VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨鸡贫血病毒VP3基因在人膀胱癌EJ细胞株中的表达,观察VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌EJ细胞株凋亡的效应。方法用真核表达载体PcDNA3-VP3转染人膀胱癌EJ细胞株,利用RT-PCR技术检测VP3基因在EJ细胞中的表达状况。观察VP3基因和10^-7mol／L、10^-8mol／L、10^-9mol／L浓度吉西他滨在体外单独或联合用药对人膀胱癌EJ细胞的增殖活性的影响,检测VP3基因和10^-8mol／L浓度吉西他滨在体外单独或联合用药对人膀胱癌EJ细胞的凋亡作用。结果转染PcDNA3-VP3后VP3基因在EJ细胞中表达。转染重组质粒PcDNA3-VP3、吉西他滨各浓度、VP3基因联合吉西他滨各浓度的EJ细胞株的增殖活性明显下降（P〈0．01）。透射电镜下观察到凋亡细胞的典型形态学特征。TUNAL法检测EJ细胞株凋亡率表现为：转染PcDNA3-VP3组高于对照组（P〈0．01）,10^-8mol／L浓度的吉西他滨组高于对照组（P〈0．01）,联合组高于转染PcDNA3-VP3组（P〈0．01）。结论VP3基因表达能高效诱导人膀胱癌EJ细胞株细胞凋亡,联合10^-8mol／L浓度的吉西他滨能增加VP3基因诱导的人膀胱癌EJ细胞株凋亡。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的抗胰腺癌细胞的作用

目的 ：探讨腺病毒介导的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因对人胰腺癌株Panc-1细胞的抑制作用及其机制。方法 ：利用腺病毒载体Ad-TRAIL将人类TRAIL全长cDNA转染导入Panc-1细胞。分别利用RT-PCR和Western blot检测TRAIL在mRNA 水平及蛋白水平的表达。利用MTT法测定细胞增殖活性及TRAIL基因的旁观效应。利用流式细胞仪检测胰腺癌细胞的凋亡率，并用Western blot检测procaspase-8和procaspase-3蛋白的表达。结果 ：Panc-1细胞感染Ad-TRAIL腺病毒后，可稳定地高表达TRAIL。Ad-TRAIL能显著抑制Panc-1细胞的生长。高表达TRAIL的转染细胞能通过旁观效应导致未转染细胞的生长抑制。Ad-TRAIL实验组的凋亡率显著高于对照组（ P <0.01），且Ad-TRAIL能使procaspase-8和procaspase-3蛋白表达下降。结论 ：Ad-TRAIL对胰腺癌Panc-1细胞具有明显的抑制作用，其机制可能与促凋亡和旁观效应有关。     

BAK基因过表达对膀胱癌细胞的诱导凋亡作用及其分子机制

目的：探讨BAK基因过表达对膀胱癌的诱导凋亡效应及机制。方法：脂质体介导BAK基因转染膀胱癌EJ细胞1－7d后，逆转录聚合酶链反应检测BAK基因表达，细胞计数法检测癌细胞生长活性，DNA Ladder法、吖啶橙－溴化乙锭荧光染色法及原位末端转移酶标记技术检测癌细胞凋亡，免疫组织化学法检测癌细胞Caspase-3、Bcl-2,p53表达。结果：转染1－7d后，癌细胞BAK基因表达显著增强（P＜0．01），体外生长抑制20．66％－35．58％（P＜0．01），部分癌细胞呈现凋亡形态学变化，凋亡率为18．0％－20．6％（P＜0．01），癌细胞Caspase-3表达增强6．6倍（P＜0．01）Bcl．2和P53表达差异无显著性（P＞0．05）。结论：BAK基因表达能显著诱导膀胱癌细胞凋亡，其中Caspase-3激活是其作用机制之一。     

促凋亡因子Omi/HtrA2对凋亡抑制蛋白表达及A549细胞凋亡的影响

目的观察Omi／HtrA2对凋亡抑制蛋白（XIAP）表达的影响和对肺癌A549细胞凋亡的影响。方法将构建的携带绿色荧光蛋白（GFP）和Omi／HtrA2基因的表达载体（PEGFP-N1-Omi）转染至人肺腺癌A549细胞中，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测Omi／HtrA2对XIAP转录和表达的影响，流式细胞仪检测Oml／HtrA2协同顺铂作用于A549细胞后该细胞的凋亡变化。结果Omi／HtrA2基因转染组XIAP的mRNA表达水平下降37％（P〈0．05），XIAP的蛋白表达水平下降69％（P〈0．05），顺铂诱导后，基因转染组细胞凋亡率为（36．00±1．95）％，显著高于对照组的细胞凋亡率（17．00±1．12）％（P〈0．05）。结论Omi／HtrA2通过抑制XIAP的抗凋亡作用可协同顺铂促进A549细胞凋亡。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体对肝细胞肝癌的抑制作用

