组织工程骨进行骨缺损修复提供理论基础，以及为组织工程支架材料的优化提供实验依据。方法本体开环共聚法合成PLGA—ASP—PEG三嵌段共聚物。取4周龄新西兰大白兔骨髓，体外分离培养MSCs。将第3代MSCs以1．0×10^6／ml接种到PLGA—ASP—PEG材料上，测定细胞黏附力和黏附率；扫描电镜观察细胞的形态学特征；MTT法检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞周期、增殖指数、DNA指数及凋亡；通过考马斯亮蓝测定法和^3H-脯氨酸掺入实验观察细胞的蛋白合成和胶原合成情况。以PLGA支架材料作为对照。结果MSCs在PLGA—ASP—PEG支架材料上贴附、生长良好，其黏附、增殖和蛋白、胶原合成能力均显著高于PLGA组（P〈0.05），细胞凋亡率显著低于PLGA组（P〈0.05）。DNA指数显示两组细胞均为正常的二倍体细胞。结论PLGA—ASP—PEG的生物学性能与PLGA相比得到显著改善和提高，可作为MSCs的理想载体构建组织工程骨进行骨缺损修复研究。     

人工神经的研究进展

目的 探讨组织工程化周围神经研制工作中神经导管材料和雪旺细胞移植的有关问题。方法 广泛查阅近年有关人工神经研究方面的文献,重点叙述在桥接神经缺损的移植体和雪旺细胞移植方面的研究进展。结果 硅胶、涤纶、聚四氟乙烯、聚交酯及几丁质等生物材料均可作为桥接神经缺损的神经导管,以可降解的生物材料较为。在神经导管内放置丝状内支架可增加再生轴突通过的距离。雪旺细胞经体外纯化和培养后仍具有生物活性,将雪旺细胞植入     

Bilaminar Device of Poly(Lactic‐co‐Glycolic Acid)/Collagen Cultured With Adipose‐Derived Stem Cells for Dermal Regeneration

Several materials are commercially available as substitutes for skin. However, new strategies are needed to improve the treatment of skin wounds. In this study, we developed and characterized a new device consisting of poly(lactic‐co‐glycolic acid) (PLGA) and collagen associated with mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue. To develop the bilaminar device, we initially obtained a membrane of PLGA by dissolving the copolymer in chloroform and then produced a collagen type I scaffold by freeze‐drying. The materials were characterized physically by gel permeation chromatography, scanning electron microscopy, and mass loss. Biological activity was assessed by cell proliferation assay. A preliminary study in vivo was performed with a pig model in which tissue regeneration was assessed macroscopically and histologically, the commercial device Integra being used as a control. The PLGA/collagen bilaminar material was porous, hydrolytically degradable, and compatible with skin growth. The polymer complex allowed cell adhesion and proliferation, making it a potentially useful cell carrier. In addition, the transparency of the material allowed monitoring of the lesion when the dressings were changed. Xenogeneic mesenchymal cells cultured on the device (PLGA/collagen/ASC) showed a reduced granulomatous reaction to bovine collagen, down‐regulation of α‐SMA, enhancement in the number of neoformed blood vessels, and collagen organization as compared with normal skin; the device was superior to other materials tested (PLGA/collagen and Integra) in its ability to stimulate the formation of new cutaneous tissue.     

A Schwann cell-seeded intrinsic framework and its satisfactory biocompatibility for a bioartificial nerve graft.

To optimize the internal environment of a collagen nerve tube, we designed a Schwann cell-seeded intrinsic framework and its biocompatibility was investigated. We fixed 6-0 polyglactin woven filaments (Vicryl) or polydioxanone monofilaments (PDS) on a silicone ring in a net fashion. It was coated with matrigel and then incubated with cultured newborn or adult Schwann cells. Furthermore, we implanted 1.5-cm-long filament-filled collagen tubes in a rat model. Using a live/dead fluorescent assay and electron microscopy, we found that adherent Schwann cells onto filaments remained viable and oriented longitudinally along filaments. The preliminary in vivo study indicated that a mild inflammatory reaction was present around the tube wall. However, nerve regeneration occurred around and between filaments. We concluded that the arrangement of Schwann cell columns onto filaments was achieved, mimicking Bünger bands. It was shown that the biomaterials did not impede nerve regeneration.     

