Smac在肿瘤进展及治疗中的意义

近来多有对线粒体促凋亡蛋白(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)促进凋亡机制的研究,是细胞凋亡研究中的一个热点,研究发现线粒体促凋亡因子野生型(Smac/DIABLO)在细胞凋亡过程中起着重要作用,并且在肿瘤的发生、发展及治疗中也有重要作用,现就Smac在肿瘤进展中的研究作一综述.     

凋亡蛋白Daxx与TRAF3相互作用的筛选及相互作用位点的鉴定

目的:利用酵母双杂交技术在成人肝文库中筛选能与死亡结构域相关蛋白(Daxx)相互作用的蛋白,并用哺乳动物细胞中进行了免疫共沉淀验证,以进一步了解Daxx的功能. 方法: 利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增Daxx全长ORF,构建pDBLeu-Daxx载体. 转化MaV203,检测细胞毒性和自激活作用,确定His基础表达的3AT浓度. 依次转化成人肝cDNA文库. 在营养缺陷型培养基上挑取三阳性克隆. 进行回转实验和免疫共沉淀验证,并利用β-gal分析进行了相互作用结构域的鉴定. 结果: 筛库转化效率达到5.8×106个克隆. 筛选到了一株能与Daxx相互作用的阳性克隆,DNA序列分析和同源检索表明该阳性克隆为肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3).通过回转及co-IP证实了TRAF3能与Daxx相互作用,β-gal分析发现TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用. 结论: TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用,可能参与了Daxx的调控和功能,为进一步了解Daxx作用的分子机制奠定了基础.     

线粒体与细胞凋亡关系的研究

线粒体与细胞凋亡有着密切的关系。细胞凋亡过程中线粒体释放膜间隙中与凋亡相关的活性物质（促凋亡蛋白）。如细胞色素C、AIF、Smac／DIABLO等,线粒体上PT孔道的开放,削弱了线粒体膜两侧的质子梯度,导致ATP合成下降;释放的活性物质激活Caspase,引起细胞凋亡。     

线粒体在细胞凋亡中的作用

细胞凋亡是一种由基因调控的高度保守的细胞主动死亡过程,在多细胞有机体的生长发育、维持组织同源性等过程起重要作用,已成为近年来研究热点之一。近年来研究表明线粒体与细胞凋亡有着密切的关系。细胞凋亡过程中线粒体上PT孔道开放,释放膜间隙中与凋亡相关的活性物质即各种促凋亡蛋白,如细胞色素C、AIF、Smac/DIABLO等,线粒体上PT孔道的开放,削弱了线粒体膜两侧的质子梯度,导致ATP合成下降;释放的活性物质激活Caspase,引起细胞凋亡。     

线粒体雌激素受体β通过与Bad相互作用抑制非小细胞肺癌细胞的凋亡

目的探究线粒体雌激素受体β（ERβ）抑制凋亡刺激诱导非小细胞肺癌细胞死亡的分子机制。方法免疫荧光及western
blotting分析细胞内源ERβ的线粒体定位;检测顺铂与十字孢碱（staurosporine,STS）处理过表达或沉默线粒体ERβ后细胞凋亡
的变化;免疫共沉淀和western blotting分析线粒体ERβ与促凋亡蛋白Bad的相互作用。结果ERβ存在于A549及201T细胞的
线粒体中;过表达或沉默ERβ可以显著减少或增加顺铂与STS诱导的Bax激活及细胞凋亡;线粒体ERβ与促凋亡蛋白Bad相互
作用可能阻抑Bax的活化及线粒体转位。结论线粒体雌激素受体β可以通过与Bad相互作用抑制顺铂或STS诱导非小细胞肺
癌细胞的凋亡,提示线粒体ERβ可能是治疗非小细胞肺癌的一个新靶点。
     

