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目的研究外源性PTEN基因转染对人卵巢癌SKOV3细胞生长增殖抑制和凋亡诱导作用,探索卵巢癌的新治疗方法。方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体pBP转染卵巢癌SKOV3细胞,实验分组为pBP-PTEN、pBP和SKOV3组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察对SKOV3细胞的生长抑制作用,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测转染后对SKOV3细胞的凋亡诱导作用,Annexin V/PI双染荧光显微镜观察细胞凋亡形态。结果MTT检测,0.1、0.2和0.3μg/孔PTEN质粒DNA转染SKOV3细胞48 h,生长抑制率分别为13.31%、27.67%、42.25%,不同时间点(24、48和72 h)检测,细胞生长抑制率存在剂量-时间依赖关系。光镜观察,转染24 h后即可见明显的形态学改变。流式细胞术检测,4μg/孔PTEN质粒DNA转染SKOV3细胞24和48 h后,细胞凋亡率分别达38.08%和65.60%(P<0.01)。Annexin V/PI双染荧光显微镜观察,细胞凋亡率存在时间-剂量以来关系。结论PTEN基因转染抑制人卵巢癌细胞增殖并显著诱导细胞凋亡。 相似文献
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目的:探讨c-raf-1基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV,细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法:实验分3组:正常对照组、c-raf-1正义治疗组、c-raf-1反义治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定,以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果:反义治疗组与正义治疗组比较:转染72h OD值分别0.272与1.307(P〈0.05);克隆形成率分别为30.6%与75.0%(P〈0.05);凋亡率分别为19.7%与9.2%(P〈0.05),同时明显地下调P74蛋白质的表达水平(P〈0.05)。结论:c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV,细胞的增殖有明显的抑制作用。 相似文献
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hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 探讨错配修复基因hMLH1对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用及其机制.方法 分别用重组质粒pcDNA3.1-hMLH1和空质粒pcDNA3.1转染SKOV3/DDP细胞.RT-PCR和Western blot检测hMLH1的表达.MTT检测转染前后SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性的变化.经顺铂DDP作用后,流式细胞术和Western blot法检测细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,瞬时转染24 h后,SKOV3/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05).MTT结果显示,转染细胞的IC50值(13.95±2.45)较未转染的细胞(94.16±5.18)明显减小.流式细胞仪和Western blot检测结果表明,顺铂作用24 h后,转染了重组质粒的耐药细胞的凋亡率提高到(33.33±2 31)%,同时凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达受到抑制(1.35±0.39),与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 hMLH1基因能增强卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与降低该耐药细胞内Bcl-2的表达水平,促进细胞凋亡有关. 相似文献
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目的 观察正常人CIK(cytokine inducedkiller)细胞对人卵巢癌细胞株SKOV3ip的体外细胞毒活性以及对卵巢癌腹水瘤模型的体内抗肿瘤作用。方法 取正常人的外周血单个核细胞 (PBMC) ,加入细胞因子γ IFN、IL 2、抗 -CD3单抗和IL - 1,体外诱导成CIK细胞 ,用MTT法测定CIK细胞体外对人卵巢癌细胞株SKOV3ip的细胞毒活性 ,并与CD3AK作对比。在Babl/c裸小鼠腹腔内接种卵巢癌SKOV3ip细胞 ,观察CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用。结果 体外实验证明 ,CIK细胞对SKOV3ip有明显的细胞毒活性 ,对比CD3AK其抑瘤率为 89.7%与 6 7.1% (P <0 .0 5 )。裸鼠卵巢癌腹水瘤模型体内实验表明 ,CIK细胞能够显著抑制癌性腹水生长 ,其抑制率可达 10 0 %。结论 CIK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞 ,具有较强的体内外抗卵巢癌细胞活性 ,具有明显的抑制癌性腹水生长的作用 ,有可能用于临床上卵巢癌腹水的过继性免疫治疗 相似文献
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真核表达Survivin基因对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
