自噬基因Beclin1在卵巢癌SKOV3细胞中对PI3K/AKT信号通路的影响及其与紫杉醇耐药关系实验研究

目的:探究自噬基因Beclin1在卵巢癌SKOV3细胞中对PI3K/AKT信号通路的影响,并分析其与紫杉醇耐药的关系.方法:以人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TXA作为研究对象,构建自噬基因Beclin1真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,并通过试剂盒将其转染至SKOV3细胞中.采用MTT实验测定各组细胞...     

PTEN基因转染对卵巢癌SKOV3细胞生长抑制和诱导凋亡的研究

目的研究外源性PTEN基因转染对人卵巢癌SKOV3细胞生长增殖抑制和凋亡诱导作用,探索卵巢癌的新治疗方法。方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体pBP转染卵巢癌SKOV3细胞,实验分组为pBP-PTEN、pBP和SKOV3组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察对SKOV3细胞的生长抑制作用,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测转染后对SKOV3细胞的凋亡诱导作用,Annexin V/PI双染荧光显微镜观察细胞凋亡形态。结果MTT检测,0.1、0.2和0.3μg/孔PTEN质粒DNA转染SKOV3细胞48 h,生长抑制率分别为13.31%、27.67%、42.25%,不同时间点(24、48和72 h)检测,细胞生长抑制率存在剂量-时间依赖关系。光镜观察,转染24 h后即可见明显的形态学改变。流式细胞术检测,4μg/孔PTEN质粒DNA转染SKOV3细胞24和48 h后,细胞凋亡率分别达38.08%和65.60%(P<0.01)。Annexin V/PI双染荧光显微镜观察,细胞凋亡率存在时间-剂量以来关系。结论PTEN基因转染抑制人卵巢癌细胞增殖并显著诱导细胞凋亡。     

c-raf-1反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

目的：探讨c-raf-1基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV，细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法：实验分3组：正常对照组、c-raf-1正义治疗组、c-raf-1反义治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定，以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果：反义治疗组与正义治疗组比较：转染72h OD值分别0．272与1．307（P〈0．05）；克隆形成率分别为30．6％与75．0％（P〈0．05）；凋亡率分别为19．7％与9．2％（P〈0．05），同时明显地下调P74蛋白质的表达水平（P〈0．05）。结论：c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV，细胞的增殖有明显的抑制作用。     

PAI-1对卵巢癌上皮细胞SKOV3生物学行为的影响

目的 探讨PAI-1基因在体外实验中对卵巢癌细胞SKOV3生物学行为的影响.方法 将PAI-1基因转到入人卵巢癌细胞SKOV3中,通过细胞生长曲线、细胞克隆形成实验、流式细胞仪检测细胞周期,测定细胞侵袭迁移黏附能力,研究PAI-1基因在卵巢癌上皮细胞SKOV3中的功能.结果 PAI-1基因被转入靶细胞中并稳定表达,We...     

hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究

目的 探讨错配修复基因hMLH1对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用及其机制.方法 分别用重组质粒pcDNA3.1-hMLH1和空质粒pcDNA3.1转染SKOV3/DDP细胞.RT-PCR和Western blot检测hMLH1的表达.MTT检测转染前后SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性的变化.经顺铂DDP作用后,流式细胞术和Western blot法检测细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,瞬时转染24 h后,SKOV3/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05).MTT结果显示,转染细胞的IC50值(13.95±2.45)较未转染的细胞(94.16±5.18)明显减小.流式细胞仪和Western blot检测结果表明,顺铂作用24 h后,转染了重组质粒的耐药细胞的凋亡率提高到(33.33±2 31)%,同时凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达受到抑制(1.35±0.39),与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 hMLH1基因能增强卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与降低该耐药细胞内Bcl-2的表达水平,促进细胞凋亡有关.     