HNP-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

目的筛选胎肾上腺cDNA文库中与人中性粒细胞多肽(HNP-3)成熟肽具有相互作用的蛋白分子。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功获得HNP-3成熟肽基因,并将其插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109,而后经缺陷性培养基上培养并观察pGBKT7-HNP-3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。同时收集胎肾上腺,提取RNA,通过自我检测、分析、报告技术(SMART技术)制备人胎肾上腺cDNA文库。并采用Match-maker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-3成熟肽相互作用的蛋白。最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,通过回转实验,谷胱甘肽巯基转移酶沉降技术(GST pull down)以及免疫共沉淀实验再次验证二者的相互作用关系。结果成功构建诱饵质粒pGBK-T7-HNP-3以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-3成熟肽相互作用的蛋白——促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)2、钙粘着蛋白关联蛋白1(CTNNB1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、成对样同源域转录因子2(PITX2)等。最终选定ACTH-R作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实二者间具有相互作用的相应的条带。结论从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-3成熟肽相互作用蛋白——ACTH-R。     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株中survivin和SMAC/DIABLO基因表达的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3中survivin、Smac/DIABLO表达的影响,探讨survivin、Smac/DIABLO在ASODN诱导卵巢癌细胞凋亡和细胞周期改变中的作用和分子机制.方法 用脂质体(LipofectamineTM 2000)介导survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,用MTT比色法检测细胞生长活性,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数、细胞周期分布及survivin、Smac蛋白表达改变,逆转录酶链反应检测survivin、Smac/DIABLO基因表达改变.结果 同对照组比较,不同浓度ASODN作用后细胞生长明显减慢,转染后48 h IC50在600 nmol/1左右.用600 nmol/LASODN转染48h后,细胞凋亡指数(AI)明显增加,(t=6.3671,P＜0.05);更多的细胞停留在G0/G1期(t=10.3832,P＜0.01).Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.5031,P＜0.05,t=7.8146,P＜0.01),SmacmRNA和蛋白表达上调(t=2.8011,P＜0.05,t=11.3917,P＜0.01).结论 ASODN诱导细胞凋亡,使更多的细胞停留在G0/G1期,减少进入有丝分裂细胞数的作用,是通过下调survivin基因,上调Smac基因表达来共同完成的,survivin、Smac/DIABLO基因在调节SKOV3细胞周期、凋亡的功能上密切相关,二者的相互作用是卵巢癌发生、发展的重要分子机制之一.     

线粒体凋亡通路的研究进展

长期以来,线粒体被认为是细胞存活的关键.然而,直到20世纪90年代中期,线粒体在细胞程序性死亡中所起的重要作用才被人们所认知.线粒体凋亡通路与线粒体相关的一些重要蛋白,如促凋亡因子、细胞色素C、凋亡诱导因子（AIF）、线粒体衍生的第二种半胱天冬酶激活剂（Smac）、高温应激蛋白A2（HtrA2）、核酸内切酶G等在细胞凋亡过程中共同发挥着调控作用.该文主要就线粒体凋亡通路在哺乳动物细胞中所起作用的研究进展予以综述.     

乙型肝炎病毒聚合酶与UXT蛋白的潜在相互作用鉴定

目的研究乙肝病毒聚合酶(HBV Pol)在肝细胞内潜在的相互作用的蛋白质因子,为揭示HBV Pol发挥功能的分子机制,进一步了解HBV在细胞内复制的机制提供依据。方法构建重组诱饵质粒pGBKT7-Pol,利用GAL4酵母双杂交系统筛选人肝cDNA文库得到与HBV Pol相互作用的蛋白质因子,再通过GST-Pull down验证蛋白间的相互作用。结果酵母双杂交筛选得到宿主蛋白Ubiquitously Expressed Transcrip(tUXT),GST-pull down确证蛋白间的相互作用。结论 UXT为一潜在的与HBV Pol相互作用的肝细胞蛋白质因子,这可能为研究HBV Pol在病毒生活周期中的功能提供线索。     

酵母双杂交系统筛选Mps1相互作用蛋白

目的：对前期筛出的与Mps1可能有相互作用的两种蛋白用酵母双杂交回转,验证与Mps1有相互作用的蛋白,为染色体分离机制研究提供线索,并为蛋门质相互作用网络提供资料。方法：应用酵母双杂交技术,将前期以pDBLeu—Mps1为诱饵质粒筛选成人肝脏cDNA文库,得到的Leu＋LacZ＋阳性克隆进一步回转酵母进行验证,即将文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内对相互作用进行验证。并对验证后的阳性克隆的外源片段进行测序及同源性分析。结果：用同源性分析,从人胚胎cDNA文库筛选到的与Mps1有相互作用的两个蛋白在酵母双杂交回转实验中仅有一个为阳性,另一个相互作用为阴性。结论：应用酵母双杂交系统从人胚胎cDNA文库中筛选并初步验证了与Mps1有相互作用的蛋白,为Mps1蛋白的功能研究奠定了基础．     