目的探讨Survivin基因对卵巢癌细胞紫杉醇(Taxol)敏感性的影响。方法构建Survivin正义全长真核表达质粒(pcDNA3.1-Survivin),经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780,以转染pcDNA3.1空载体的A2780细胞为对照。RT—PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测Survivin mRNA和蛋白质的表达;MTT比色法检测紫杉醇对两组细胞存活率的影响;流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡率。结果①RT—PCR和Western blot检测提示转染pcDNA3.1-Survivin组中Survivin mRNA和蛋白质表达明显高于空载体组。②MTT比色法和FACS检测提示转染pcDNA3.1-Survivin组细胞存活率明显高于空载体组,细胞凋亡率明显低于空载体组,差异均有显著性意义(P〈0.05)。pcDNA3.1-Survivin转染后的A2780细胞对紫杉醇的敏感性明显降低。结论卵巢癌对紫杉醇的耐药性可能与Survivin基因表达有关。 相似文献
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目的:观察氯化钴(CoCl2)作用于人卵巢癌SKOV3细胞株后对SKOV3细胞顺铂敏感性的影响,并阐述其可能机制。方法:体外培养SKOV3细胞株,随机分为对照组、CoCl2组、顺铂(DDP)组和CoCl2联用DDP (联合)组,CoCl2组细胞以200 μmol·L-1 CoCl2作用4 h后换普通细胞培养基培养20 h,DDP组细胞以含10 mg·L-1 DDP的细胞培养基培养24 h,联合组细胞以200 μmol·L-1 CoCl2作用4 h后更换含10 mg·L-1 DDP的细胞培养基继续培养20 h。MTT法检测各组细胞存活率,免疫荧光法检测各组细胞中低氧诱导因子1α(HIF-1α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)阳性表达强度,Rhod 2-AM荧光探针检测各组细胞线粒体钙离子(Ca2+)水平,免疫蛋白印迹(Western blotting)法观察凋亡相关蛋白细胞色素C (cyto C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase3)蛋白表达水平,Muse®凋亡试剂盒检测各组细胞凋亡率。结果:与对照组比较,CoCl2组细胞存活率无明显变化(P>0.05),其余2组细胞存活率明显下降(P<0.05);且联合组高于DDP组(P<0.05)。与对照组比较,CoCl2组和联合组细胞中HIF-1α阳性表达强度明显增强(P<0.05);DDP组和联合组细胞中iNOS阳性表达强度明显增强(P<0.05)。与对照组比较,DDP组和联合组细胞Ca2+水平升高(P<0.05);且DDP组高于联合组(P<0.05)。与对照组比较,CoCl2组细胞中cyto C、caspase3和cleaved caspase3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),DDP组细胞中cyto C、caspase3和cleaved caspase3蛋白表达水平明显升高(P<0.05);且联合组低于DDP组(P<0.05)。与对照组比较,DDP组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);联合组细胞凋亡率较DDP组降低(P<0.05)。结论:CoCl2可以通过抑制DDP诱导的人卵巢癌SKOV3细胞株iNOS表达增强来减少线粒体途径凋亡的发生,降低其顺铂敏感性。 相似文献
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紫杉醇对人卵巢癌细胞凋亡的影响 总被引:4,自引:1,他引:3
目的 :探讨紫杉醇 (PTX)对人卵巢细胞凋亡的影响。方法 :应用细胞形态观察、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪、活细胞视频观察和蛋白印迹免疫法进行检测和观察。结果 :癌细胞在PTX作用下 ,首先表现为G2 /M期阻滞 ,一定时间后出现细胞凋亡。凋亡细胞表现为细胞固缩 ,核染色质凝聚或断裂。细胞DNA裂解片段呈现典型的“阶梯状”排列的条带。凋亡抑制基因Bcl- 2在细胞凋亡过程中呈低表达并发生修饰反应 ,而调亡诱发基因Bax先呈高表达后表达降低。结论 :PTX诱发人卵巢癌细胞的凋亡与细胞分裂阻滞密切相关 ,Bcl- 2和Bax在PTX引起人卵巢癌细胞凋亡中可能起着重要的调控作用。 相似文献
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目的卵巢癌手术、传统化疗和放疗技术虽然有所改进,但患者5年生存率仍不超过20%。已有研究证明茶多酚具有抗肿瘤和抗氧化作用。文中主要探讨茶多酚对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用和诱导SKOV3细胞凋亡的作用及其作用机制。方法采用MTT比色法检测不同浓度的茶多酚对卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制作用;应用荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ(FITC-AnnexinⅤ)联合流式细胞凋亡定量检测技术(PⅠ双染色)检测茶多酚对SKOV3细胞凋亡发生率的影响,同时应用PI染色技术分析茶多酚对SKOV3细胞分裂周期的影响;利用荧光探针DCFH-DA对细胞内活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)水平进行检测。结果茶多酚对SKOV3细胞的生长有明显的抑制作用,不同剂量茶多酚组的抑制率与空白对照组比较有显著差异(P<0.01)。AnnexinⅤ/PⅠ双染色法观察到药物浓度与细胞凋亡发生呈正相关,即随着药物浓度的增加细胞凋亡率增加,在200μmol/L的时候几乎所有的细胞都发生了凋亡。随着药物浓度的增加处于G0/G1期细胞减少,多数细胞阻滞在细胞周期的S期,从而阻断细胞周期向G2/M期进行,当药物浓度达到200μmol/L时,出现明显凋亡峰。利用荧光探针DCFH-DA对细胞内ROS水平进行检测发现随着茶多酚浓度增高细胞内ROS水平显著增高,不同剂量茶多酚组细胞内ROS水平与空白对照组比较有显著差异(P<0.01)。结论茶多酚在体外可剂量依赖性地抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,诱导细胞凋亡,推测ROS水平的增高可能是导致卵巢癌SKOV3细胞凋亡的原因,为筛选治疗卵巢癌的化疗药物提供新的参考依据。 相似文献