正常人CIK细胞对卵巢癌SKOV3ip细胞抗肿瘤的活性

目的　观察正常人CIK(cytokine inducedkiller)细胞对人卵巢癌细胞株SKOV3ip的体外细胞毒活性以及对卵巢癌腹水瘤模型的体内抗肿瘤作用。方法　取正常人的外周血单个核细胞 (PBMC) ,加入细胞因子γ IFN、IL 2、抗 -CD3单抗和IL - 1,体外诱导成CIK细胞 ,用MTT法测定CIK细胞体外对人卵巢癌细胞株SKOV3ip的细胞毒活性 ,并与CD3AK作对比。在Babl/c裸小鼠腹腔内接种卵巢癌SKOV3ip细胞 ,观察CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用。结果　体外实验证明 ,CIK细胞对SKOV3ip有明显的细胞毒活性 ,对比CD3AK其抑瘤率为 89.7%与 6 7.1% (P <0 .0 5 )。裸鼠卵巢癌腹水瘤模型体内实验表明 ,CIK细胞能够显著抑制癌性腹水生长 ,其抑制率可达 10 0 %。结论　CIK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞 ,具有较强的体内外抗卵巢癌细胞活性 ,具有明显的抑制癌性腹水生长的作用 ,有可能用于临床上卵巢癌腹水的过继性免疫治疗     

真核表达Survivin基因对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响

目的探讨Survivin基因对卵巢癌细胞紫杉醇（Taxol）敏感性的影响。方法构建Survivin正义全长真核表达质粒（pcDNA3．1-Survivin），经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780，以转染pcDNA3．1空载体的A2780细胞为对照。RT—PCR和蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测Survivin mRNA和蛋白质的表达；MTT比色法检测紫杉醇对两组细胞存活率的影响；流式细胞仪（FACS）检测细胞凋亡率。结果①RT—PCR和Western blot检测提示转染pcDNA3．1-Survivin组中Survivin mRNA和蛋白质表达明显高于空载体组。②MTT比色法和FACS检测提示转染pcDNA3．1-Survivin组细胞存活率明显高于空载体组，细胞凋亡率明显低于空载体组，差异均有显著性意义（P〈0．05）。pcDNA3．1-Survivin转染后的A2780细胞对紫杉醇的敏感性明显降低。结论卵巢癌对紫杉醇的耐药性可能与Survivin基因表达有关。     

氯化钴对人卵巢癌SKOV3细胞顺铂敏感性的影响

目的：观察氯化钴（CoCl₂）作用于人卵巢癌SKOV3细胞株后对SKOV3细胞顺铂敏感性的影响,并阐述其可能机制。方法：体外培养SKOV3细胞株,随机分为对照组、CoCl₂组、顺铂（DDP）组和CoCl₂联用DDP （联合）组,CoCl₂组细胞以200 μmol·L^-1 CoCl₂作用4 h后换普通细胞培养基培养20 h,DDP组细胞以含10 mg·L^-1 DDP的细胞培养基培养24 h,联合组细胞以200 μmol·L^-1 CoCl₂作用4 h后更换含10 mg·L^-1 DDP的细胞培养基继续培养20 h。MTT法检测各组细胞存活率,免疫荧光法检测各组细胞中低氧诱导因子1α（HIF-1α）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性表达强度,Rhod 2-AM荧光探针检测各组细胞线粒体钙离子（Ca²⁺）水平,免疫蛋白印迹（Western blotting）法观察凋亡相关蛋白细胞色素C （cyto C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase3）蛋白表达水平,Muse^®凋亡试剂盒检测各组细胞凋亡率。结果：与对照组比较,CoCl₂组细胞存活率无明显变化（P>0.05）,其余2组细胞存活率明显下降（P<0.05）;且联合组高于DDP组（P<0.05）。与对照组比较,CoCl₂组和联合组细胞中HIF-1α阳性表达强度明显增强（P<0.05）;DDP组和联合组细胞中iNOS阳性表达强度明显增强（P<0.05）。与对照组比较,DDP组和联合组细胞Ca²⁺水平升高（P<0.05）;且DDP组高于联合组（P<0.05）。与对照组比较,CoCl₂组细胞中cyto C、caspase3和cleaved caspase3蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,DDP组细胞中cyto C、caspase3和cleaved caspase3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;且联合组低于DDP组（P<0.05）。与对照组比较,DDP组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）;联合组细胞凋亡率较DDP组降低（P<0.05）。结论：CoCl₂可以通过抑制DDP诱导的人卵巢癌SKOV3细胞株iNOS表达增强来减少线粒体途径凋亡的发生,降低其顺铂敏感性。     