分化抑制因子1相互作用蛋白AGGF1的筛选

目的 利用酵母双杂交方法,筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子1(Id1)相互作用的蛋白.方法 PCR方法扩增Id1的编码序列并定向克隆入诱饵质粒pHybLex/Zeo,构建重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1,酶切鉴定后转化人酵母株EGY48/pSH18-34,检测重组诱饵质粒有无非特异激活报告基因Leu2、LacZ作用;扩增并提取成人肺组织文库质粒,将文库质粒及重组诱饵质粒转化入酵母细胞,依次筛选Leu2 ,Leu2 LacZ 克隆;设置阴性及阳性对照,重复筛选Leu2 LacZ 克隆并排除假阳性克隆,获取真阳性文库质粒,进行测序和同源性比对.结果 酶切证实,重组诱饵质粒构建成功.重组诱饵质粒转化入酵母细胞后.经检测无非特异激活报告基因作用.扩增并筛选成人肺组织文库.获得198个Leu2 及19个Leu2 LacZ 克隆.经排除假阳性克隆,最终获得1个Leu2 LacZ 真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆与蛋白AGGF1高度同源(556/559,99.5%),Westem blotting证实其在酵母细胞中有表达.结论 利用酵母双杂交方法,通过筛选成人肺组织文库,发现Id1与AGGF1存在相互作用.     

DLX4基因酵母双杂交系统的构建及自激活检测

目的 构建DLX4酵母双杂交系统并鉴定其自激活作用。方法 构建人胎盘酵母双杂交cDNA文库,并行PCR鉴定;构建3条DLX4诱饵质粒,包括pDEST32-DLX4(4-1C)、pDEST32-DLX4(4-1N)和pDEST32-DLX4(4-2);将DLX4诱饵质粒转入酵母MaV203菌株,并检测其在酵母细胞中有无自激活作用。结果 PCR证实成功构建了人胎盘酵母双杂交文库;3条DLX4诱饵质粒中,pDEST32-DLX4(4-2)和pDEST32-DLX4(4-1C)没有自激活作用,可用于文库筛选。结论 成功构建了酵母双杂交文库和DLX4诱饵质粒,可用于筛选与DLX4相互作用的蛋白。     

DLX4基因酵母双杂交系统的构建及自激活检测

目的构建DLX4酵母双杂交系统并鉴定其自激活作用。方法构建人胎盘酵母双杂交cDNA文库,并行PCR鉴定;构建3条DLX4诱饵质粒,包括pDEST32-DLX4（4-1C）、pDEST32-DLX4（4-1N）和pDEST32-DLX4（4-2）;将DLX4诱饵质粒转入酵母M aV203菌株,并检测其在酵母细胞中有无自激活作用。结果 PCR证实成功构建了人胎盘酵母双杂交文库;3条DLX4诱饵质粒中,pDEST32-DLX4（4-2）和pDEST32-DLX4（4-1C）没有自激活作用,可用于文库筛选。结论成功构建了酵母双杂交文库和DLX4诱饵质粒,可用于筛选与DLX4相互作用的蛋白。 更多还原     

酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术,在人胎脑文库中筛选与人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) UL146基因编码蛋白相互作用蛋白,以探讨HCMV-UL146的生物功能.方法 应用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-UL146诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人胎脑cDNA文库质粒的酵母相互作用,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌,提取质粒DNA进行测序分析.结果 pGBKT7-UL146构建成功.经严格筛选,共有200余个阳性克隆,分离测序80个克隆,成功筛选出30个与HCMV-UL146特异性相互作用的蛋白.结论 HCMV-UL146与多种蛋白有相互作用,提示其生物学功能复杂.此结果为进一步研究HCMV-UL146基因功能提供依据.     