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目的 研究shRNA沉默Bmi-1基因对鳞癌细胞ECA109增殖变化的影响,探讨Bmi-1基因在鳞癌细胞增殖中的作用。方法 采用RT-PCR和Western blot法分别检测Bmi-1在Fibroblast细胞、Hacat细胞、A431细胞、ECA109细胞中的表达。构建重组质粒GPU6/GFP/Neo-shBmi-1,脂质体转染ECA109细胞后,检测细胞中Bmi-1表达变化。MTT法检测转染前后细胞抑制率,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果 与Fibroblast细胞和Hacat细胞相比,Bmi-1在鳞癌细胞系A431、ECA109中含量明显升高。重组载体GPU6/GFP/Neo-shBmi-1构建成功,转染ECA109细胞后Bmi-1表达明显降低(P<0.05)。与对照组相比,转染后细胞增殖明显受到抑制(P<0.05);G1期细胞明显增加(P<0.05),S期细胞明显减少(P<0.05)。结论 Bmi-1与细胞恶性增殖相关。在ECA109细胞中沉默Bmi-1,可改变细胞周期,从而抑制细胞增殖。 相似文献
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hTGF-β3的构建及其在前软骨干细胞的瞬时表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 为骺板损伤的基因治疗创造条件,构建人转化生长因子的真核表达载体,并转染大鼠前软骨干细胞(PSCs),以获得组织工程的种子细胞.方法 通过基因工程的方法重组构建pcDNA3.1( )-hTGF-β3真核表达载体并鉴定,免疫磁珠法分离纯化大鼠前软骨干细胞后,用纳米级的高分子聚合物线性化的聚乙烯亚胺共转染pcDNA3.1( )-hTGF-β3与pcDNA3.1-EGFP,观察和检测瞬时转染后的表达情况.结果 重组质粒经过酶切电泳和测序鉴定证实构建成功,共转染后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,RT-PCR和ELISA 可以检测到有目的 基因的表达.转染后培养液上清中TGF-β3 蛋白含量开始上升,在72 h达到高峰,以后逐渐下降.结论 真核表达载体hTGF-β3的重组质粒构建正确,并成功转染PSCs,为骺板损伤的组织工程学修复提供了新的选择. 相似文献
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目的 体外构建携带报告基因胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)的重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF,并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法 采用密度梯度离心法分离获得BMSCs,进行细胞免疫化学鉴定;应用PCR技术获得HSV1-TK、内部核糖体进入位点(IRES)、BDNF的cDNA序列,酶切后依次插入到pcDNA3.1的多克隆位点(MSC)中,酶切和序列分析鉴定;脂质体介导重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs,RT-PCR和Western blot检测其目的 基因表达.结果 重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF经酶切和序列分析鉴定与预期设计一致;RT-PCR和Western blot检测证实TK和BDNF在IRES介导下可同时表达.结论 成功构建重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF并在BMSCs中有效表达,为下一步核素活体示踪转基因BMSCs治疗脑血管疾病奠定了实验基础. 相似文献
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目的 :构建FHIT基因的真核表达载体及测定其在COS 1细胞中的瞬时表达。方法 :应用RT PCR方法从正常人甲状腺组织中克隆出FHIT基因 ,在KpnⅠ和 BstXⅠ两个酶切位点插入真核表达载体 pcDNA3中 ,通过酶切分析、基因测序和免疫细胞化学方法鉴定插入基因片段的正确性。结果 :FHIT基因在载体 pcDNA3中插入的位点是正确的 ,没有缺失、插入等突变 ,并在COS 1细胞中有较高的瞬时表达。结论 :成功构建了FHIT基因的真核表达载体 ,并获得其在COS 1细胞中较高的瞬时表达 ,为该基因在基因治疗中的研究提供了有力的分子工具 相似文献
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目的构建人源Dickkopf-1(DKK-1)基因的真核表达质粒,为进一步探讨DKK-1的生物学功能奠定基础。方法Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-1的基因序列,将真核表达载体pcDNA3.1和DKK-1的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-DKK-l,转化至大肠杆菌后经菌落PCR、NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。结果RT-PCR法从人胎盘中扩增出816bp大小的目的片段,重组质粒转化至大肠杆菌后菌落PCR同样扩增出816bp大小的目的片段,NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒能切出两条目的条带,测序后与Genbank中DKK-1的cDNA对比,证明DKK-1的基因序列完全正确。结论成功构建了pcDNA3.1-DKK-1重组质粒,为研究人源DKK-1的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础。 相似文献