紫杉醇对人卵巢癌细胞凋亡的影响

目的 :探讨紫杉醇 (PTX)对人卵巢细胞凋亡的影响。方法 :应用细胞形态观察、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪、活细胞视频观察和蛋白印迹免疫法进行检测和观察。结果 :癌细胞在PTX作用下 ,首先表现为G2 /M期阻滞 ,一定时间后出现细胞凋亡。凋亡细胞表现为细胞固缩 ,核染色质凝聚或断裂。细胞DNA裂解片段呈现典型的“阶梯状”排列的条带。凋亡抑制基因Bcl- 2在细胞凋亡过程中呈低表达并发生修饰反应 ,而调亡诱发基因Bax先呈高表达后表达降低。结论 :PTX诱发人卵巢癌细胞的凋亡与细胞分裂阻滞密切相关 ,Bcl- 2和Bax在PTX引起人卵巢癌细胞凋亡中可能起着重要的调控作用。     

茶多酚诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡及其机制的研究

目的卵巢癌手术、传统化疗和放疗技术虽然有所改进,但患者5年生存率仍不超过20%。已有研究证明茶多酚具有抗肿瘤和抗氧化作用。文中主要探讨茶多酚对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用和诱导SKOV3细胞凋亡的作用及其作用机制。方法采用MTT比色法检测不同浓度的茶多酚对卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制作用;应用荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ(FITC-AnnexinⅤ)联合流式细胞凋亡定量检测技术(PⅠ双染色)检测茶多酚对SKOV3细胞凋亡发生率的影响,同时应用PI染色技术分析茶多酚对SKOV3细胞分裂周期的影响;利用荧光探针DCFH-DA对细胞内活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)水平进行检测。结果茶多酚对SKOV3细胞的生长有明显的抑制作用,不同剂量茶多酚组的抑制率与空白对照组比较有显著差异(P<0.01)。AnnexinⅤ/PⅠ双染色法观察到药物浓度与细胞凋亡发生呈正相关,即随着药物浓度的增加细胞凋亡率增加,在200μmol/L的时候几乎所有的细胞都发生了凋亡。随着药物浓度的增加处于G0/G1期细胞减少,多数细胞阻滞在细胞周期的S期,从而阻断细胞周期向G2/M期进行,当药物浓度达到200μmol/L时,出现明显凋亡峰。利用荧光探针DCFH-DA对细胞内ROS水平进行检测发现随着茶多酚浓度增高细胞内ROS水平显著增高,不同剂量茶多酚组细胞内ROS水平与空白对照组比较有显著差异(P<0.01)。结论茶多酚在体外可剂量依赖性地抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,诱导细胞凋亡,推测ROS水平的增高可能是导致卵巢癌SKOV3细胞凋亡的原因,为筛选治疗卵巢癌的化疗药物提供新的参考依据。     

shRNA沉默Bmi-1质粒构建及对鳞癌细胞ECA109增殖的影响

目的 研究shRNA沉默Bmi-1基因对鳞癌细胞ECA109增殖变化的影响,探讨Bmi-1基因在鳞癌细胞增殖中的作用。方法 采用RT-PCR和Western blot法分别检测Bmi-1在Fibroblast细胞、Hacat细胞、A431细胞、ECA109细胞中的表达。构建重组质粒GPU6/GFP/Neo-shBmi-1,脂质体转染ECA109细胞后,检测细胞中Bmi-1表达变化。MTT法检测转染前后细胞抑制率,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果 与Fibroblast细胞和Hacat细胞相比,Bmi-1在鳞癌细胞系A431、ECA109中含量明显升高。重组载体GPU6/GFP/Neo-shBmi-1构建成功,转染ECA109细胞后Bmi-1表达明显降低(P＜0.05)。与对照组相比,转染后细胞增殖明显受到抑制(P＜0.05);G1期细胞明显增加(P＜0.05),S期细胞明显减少(P＜0.05)。结论 Bmi-1与细胞恶性增殖相关。在ECA109细胞中沉默Bmi-1,可改变细胞周期,从而抑制细胞增殖。     

