融合蛋白TOP_3原核表达载体的构建、表达及纯化研究

目的:利用HIV病毒TAT蛋白转导结构域、人缺氧诱导因子1α氧依赖降解结构域以及CASPASE3构建融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法:分别构建原核表达质粒pET-28a(+)-TAT、pET-28a(+)-TAT-ODD、pET-28a(+)-TAT-ODD-CASPASE3(pET-28a(+)-TOP3);在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白TOP3进行纯化。结果:成功构建了pET-28a(+)-TOP3的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论:融合蛋白TOP3的成功表达及纯化,为该融合蛋白应用于肿瘤的治疗研究奠定了理论基础。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

TAT／LMP-3融合蛋白的制备及其诱导成骨活性的初步研究

目的：表达并纯化具有入胞转导能力并保持骨诱导活性的重组融合蛋白TAT／LMP-3,观察融合蛋白TAT／LMP-3对人骨髓间充质干细胞的入胞转导活性和诱导其成骨分化的效能．方法：采用基因工程技术构建原核表达载体pET43．1a—TAT／LMP-3和pET43．1a—LMP-3并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni—NTA树脂亲和层析柱纯化后进行初步鉴定,同时制备重组蛋白LMP-3的多克隆抗体．将融合蛋白与人骨髓间充质干细胞共孵育,Western Blot技术分析融合蛋白的入胞效应,检测成骨细胞标志性基因表达以分析重组蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响．结果：成功地构建了pET43．1a—TAT—LMP-3融合基因原核表达载体,获得了TAT／LMP-3的可溶性表达,纯化后融合蛋白TAT／LMP-3纯度大于90％．成功制备了TAT／LMP-3的兔源性多克隆抗体．Western Blot分析证实TAT—LMP-3融合蛋白能以浓度和时间依赖性的方式转导进入人骨髓间充质干细胞,同时,TAT／LMP-3能成功诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化．结论：成功进行了TAT／LMP-3融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定,构建的TAT／LMP-3融合蛋白具有入胞转导能力同时保持了骨诱导活性,为其在脊柱融合的进一步应用奠定了实验基础．     

TAT/CT-1及TAT/EGFP融合蛋白的表达与纯化及其在小鼠体内分布的观察

目的分别构建含蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)TAT与小鼠心肌营养素-1(CT-1)及TAT与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合基因片断的原核表达质粒TAT/CT-1及TAT/EGFP,利用大肠杆菌进行表达并纯化;观察融合蛋白在小鼠体内的分布.方法采用PCR及克隆技术将CT-1编码区基因以及EGFP基因分别与TAT连接到原核表达载体pGEX-4T3上.用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖4B纯化融合蛋白.小鼠尾静脉注射融合蛋白,脑、脊髓、肝、心肌等器官冰冻切片,免疫荧光观察融合蛋白的存在.结果目的片断CT-1及EGFP被有效的扩增,构建后质粒测序表明无PCR引起的突变,TAT/CT-1及TAT/EGFP在转化的大肠杆菌中获得高效表达,并成功纯化.脑、脊髓、肝、心肌等组织切片免疫荧光检测呈阳性.结论成功获得了有活性的TAT/CT-1及TAT/EGFP的基因表达产物;TAT可介导CT-1及EGFP由细胞外跨膜转导进入细胞内;为CT-1功能的进一步研究打下了基础.     

重组原核表达载体pGEX6P1-Osx的构建与表达

目的构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,并在大肠杆菌中诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白。方法提取新生小鼠牙髓总RNA,RT-PCR扩增Osx目的基因片段,并将该片段克隆至PCR-TopoII载体中;经鉴定正确后目的基因定向连接至表达载体pGEX6P1;将重组质粒pGEX6P1-Osx转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定;免疫印迹法检测纯化的GST融合蛋白。结果IPTG诱导宿主菌BL21有效表达融合蛋白;免疫印迹法鉴定该融合蛋白为GST-Osx。结论成功构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,且GST-Osx融合蛋白可在大肠杆菌中诱导表达。     

人抗HBsAg单链抗体-Tat融合基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定

目的: 构建人抗HBsAg单链抗体-Tat蛋白转导结构域(ScFv-Tat)融合基因,在大肠杆菌中进行表达,并分析ScFv-Tat融合蛋白的活性及内化情况. 方法: 设计引物扩增人抗HBsAg单链抗体基因,克隆入含有蛋白转导结构域Tat序列的原核表达载体pTAT-HA,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达. 表达产物用SDS-PAGE及Western blot鉴定,用亲和层析柱纯化. 间接ELISA和ELISA竞争抑制实验分析ScFv-Tat融合蛋白的亲和活性,将纯化蛋白与HBsAg阳性或阴性肝癌细胞共孵育后,免疫细胞化学染色分析ScFv-Tat融合蛋白的结合及内化情况. 结果: 成功地构建了人抗HBsAg单链抗体-Tat融合蛋白的原核表达载体,在IPTG诱导下获得了表达,表达的ScFv-Tat融合蛋白具有与HBsAg结合的活性,并且能够特异性内化入HBsAg阳性肝癌细胞. 结论: 单链抗体与Tat蛋白转导结构域融合后,实现了ScFv-Tat融合蛋白的特异性内化,为该单链抗体的进一步应用奠定了基础.     

