肝细胞肝癌靶向性r-Caspase-3重组腺病毒的构建与表达

目的 构建肝细胞肝癌特异性表达反向半胱氨酸蛋白酶3(r-Caspase-3)重组腺病毒,为肝细胞肝癌的基因治疗提供新策略.方法 构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白 (ALB) 启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),然后将目的 基因r-Caspase-3亚克隆到载体pAdTrack-EAFP-PALB上, 获得重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB /r-Caspase-3, 经PmeⅠ酶切线性化后与pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒骨架pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3; 鉴定正确的pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3 经PacⅠ酶切线性化后脂质体转染AD293 细胞进行包装、扩增,获得病毒.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率; RT-PCR和Western blot 法检测r-Caspase-3在HepG2细胞中的表达; SRB染色法评估重组腺病毒对HepG2细胞的抑制作用,初步观察HepG2细胞凋亡状况.结果 穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3酶切、测序正确.穿梭载体、pAdEasy-1载体同源重组后PCR 及PacⅠ酶切鉴定结果表明pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 重组成功; 经PacⅠ酶切线性化后,pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 转染AD293 细胞即可观察到GFP 的表达; 回收病毒可重复感染AD293 细胞,RT-PCR和Western blot 均可检测到r-Caspase-3的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3病毒颗粒包装成功; SRB染色检测发现Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有凋亡诱导特异性.结论 靶向性Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3重组腺病毒构建成功,并具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-Caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能奠定了基础.     

重组的r-Caspsae-3促凋亡基因体内外治疗胰腺癌的试验研究

目的 观察重组活化的Caspsae-3(r-Caspase-3)促凋亡基因对胰腺癌细胞(PC-Ⅱ)及裸鼠皮下种植瘤的治疗作用。方法 采用先前构建的r-Caspase-3促凋亡基因转染胰腺癌细胞，细胞形态学、DNA电泳、流式细胞学观察胰腺癌细胞凋亡状况；用脂质体-pcDNA3．1( )／r-Caspase-3复合物，治疗人胰腺癌细胞裸鼠种植瘤，观察肿瘤生长速度并计算肿瘤体积大小。结果 DNA电泳、流式细胞学可分别观测到特征性的DNA Ladder和凋亡峰，皮下种植肿瘤治疗后生长速度开始减缓，组织切片HE染色可见散在凋亡细胞；对照组肿瘤生长速度明显快于治疗组。结论 r-Caspase-3具有自催化凋亡诱导活性，以r-Caspase-3为目的基因的基因治疗可能为治疗胰腺癌以及其它恶性肿瘤开辟新的途径。     

Ad-ING4对乳腺癌的生长抑制作用研究

目的 研究腺病毒(adenovirus,Ad)介导的ING4基因(Ad-ING4)表达对人乳腺癌的生长抑制作用.方法 采用Ad-ING4腺病毒感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,RT-PCR、Western blot 法检测ING4基因在肿瘤细胞中的转录和表达;四唑盐(MTT)法、Hochest33258染色法和流式细胞仪(FCM)检测ING4基因的表达对乳腺癌细胞的生长抑制、周期变化和凋亡效应;半定量RT-PCR检测凋亡相关基因的转录;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测人血管生成素1(Ang-1)的分泌水平;在乳腺癌的裸鼠移植瘤动物模型上检测Ad-INCA对移植瘤生长的抑制作用,并检测Bc1-2,Bax,Caspase-3等细胞凋亡相关因子的表达.结果 ING4基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达,并对乳腺癌细胞有明显增殖抑制及促凋亡作用,G_2/M期阻滞达(24.86±1.24)%;Ad-ING4显著抑制移植瘤生长,瘤重抑制率达49%;免疫组化结果显示Ad-ING4上调Bax和Caspase-3的表达,下调Bc1-2、Survivin和CD34的表达.结论 ING4基因在体内外均可明显抑制MDA-MB-231细胞的生长,诱导其凋亡.     