hTGF-β3的构建及其在前软骨干细胞的瞬时表达

目的 为骺板损伤的基因治疗创造条件,构建人转化生长因子的真核表达载体,并转染大鼠前软骨干细胞(PSCs),以获得组织工程的种子细胞.方法 通过基因工程的方法重组构建pcDNA3.1( )-hTGF-β3真核表达载体并鉴定,免疫磁珠法分离纯化大鼠前软骨干细胞后,用纳米级的高分子聚合物线性化的聚乙烯亚胺共转染pcDNA3.1( )-hTGF-β3与pcDNA3.1-EGFP,观察和检测瞬时转染后的表达情况.结果 重组质粒经过酶切电泳和测序鉴定证实构建成功,共转染后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,RT-PCR和ELISA 可以检测到有目的 基因的表达.转染后培养液上清中TGF-β3 蛋白含量开始上升,在72 h达到高峰,以后逐渐下降.结论 真核表达载体hTGF-β3的重组质粒构建正确,并成功转染PSCs,为骺板损伤的组织工程学修复提供了新的选择.     

重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 体外构建携带报告基因胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)的重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF,并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法 采用密度梯度离心法分离获得BMSCs,进行细胞免疫化学鉴定;应用PCR技术获得HSV1-TK、内部核糖体进入位点(IRES)、BDNF的cDNA序列,酶切后依次插入到pcDNA3.1的多克隆位点(MSC)中,酶切和序列分析鉴定;脂质体介导重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs,RT-PCR和Western blot检测其目的 基因表达.结果 重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF经酶切和序列分析鉴定与预期设计一致;RT-PCR和Western blot检测证实TK和BDNF在IRES介导下可同时表达.结论 成功构建重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF并在BMSCs中有效表达,为下一步核素活体示踪转基因BMSCs治疗脑血管疾病奠定了实验基础.     

真核表达载体pcDNA3-FHIT的构建及其在COS-1细胞中瞬时表达

目的 :构建FHIT基因的真核表达载体及测定其在COS 1细胞中的瞬时表达。方法 :应用RT PCR方法从正常人甲状腺组织中克隆出FHIT基因 ,在KpnⅠ和 BstXⅠ两个酶切位点插入真核表达载体 pcDNA3中 ,通过酶切分析、基因测序和免疫细胞化学方法鉴定插入基因片段的正确性。结果 :FHIT基因在载体 pcDNA3中插入的位点是正确的 ,没有缺失、插入等突变 ,并在COS 1细胞中有较高的瞬时表达。结论 :成功构建了FHIT基因的真核表达载体 ,并获得其在COS 1细胞中较高的瞬时表达 ,为该基因在基因治疗中的研究提供了有力的分子工具     

人源Dickkopf-1真核表达质粒的构建

目的构建人源Dickkopf-1（DKK-1）基因的真核表达质粒,为进一步探讨DKK-1的生物学功能奠定基础。方法Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-1的基因序列,将真核表达载体pcDNA3.1和DKK-1的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-DKK-l,转化至大肠杆菌后经菌落PCR、NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。结果RT-PCR法从人胎盘中扩增出816bp大小的目的片段,重组质粒转化至大肠杆菌后菌落PCR同样扩增出816bp大小的目的片段,NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒能切出两条目的条带,测序后与Genbank中DKK-1的cDNA对比,证明DKK-1的基因序列完全正确。结论成功构建了pcDNA3.1-DKK-1重组质粒,为研究人源DKK-1的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础。     

Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA序列(CDS),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GFP-Pin1蛋白的表达。结果RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌HeLa细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GFP-Pin1蛋白高表达;经G418筛选获得单细胞克隆。结论重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。     