JC病毒衣壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 构建JC病毒衣壳蛋白VP1基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化该蛋白. 方法用PCR方法扩增患者尿液中JC病毒衣壳蛋白VP1的基因,测序正确后将其克隆入pET-32a(+)原核表达载体,IPTG诱导表达VP1融合蛋白.大量表达该融合蛋白并用镍柱亲和层析法纯化. 结果成功构建重组表达载体,30℃,IPTG诱导可见有融合蛋白表达,存在形式为包涵体.该融合蛋白相对分子质量约为59kDa.Western blot证明融合蛋白具有很好的抗原性.用镍柱亲和层析法成功纯化出VP1融合蛋白.结论 成功表达VP1融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

人组织型谷氨酰胺转氨酶基因的克隆 表达及纯化

目的:克隆人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,并进行原核表达及纯化.方法:从Caco-2细胞中提取总RNA,利用RT-PCR克隆人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,然后将其连接到原核表达载体pET-32a.将构建成功的重组表达载体pET-32a-TG2导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达His-TG2融合蛋白.用Ni-NTA蛋白纯化柱对融合蛋白进行纯化,采用Western Blotting检测重组蛋白的特异性.结果:成功克隆出人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,构建了pET-32a-TG2原核表达载体,并成功诱导了重组融合蛋白His-TG2的表达.结论:构建了表达人组织型谷氨酰胺转氨酶基因的原核表达系统,并成功对重组蛋白进行了纯化.     

铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达

目的 克隆铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,为进一步研究这七种含Pilz结构域蛋白是否为第二信使c-di-GMP潜在的受体分子奠定实验基础.方法 提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA,用PCR方法从中扩增出七种功能未知的含Pilz结构域蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.结果 成功扩增出七种含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,测序结果与NCBI数据库收录序列相一致.SDS-PAGE检验证明目的 基因在大肠杆菌BL21中获得高效表达.结论 从铜绿假单胞菌基因组中成功地克隆了七种含Pilz结构域蛋白基因,其构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21中获得了高效表达.     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

Tat融合蛋白表达载体TAT-OCT4的克隆化及蛋白表达研究

目的构建重组表达载体TAT-OCT4,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白。为进一步通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供物质基础。方法经RT-PCR获得编码人OCT4的全基因序列,连接到原核表达载体TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-OCT4,转化大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导TAT-OCT4融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导人皮肤成纤维（human skin fibroblasts,HSF）细胞的效果。结果成功构建了TAT-OCT4融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确。免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内。结论 TAT-OCT4融合蛋白可以安全,高效地转导入HSF细胞中。     

复苏促进因子Rpf结构域突变体蛋白的原核表达和纯化

【目的】构建藤黄微球菌复苏促进因子Rpf结构域突变体基因E54K、E54A的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达和纯化。【方法】采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域E54A、E54K突变体基因,连接进入pMD-18T载体中,测序正确的基因插入到pGEX-4T-1表达载体中,转化大肠杆菌DH5ct,经IPTG诱导,SDS—PAGE鉴定表达蛋白,利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western—blotting分析。用GS-4B亲和层析柱纯化目的蛋白。【结果】获得藤黄微球菌Rpf结构域E54K和E54A突变体基因,测序结果与GenBank公布的序列相同,突变体位点与设定一致;表达蛋白相对分子质量与文献报道一致;Western—blotting结果显示,在相对分子量约32KD处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带。通过GS-4B系统,得到纯化的GST融合蛋白。【结论】成功表达、纯化了Rpf结构域突变体E54K、E54A融合蛋白,为上述蛋白在结核病中的应用奠定基础。     

人FcγRIIb胞外区原核表达载体的构建及表达

目的构建人FcγRIIb胞外区蛋白原核表达载体pET-sFcγRIIb,诱导表达并纯化。方法 PCR扩增获得人sFcγRIIb基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达重组质粒pET-sFcγRIIb,经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,采用不同温度和时间的IPTG诱导蛋白表达,确定最佳诱导条件,SDS—PAGE分析正确后,用镍琼脂糖磁珠纯化。结果扩增出了人sFcγRIIb基因,成功构建原核表达重组质粒pET-sFcγRIIb,30℃10h IPTG诱导表达并纯化出41.5kDa的融合蛋白。结论获得重组人FcγRIIb胞外区蛋白,为以后人FcγRIIb胞外区蛋白功能的深入研究奠定基础。     