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目的构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA序列(CDS),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GFP-Pin1蛋白的表达。结果RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌HeLa细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GFP-Pin1蛋白高表达;经G418筛选获得单细胞克隆。结论重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。 相似文献
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重组pEGFP/Ang-1质粒转染兔骨髓基质干细胞及其表达的实验研究 总被引:4,自引:0,他引:4
目的 制备稳定高效表达血管生成素-1(Ang-1)的转基因工程骨髓基质干细胞。方法 应用基因重组的方法构建Ang-1真核表达质粒pEGFP/Ang-1,利用脂质体将pEGFP/Ang-1转入骨髓基质干细胞,用流式细胞仪检测转染率,用荧光显微镜和免疫细胞化学方法检测蛋白质的表达。结果 质粒酶切电泳显示重组质粒构建成功,转染pEGFP/Ang-1质粒的骨髓基质干细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光;流式细胞仪检测转染率约50%;免疫细胞化学检测可见转基因骨髓基质干细胞表达Ang-1蛋白。结论 成功制备表达外源性基因Ang-1的骨髓基质干细胞,制备方法是可行的。 相似文献
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目的 构建HMGB1基因真核细胞表达载体并检测其在真核细胞中的表达?方法 提取人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)mRNA,反转录为cDNA?PCR 扩增HMGB1全长编码基因,构建成pcDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1真核细胞表达载体?转染HUVEC,Western blot 检测转染后HMGB1基因的表达改变?结果 构建HMGB1全长基因真核细胞表达载体成功,酶切鉴定及测序鉴定表明载体构建正确,转染HUVEC后可检测到外源性蛋白的表达,对照组无外源性蛋白表达?结论 成功构建了HMGB1全长基因真核细胞表达载体并可转染至HUVEC中 相似文献
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目的构建并筛选靶向信号转导和转录激活因子3(Stat3mRNA)的微小RNA(MicroRNA)表达质粒。观察其在肝癌细胞系HepG2中对Stat3表达的影响。方法针对人Stat3mRNA设计3条MicroRNA序列,经退火成互补双链,将双链DNA插入线性质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒中,分别构建重组表达质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3等3组质粒,并测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至人肝癌HepG2细胞中,观察转染效果。RT-PCR和Western blot分别检测Stat3mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力。结果成功构建靶向Stat3的MicroRNA重组质粒,经测序证实插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致,转染人肝癌HepG2细胞后,荧光显微镜下可观察到带有绿色荧光的HepG2细胞。流式细胞仪检测3组质粒的转染效率分别为:76%、73%和63%。RT-PCR分析pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3的抑制率分别为:73.5%、47.2%和39.6%,下调Stat3蛋白的比例分别为:89.1%、71.6%、67.3%。其中pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1的下调效应最明显。MiR-1质粒转染组的细胞凋亡率升高,增殖受抑制,与阴性对照质粒组和未转染组比较,差异均有高度统计学意义(均P〈0.01)。结论成功构建了靶向Stat3的MicroRNA表达质粒,其对肝癌HepG2细胞Stat3的表达及增殖有显著抑制。 相似文献
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目的 构建FUS1和人IL-12双基因真核共表达质粒并在肺癌A549细胞中检测基因表达及诱导细胞凋亡作用.方法 采用RT-PCR技术从人肺成纤维细胞MRC-5中逆转录扩增全长FUS1基因,通过PCR技术从pORF-hIL-12质粒中扩增含双亚基的全长IL-12基因.FUS1和IL-12分别经酶切后定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点中,酶切和测序鉴定双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12的构建.以pVITRO2-FUS1-IL-12转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR、ELISA 和Western blot方法 检测目的 基因的表达,以Hoechst33258染色及流式细胞术验证pVITRO2-FUS1-IL-12在体外的促凋亡作用.结果 酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达质粒 pVITRO2-FUS1-IL-12,在转染后的细胞中同时检测到了FUS1和IL-12的表达,两种基因在双基因表达载体上的表达量基本不受影响.双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12具有明显诱导肺癌细胞凋亡的作用.结论 成功构建pVITRO2-FUS1-IL-12双基因真核共表达质粒,为肺癌的多基因联合治疗提供了又一新的思路和方法. 相似文献