目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体(TRAIL)对肝细胞肝癌的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白融合TRAIL质粒,转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721细胞后,分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测 TRAIL的表达,采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;体内实验建立裸鼠肝癌皮下模型,pIRES-EGFP-TRAIL直接瘤体注射,并观察TRAIL的抑癌作用。结果 真核表达质粒TRAIL体外转染肝癌细胞后,RT-PCR和 Western blot证实了肝癌细胞中有 TRAIL的表达,但对肝癌细胞的生长无显著性的抑制作用。体内直接瘤体注射 pIRES-EGFP-TRAIL 2周,RT-PCR证实瘤体有 TRAIL mRNA强表达,癌旁组织 TRAIL mRNA呈弱表达,正常肝无 TRAIL mRNA表达,但两组间肿瘤大小差异无显著性(P>0.05)。结论 肝细胞肝癌对TRAIL诱导的凋亡有耐药现象,提示HCC中存在抑制TRAIL诱导凋亡的因素,单一的TRAIL治疗HCC疗效有限。     

阿霉素协同TRAIL真核表达载体诱导前列腺癌细胞凋亡的研究

目的探讨阿霉素与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）真核表达载体诱导前列腺癌细胞凋亡的协同作用.方法 RT-PCR方法克隆人TRAIL全长基因,并插入真核表达载体pLXIN多克隆位点,经酶切和测序鉴定.将pLXIN-TRAIL质粒转染PC3-M细胞,RT-PCR方法检测外源性TRAIL表达率,TUNEL染色和流式细胞术比较单独表达TRAIL和联合应用阿霉素对PC3-M细胞凋亡率的影响,Western blot法检测经阿霉素诱导前后PC-3M细胞死亡受体-5（DR5）的表达变化.结果成功构建pLXIN-TRAIL真核表达载体,外源性TRAIL表达可以诱导PC-3M细胞凋亡,阿霉素能够增强TRAIL的凋亡诱导效应,6μg pLXIN-TRAIL质粒DNA组,加入1 mg/L阿霉素前后平均凋亡率分别为11.8%和20.7%,同时可提高PC-3M细胞DR5的表达. 结论 TRAIL真核表达载体介导的细胞凋亡是治疗前列腺癌的新途径,阿霉素可以通过提高DR5表达而增强PC-3M细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感性.     

NS-398和DHA联合抑制β-eatenin、c-mye对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响北大核心CSCD

目的研究选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）抑制剂NS-398和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）联合对胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及机制。方法体外培养胆管癌QBC939细胞,设立NS-398组、DHA组、联合组和空白组,将0,25,50,100,150,200μmol／L的NS-398和0,15,30,45,60,75μg／ml的DHA分别联合作用于QBC939细胞;应用CCK8法检测QBC939细胞的生长抑制率：采用流式细胞术检测细胞凋亡：应用实时荧光定量PCR、Western blot和ELISA检测细胞中β-catenin和c-myc的表达。结果NS-398和DHA在体外均能抑制QBC939细胞生长,NS-398为100pomol／L联合DHA为45μg／ml作用后,细胞生长抑制率达90％（F=5．85,P〈0．05）,二者联合能明显促进QBC939细胞凋亡（F=8．16,P〈0．01）。实时荧光定量PCR、Western blot和ELISA实验均显示联合能明显抑制β-catenin（F=7．61,P〈0．01）、（F=7．75,P〈0．01）、（F=8．17,P〈0．01）和c-myc（F=7．92,P〈0．01）、（F=8．76,P〈0．01）、（F=8．12,P〈0．01）表达。结论NS-398和DHA联合能明显抑制QBC939细胞生长,促进早期凋亡,二者联合对QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过抑制β-catenin和c-myc的表达,促进细胞早期凋亡。     

靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒（Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP）介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29（以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化，用噻唑蓝（MTT）法、吖啶橙／溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE／7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较，转染Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP后，HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低，其细胞死亡率和凋亡率显著提高（P〈0．05）。结论Ad-deIE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率，且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

小RNA干扰技术沉默Smoothened(Smo)基因表达对胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响