人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达

目的克隆人胸腺素α原/白介素2融合基因,构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法采用RT-PCR方法,从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素α原/白介素2基因,利用基因重组技术将融合基因片段重组于pET42a原核表达载体上,构建成pET42a-PI。经酶切、测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导蛋白表达。表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行Western blot分析,通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定。结果凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp,测序结果表明,扩增片段与预期序列一致。重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的蛋白,纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率,表明具有一定活性。结论成功克隆和构建了人胸腺素α原/白介素2融合基因的原核表达载体,并在原核表达系统中得到有效表达。     

GST-SRY融合蛋白原核表达和纯化

目的 构建GST-SRY融合蛋白原核表达载体, 在E.coli中诱导其表达, 并进行纯化.方法 PCR扩增SRY基因, 将SRY基因插入原核表达载体p GEX-6P-1, 经酶切和测序验证后, p GEX-6p-1-SRY转化到原核表达菌株E.coli Rosetta DE3, IPTG诱导表达GST-SRY融合蛋白, 用GST标签纯化树脂对其进行纯化.结果 经双酶切和测序证实p GEX-6P-1-SRY构建正确.重组质粒转化到Rosetta DE3经IPTG诱导后表达了分子质量单位约为49 KD的重组蛋白.结论 p GEX-6P-1-SRY原核表达载体构建成功, SRY蛋白成功诱导表达并纯化, 为今后深入研究SRY蛋白的功能奠定了实验基础.     

FAAP的原核表达、纯化与抗体制备

目的 构建pET28a-FAAP-His原核表达载体,表达His-FAAP融合蛋白,制备FAAP蛋白的多克隆抗体.方法 构建pET28a-FAAP-His原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达His-FAAP融合蛋白,用纯化的FAAP蛋白免疫昆明小白鼠后,制备多克隆抗体,通过Western blotting检验抗血清的特异性和灵敏性.结果 成功构建pET28a-FAAP-His原核表达栽体.在大肠杆菌BL21中经1mM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(isopropy-β -D-thiogalactoside,IPTG)37℃诱导4h后,融合蛋白有很高水平的表达.Western blotting结果显示FAAP抗体能够有效地检测人血管内皮脐静脉细胞内FAAP蛋白的表达.结论 成功地对FAAP进行了原核表达、纯化,抗FAAP小鼠的多克隆抗体具有较好的特异性,为进一步研究FAAP的结构与功能奠定了坚实的基础.     

胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽与肿瘤坏死因子的融合与鉴定

目的 将胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽pd20与人肿瘤坏死因子α(TNF-α)进行基因融合,并构建原核表达载体,表达pd20-TNF-α融合蛋白.方法 利用全基因合成法制备pd20-TNF-α融合基因,构建pd20-TNF-α原核表达载体,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达.对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot 检测分析.结果 成功构建了pd20-TNF-α重组融合质粒,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量约21000处出现了1条新生的蛋白条带,转印NC膜后该融合蛋白可与抗TNF-α单克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了pd20-TNF-α基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达,为下一步融合蛋白的纯化奠定了实验基础.     

改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体构建及表达的实验研究

目的 研究改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达.方法 首先通过基因拼接法合成VP3基因并委托生物技术公司合成改良型TAT基因.然后于原核表达载体pGEX-6p-1上构建改良型TAT-VP3融合蛋白的基因.最后将构建好的原核表达载体转导入基因工程菌DH-5α中并诱导其表达.结果 成功合成了VP3基因,构建了改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达载体,并经基因测序证明构建无误;成功的在基因工程菌DH-5α中诱导了改良型TAT-VP3融合蛋白的表达.结论 改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达是可行的,为进一步的蛋白制备及活性研究打下了基础.     

兔PKCε催化功能域在大肠杆菌中表达与部分纯化

目的通过构建蛋白激酶 Cε原核表达载体以获得纯化的 PKCε蛋白. 方法将 PKCε催化功能域(野生型和突变型)构建至原核表达载体 pUC18上形成重组质粒 pUC-CK和 pUC-CR, 将其转化至大肠杆菌 DH5α细胞中诱导其高效表达. 结果表达产物的 SDS-PAGE电泳及 Western blot检测表明,催化功能域在大肠杆菌中成功表达,并对其进行了部分纯化.结论获得纯化的 PKCε蛋白,为今后大量表达、纯化该酶蛋白作了前期铺垫.     

rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化

目的：构建人肿瘤坏死因子样分子1A（TL1A）原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法：人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15［pREP4］。IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)纯化靶蛋白。结果：目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15［pREP4］经IPTG诱导表达相对分子质量约22 000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合。结论：成功地构建了重组原核表达质粒pQE-Tl1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白。