酵母双杂交文库筛选HBX相互作用蛋白*

目的：筛选鉴定新的乙肝病毒X蛋白（hepatitis B viral X protein,HBX）相互作用蛋白。方法：以HBX为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子GAL4 DBD（DNA binding domain）融合表达,将人肝脏cDNA文库编码的蛋白与GAL4的AD区（activation domain）融合表达。通过酵母双杂交筛选鉴定肝脏中与HBX相互作用的蛋白。筛选得到的阳性酵母转化子,经质粒提取和测序后,分析其所包含的序列编码的蛋白,通过再次验证,初步确定该蛋白是否与HBX具有相互作用。结果：筛选得到5个潜在的能与HBX相互作用的蛋白。结论：通过酵母双杂交cDNA文库筛选,得到多个潜在的HBX相互作用蛋白,进一步的验证及功能研究将对揭示HBX促进肝癌发生的机制起到重要的推动作用。     

利用酵母双杂交筛选与DAT1的LIM2相互作用的蛋白质

目的利用酵母双杂交系统筛选人胎脑组织中能与多巴胺相关转录因子DAT1的LIM2相互作用的蛋白质,以初步了解DAT1的功能.方法构建酵母双杂交诱饵质粒pLexA-LIM2,筛选人胎脑cDNA文库,并用酵母交配试验初步验证.结果获得3个能与DAT1的第2个LIM结构域LIM2结合的相互作用蛋白,通过酵母结合试验证实了它们在酵母中的结合.结论DAT1的第2个LIM结构域LIM2可与唐氏综合征关键区基因2(Similar to Down syndrome critical region gene2,DSCR2)、钙-整合素结合蛋白(calcium and integrin binding protein,CIB)、和HSPC170(CD34 hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)结合.     

蛋白hSav1和Mst1之间的相互作用

目的探讨hSav1（human salvador1）和Mst1（MammalianSTE20-like 1）存在的相互作用,为进一步研究Mst1的功能及相关机制奠定基础。方法以Mst1 cDNA全长构建诱饵蛋白载体pGBKT7-Mst1,并对其自身转录活性进行鉴定,利用酵母双杂交系统筛选人胎肝文库,挑选单克隆,从而初步筛选出与Mst1相互作用的蛋白。然后构建初步筛选出的蛋白hSav1的载体pCMV-HAhSav1,与蛋白Mst1的载体pcDNA／4TO-Flag-Mst1共转染HEK293T细胞,利用相应抗体做二者的免疫共沉淀,以验证蛋白hSav1和Mst1之间的相互作用。其次构建pEGFP-hSav1质粒转染HEK293T,利用免疫荧光观察二者在细胞内的定位。结果以Mst1为诱饵蛋白在人胎肝文库筛选到包括hSav1在内的与之存在相互作用的蛋白。免疫共沉淀结果显示,hSav1蛋白可以在FLAG抗体的免疫沉淀物中检测出来,同样在hSav1抗体的免疫沉淀物中也能检测到蛋白Mst1。免疫荧光的结果显示二者荧光在细胞内存在共定位,二者的荧光可充分融合。结论蛋白hSav1与Mst1在哺乳细胞内存在某种相互作用,为进一步研究Mst1的功能及相关机制提供了线索。     

人卵巢cDNA文库中与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子的筛选及其调控作用

目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的新候选分子,并用生物信息学方法分析其与Wee1B相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT质粒为模板构建pGBKT7 Wee1B诱饵质粒;制备酵母感受态细胞,将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B转化酵母感受态细胞后分别接种SD/Trp（SDO）、SD/Trp/X α Gal（SDO/X）和SD/Trp/X α Gal/AbA plates（SDO/X/A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力,利用Western blotting法检测pGBKT7 Wee1B在酵母中的表达情况;将含有pGBKT7 Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定,最终再经酵母重新转化验证。在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析,pGBKT7 Wee1B诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在SDO/X/A平皿上无克隆。将pGBKT7 Wee1B和pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中,菌液接种于SDO平皿,2个SDO平皿上克隆都均匀生长。从工作板SDO和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养,裂解细胞提取蛋白,Western blotting法检测示pGBKT7 Wee1B对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢cDNA文库融合,PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经BLAST分析筛选出9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白,生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶相互作用的蛋白,这些筛选蛋白可能通过与Wee1B相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。