Vasostatin基因抑制裸鼠种植性肝癌血管生成的实验研究

目的：探讨人血管内皮抑制素Vasostatin基因对裸鼠种植性肝癌生长及肿瘤新生血管生成和细胞凋亡的影响。方法：建立裸鼠肝癌种植瘤模型,采用Vasostatin基因质粒（VAS组）及空壳质粒（对照组）进行瘤体内电转染,观察治疗后肿瘤生长情况,计算肿瘤体积及抑瘤率,应用免疫组织化学技术检测肿瘤微血管密度变化,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果：VAS组抑瘤率为31.73%。对照组、VAS组肿瘤质量分别为（1.23±0.82）g和（0.81±0.62）g;微血管密度分别为18.26±1.72和5.62±0.59;肿瘤细胞凋亡指数分别为6.25±1.32和16.48±0.96,2组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：人血管内皮抑制素Vasostatin基因对裸鼠种植性肝癌生长具有明显的抑制作用,可促进肿瘤细胞的凋亡,进而影响肿瘤生长。     

重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK基因诱导人胃癌细胞凋亡的研究

目的探讨KDR启动子驱动双自杀基因体系对人胃癌细胞靶向治疗的作用。方法用重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染SCG7901细胞和HepG2细胞,观察该体系对SCG7901细胞的杀伤效应。应用透射电镜、Hoechest 33258/PI染色、流式细胞仪观察细胞超微结构、细胞凋亡率和细胞周期的变化。建立小鼠SCG7901细胞动物模型,计算抑瘤率。用TUNEL法检测细胞凋亡率。结果受感染SCG7901细胞和HepG2细胞中均有绿色荧光蛋白的表达。已转染腺病毒的SCG7901细胞和HepG2细胞的存活率分别为(21.5±3.2)%和(89.1±3.4)%,两种细胞表现出对前药不同的敏感性(t=25.23,P=0.00)。流式细胞术检测表明该体系抑制SCG7901细胞的DNA合成,亚二倍峰数值之间差异有统计学意义(t=8012,P=0.00)。Hoechest 33258/PI染色和电镜下可见SCG7901细胞有凋亡改变。裸鼠移植瘤的肿瘤体积明显缩小。实验组肿瘤细胞凋亡指数为(36±6)%,较对照组显著增加(P=0.00)。结论KDR启动子可以调控融合基因体系在体外选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并且诱导体内外人胃癌细胞的凋亡。     

脂质体Tie-2-siRNA表达载体对HepG2细胞裸鼠移植瘤作用的研究

目的探讨Tie-2小干扰RNA(siRNA)对HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的作用。方法将HepG2肿瘤细胞植于6周龄鼠后背皮下,荷瘤鼠分为对照组及实验组,分别用生理盐水/脂质体及Tie-2-siRNA/脂质体瘤内注射,检测基因治疗前后肿瘤体积、质量变化,血清AFP、MVD及肿瘤组织学变化。结果治疗组治疗后第4、7及10d,抑瘤率分别为26.94%、53.01%及68.91%;肿瘤体积分别为118.47、111.57及104.59mm3,明显小于对照组的162.17、237.46及336.41mm3,差异有统计学意义(P<0.01)。肿瘤瘤重治疗组轻于对照组〔(0.89±0.09)gvs(1.24±0.03)g,P<0.01〕;AFP值治疗组明显小于对照组〔(107.66±24.13)ng/mlvs(266.08±50.96)ng/ml,P<0.01〕;MVD值治疗组亦明显小于对照组(34.63±4.07vs81.01±9.44,P<0.01)。病理组织学显示,对照组肿瘤体积大,异形明显;治疗组可见肿瘤以坏死为主要病理改变,有大片坏死灶。治疗组只有2例在坏死灶与未坏死灶肿瘤间可见凋亡细胞。结论Tie-2-siRNA可抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成,为肝癌的基因治疗开辟了新的思路。     

甲胎蛋白启动子驱动的yCDglyTK双自杀基因治疗裸鼠肝癌的机制研究

目的研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内靶向性治疗肝癌的效果和机制。方法构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因表达质粒,通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721肝癌细胞的裸鼠肝癌皮下种植瘤,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果成功构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因,其靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞种植瘤上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞种植瘤上无表达,氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及两者联合可有效抑制HepG2细胞种植瘤的生长,抑瘤效果GCV＋5-FC〉5-FC〉GCV,而SMMC7721细胞种植瘤的生长未受影响。HepG2细胞种植瘤治疗后有明显的细胞凋亡,而SMMC7721细胞种植瘤内极少凋亡细胞。结论携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