重组pEGFP/Ang-1质粒转染兔骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的 制备稳定高效表达血管生成素-1(Ang-1)的转基因工程骨髓基质干细胞。方法 应用基因重组的方法构建Ang-1真核表达质粒pEGFP／Ang-1，利用脂质体将pEGFP／Ang-1转入骨髓基质干细胞，用流式细胞仪检测转染率，用荧光显微镜和免疫细胞化学方法检测蛋白质的表达。结果 质粒酶切电泳显示重组质粒构建成功，转染pEGFP／Ang-1质粒的骨髓基质干细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光；流式细胞仪检测转染率约50％；免疫细胞化学检测可见转基因骨髓基质干细胞表达Ang-1蛋白。结论 成功制备表达外源性基因Ang-1的骨髓基质干细胞，制备方法是可行的。     

HMGB1基因真核细胞表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

  目的 构建HMGB1基因真核细胞表达载体并检测其在真核细胞中的表达?方法 提取人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)mRNA,反转录为cDNA?PCR 扩增HMGB1全长编码基因,构建成pcDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1真核细胞表达载体?转染HUVEC,Western blot 检测转染后HMGB1基因的表达改变?结果 构建HMGB1全长基因真核细胞表达载体成功,酶切鉴定及测序鉴定表明载体构建正确,转染HUVEC后可检测到外源性蛋白的表达,对照组无外源性蛋白表达?结论 成功构建了HMGB1全长基因真核细胞表达载体并可转染至HUVEC中     

Stat3 mRNA靶向MicroRNA重组质粒的构建及其在HepG2肝癌细胞系中的表达

目的构建并筛选靶向信号转导和转录激活因子3（Stat3mRNA）的微小RNA（MicroRNA）表达质粒。观察其在肝癌细胞系HepG2中对Stat3表达的影响。方法针对人Stat3mRNA设计3条MicroRNA序列,经退火成互补双链,将双链DNA插入线性质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒中,分别构建重组表达质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3等3组质粒,并测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至人肝癌HepG2细胞中,观察转染效果。RT-PCR和Western blot分别检测Stat3mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力。结果成功构建靶向Stat3的MicroRNA重组质粒,经测序证实插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致,转染人肝癌HepG2细胞后,荧光显微镜下可观察到带有绿色荧光的HepG2细胞。流式细胞仪检测3组质粒的转染效率分别为：76%、73%和63%。RT-PCR分析pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3的抑制率分别为：73.5%、47.2%和39.6%,下调Stat3蛋白的比例分别为：89.1%、71.6%、67.3%。其中pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1的下调效应最明显。MiR-1质粒转染组的细胞凋亡率升高,增殖受抑制,与阴性对照质粒组和未转染组比较,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）。结论成功构建了靶向Stat3的MicroRNA表达质粒,其对肝癌HepG2细胞Stat3的表达及增殖有显著抑制。     

FUS1和IL-12双基因真核共表达质粒的构建及对A549细胞促凋亡作用研究

目的 构建FUS1和人IL-12双基因真核共表达质粒并在肺癌A549细胞中检测基因表达及诱导细胞凋亡作用.方法 采用RT-PCR技术从人肺成纤维细胞MRC-5中逆转录扩增全长FUS1基因,通过PCR技术从pORF-hIL-12质粒中扩增含双亚基的全长IL-12基因.FUS1和IL-12分别经酶切后定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点中,酶切和测序鉴定双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12的构建.以pVITRO2-FUS1-IL-12转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR、ELISA 和Western blot方法 检测目的 基因的表达,以Hoechst33258染色及流式细胞术验证pVITRO2-FUS1-IL-12在体外的促凋亡作用.结果 酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达质粒 pVITRO2-FUS1-IL-12,在转染后的细胞中同时检测到了FUS1和IL-12的表达,两种基因在双基因表达载体上的表达量基本不受影响.双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12具有明显诱导肺癌细胞凋亡的作用.结论 成功构建pVITRO2-FUS1-IL-12双基因真核共表达质粒,为肺癌的多基因联合治疗提供了又一新的思路和方法.