骨髓干细胞诱导分化构建组织工程神经

[目的]探讨组织工程化神经修复周围神经缺损的作用。[方法]以DMEM为培养基体外诱导人骨髓基质干细胞分化为雪旺细胞，与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经；建立坐骨神经缺损10mm的Wistar大鼠动物模型，A组：经诱导骨髓基质干细胞分化雪旺细胞与天然细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）凝胶及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经桥接神经缺损；B组：单纯将ECM凝胶注入可降解聚乳酸导管桥接神经缺损；C组：自体神经移植组。术后12周进行神经电生理检测、新生神经组织学观察和轴突计数等检测坐骨神经功能恢复情况。[结果]1．诱导后骨髓基质干细胞呈梭形、胞核大、周围有光晕、突起细长呈纵形排列，GAFP及S-100免疫组织化学染色阳性。动物模型各组经移植术后12周，再生神经已通过缺损区长至神经远端。A组、C组组织学及电生理检测指标均优于B组（PAB=0．021，PBC=0．001），A组与C组无显著性差异（PAC=0．065）；A、B组聚乳酸导管降解吸收明显。[结论]骨髓基质干细胞在体外可诱导分化为雪旺氏细胞，利用其与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经可以修复周围神经缺损。     

兔雪旺细胞的培养方法及形态学研究

利用兔坐骨神经组织进行体外细胞培养研究，获得了雪旺细胞。兔雪旺细胞的形态与其他文献报道的鼠或人的外周神经培养获得的雪旺细胞形态基本相似，典型的雪旺细胞形态特征为胞体较小、梭形、两侧突起纤长、核窄长。倒置显微镜下看，胞体四周常有亮边，细胞成极性生长排列。通过免疫组织化学染色证实具有典型形态的梭状细胞为雪旺细胞，而扁平状形态不规则的细胞为成纤维细胞     

雪旺细胞种于医用组织引导再生胶原膜构建自体人工神经的实验研究

目的;设计并构建一种新型的神经引导导管。方法：将兔雪旺细胞种到用成粘蛋白多孔医用组织引导的再生胶原膜支架培养2周后,用倒置显微镜、扫描电镜观察雪旺细胞吸附、生长迁移情况;以雪旺细胞胶原膜管的形式植入体内,观察它诱导神经再生的能力。结果：成年兔雪旺细胞在医用组织引导再生胶原膜上生长良好,并均匀分布于支架表面,且基质分泌旺盛。体内模型发现神经已通过移植物长入远端,胶原膜已吸收。结论：雪旺细胞可以在多聚医用组织引导再生胶原膜上得到扩增,种有雪旺细胞的医用组织引导再生胶原膜导管可以形成一个诱导神经轴突再生的微环境,形成的三维立体结构具有人工神经的基本特性,为组织工程方法修复长段神经缺损提供了研究基础。     

从小鼠脂肪组织中分离纯化雪旺细胞的实验研究

目的 探索从新生小鼠脂肪组织中分离纯化雪旺细胞的可行性.方法 取新生(出生5～7 d)绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠的腹股沟皮下脂肪,采用0.2%的复合胶原酶NB4消化法分离获取细胞,然后用含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培养基培养.用0.1%的复合胶原酶NB4差速分离纯化雪旺细胞,每48 h纯化1次,共进行2次纯化.用p75免疫荧光法鉴定雪旺细胞并分析其纯度.结果 从小鼠腹股沟皮下脂肪中分离纯化获得的细胞是雪旺细胞,经过2次纯化,其纯度可达90%.结论 从小鼠脂肪组织中可以分离纯化获得雪旺细胞,为组织工程人工神经种子细胞提供一种新的来源.