高生物安全性人内皮抑素载体抑瘤作用的研究

目的:探索利用内皮抑素(Endostatin)进行肿瘤抗血管基因治疗的效果与安全性.方法:以pVAX1为载体,构建含IgG γ链信号肽序列和Endostatin基因的重组载体pVAX-sEN.重组子经KpnI、EcoRI双酶切及测序鉴定.建立小鼠肝癌细胞H22动物模型,分别瘤内注射重组载体pVAX-sEN、空载体、生理盐水(NS),每周2次,测量肿瘤体积,ELISA检测肿瘤局部Endosatin的表达量,流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡.同时,100μg高剂量pVAX-sEN裸DNA注射实验动物,观察动物的一般状况,20d后处死动物取其内脏病理切片H-E染色.结果:测序结果表明正确构建了含有信号肽及Endostatin的真核表达载体.瘤内注射pVAX-sEN后,ELISA检测到实验组肿瘤局部Endostatin表达量为(201±3.1)ng/ml,而空载体及NS对照组瘤内未见Endostatin特异性表达;瘤体测量证明pVAX-sEN可以抑制肿瘤的生长,重组载体组肿瘤的平均体积为(0.4±0.3)cm3,显著低于对照组[空载体和NS对照组分别为(1.6±0.4)cm3、(1.9±0.6)cm3,P＜0.05］.pVAX-sEN可以增加肿瘤细胞的凋亡,实验组、空载体和NS对照组肿瘤细胞的凋亡率分别为(51.9±3.16)%、(24.6±4.43)%、(18.8±1.2)%,实验组与两组差异均有统计学意义(P＜0.01).高剂量pVAX-sEN注射小鼠后,一般状况良好,病理切片H-E染色未见炎症及其他损伤表现.结论:pVAX-sEN载体体内应用可显著抑制小鼠种植性H22肝癌的生长,促进肿瘤细胞凋亡,高剂量应用无可见毒副作用,是一种具有开发潜力的安全有效基因治疗载体.     

靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响

目的研究靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响,探讨survivin在血管生成中的作用机制。方法采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2,Western blot检测细胞中survivin蛋白的表达;RT-PCR检测细胞中VEGF mRNA的表达;FCM检测细胞的凋亡率;利用皮下注射法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型;采用脂质体包裹survivin ASODN直接瘤内注射,观察其对移植瘤生长情况的影响;SABC法检测移植瘤组织MVD。结果400 nmol/L survivin ASODN转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达,但不影响VEGF mRNA表达;ASODN组HepG2细胞凋亡率显著高于空白对照组和SODN组(F=428.19,P<0.01);ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(F=12.63,P<0.01);ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(F=5.90,P<0.05);ASODN组MVD较空白对照组和SODN组明显降低(F=34.29,P<0.01)。结论survivin ASODN可以抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长,其机理可能是诱导HepG2细胞自发性凋亡和抑制肿瘤血管生成。     

3′-脱氧腺苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡和p53表达的影响

目的 观察3′-脱氧腺苷对MDA-MB-231细胞生长、细胞周期、凋亡和p53表达的影响.方法 噻唑蓝(MTT)比色法观察3′-脱氧腺苷对体外培养MDA-MB-231细胞的生长抑制作用;流式细胞仪检测3′-脱氧腺苷作用于MDA-MB-231细胞48 h后细胞凋亡率和细胞周期变化;免疫组织化学方法检测MDA-MB-231细胞p53蛋白表达的变化.结果 MDA-MB-231细胞经3′-脱氧腺苷作用后,生长明显抑制,呈剂量和时间依赖性,以80 mg/L时作用最强;不同浓度(2、20、40、80、160mg/L)的3′-脱氧腺苷作用48h后,细胞凋亡率明显升高,其中在40 mg/L( 11.23±0.98)组、80 mg/L (15.21 ±2.0l)和160 mg/L( 13.27±2.26)与对照组(3.25±0.12)比较差异有统计学意义(P＜0.05).G0/G1期细胞比例逐渐升高,同时S期、G2/M期细胞比例相应减少(P＜0.05);免疫组织化学染色结果表明,随着3′-脱氧腺苷浓度的增加,MDA-MB-231细胞p53蛋白表达水平逐渐降低.结论 3′-脱氧腺苷对MDA-MB-231细胞具有明显的生长抑制和促凋亡作用,这种作用可能是通过下调p53蛋白表达以及阻滞细胞周期而实现.