目的观察Smo基因在胃癌MGC803细胞中的表达，及其对胃癌MGC803细胞增殖与凋亡的作用。方法半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测胃癌MGC803细胞中Smo基因的表达；化学合成3条针对Smo mRNA的小干扰RNA（siRNA），阳性脂质体介导转染胃癌MGC803细胞，半定量RT-PCR筛选出降解胃癌MGC803细胞Smo mRNA最有效的siRNA；噻唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测胃癌MGC803细胞Smo mRNA被降解后，对细胞增殖和凋亡率的影响。结果胃癌MGC803细胞内有Smo蛋白及Smo mRNA的强表达，siRNA-1、siRNA-2对胃癌MGC803细胞Smo基因表达均有降解作用，siRNA-1降解作用最明显，达61．7％，与隐性对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。siRNA-1转染胃癌MGC803细胞24h后，细胞增殖水平较隐性对照组明显下降（P〈0．05）；转染48h后，细胞凋亡率较隐性对照组明显上升（P〈0．05）。结论胃癌MGCS03细胞内存在Smo基因的高表达，降低Smo基因表达可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，Smo基因具有调控胃癌细胞增殖和凋亡的作用。     

反义Survivin对人结肠癌细胞凋亡及耐药性的影响

目的 观察Survivin ASODN联合长春新碱（VCR）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）对人结肠癌细胞系HT-29凋亡的影响。方法 设计合成特异性Survivin反义寡核苷酸（ASODN）。HT-29细胞分成6组：空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、100、200、300nmol／L反义链转染组。以阳离子脂质体为载体转染至HT-29细胞内，用Westernblot法检测各组细胞Survivin蛋白表达情况；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；MTT法检测VCR、5-Fu对转染前后细胞的生长抑制情况。结果各浓度ASODN转染组癌细胞Survivin蛋白表达有不同程度减少，而各对照组细胞Survivin蛋白表达无明显变化。各ASODN转染组VCR、5-Fu对肿瘤细胞生长抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），且300nmol／L转染组明显高于100和200nmol／L组（P〈0．05）。ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组（P〈0．05），以300nmol／L转染组加VCR作用后凋亡指数最高（P〈0．01）。结论Survivin ASODN转染人结肠癌细胞能下调Survivin蛋白的表达，诱导结肠癌细胞凋亡，抑制细胞增值，增加结肠癌细胞对化疗药物的敏感性。     

外源性p16基因导入对人膀胱癌细胞的作用

目的 通过外源性野生型Ｐ１６基因,纯翕生缺失及具有内源性Ｐ１６基因表达的膀胱癌细胞系２５３Ｊ和ＥＪ,地肿瘤细胞的生长抑制作用,并探讨共作用机制。方法 构建Ｐ１６逆转逆转录病毒表达载体,经细胞ＰＡ３４１７包装,膀胱癌细胞系;应用Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交及免疫细胞化学方法检测外源１６基因的表达;流式我仪检测细胞周期;原位细胞凋亡检测及透射电镜观察细胞凋亡;并对导入的Ｐ１６基因的细胞进行鼠致瘤能力及病理不特性     

稳定表达LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1的建立和鉴定

目的 建立稳定表达外源性LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1.方法 利用脂质体介导的基因转染技术将质粒转染人人膀胱癌细胞株BIU87,实验分为3组:BIU87-LRIG1组(转染pLRIG1-GFP)、BIU87组(未转染质粒)和BIU87-neo组(转染pEGFP-N1).经用G418筛选3周后出现抗性克隆,对其扩大培养后,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分析各组中LIRG1 mRNA及其蛋白表达.结果 RT-PCR结果 表明,BIU87-LRIGl组中LRIG1 mRNA的表达水平(2.352 ±0.133)较BIU87-neo组(0.642±0.091)和BIU87组(0.516±0.045)明显升高;Western blot结果 显示,BIU87-LRIG1组LRIG1蛋白表达水平(2.120±0.113)较BIU87组(0.946±0.075)和BIU87-neo组(1.132±0.076)明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 成功建立了稳定表达外源性LRIG1基因的人膀胱癌细胞株BIU87-LRIG1.     

逆转录病毒介导HyTK基因治疗膀胱癌的实验研究

目的 了解逆洋病毒介导的潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ＴＫ的融合基因（ＨｙＴＫ）的基因转移移联合更昔洛韦（ＧＣＶ）对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法 构建重组质粒ＰＬ（ＨｙＴＫ）ＳＮ,应用非脂质体基因转导系统ＦｕＧＥＮＥ＾ＴＭ６及“乒乓效应”（ｐｉｎｇ－ｐｏｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）,获 滴度重组病毒并转染膀胱朱ＥＪ／ＨｙＴＫ的杀伤作用。结果 本文实验逆转录病毒的效率为３５％左右,Ｓｏｕｔｈｅｍ Ｂｌｏｔ、     

重组人pEGFP-heNOS质粒的构建及其在人内皮祖细胞中的表达

目的构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因(EGFP)的人内皮一氧化氮合酶(heNOS)重组质粒,观察其在人骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)中的表达。方法构建重组人pEGFP-heNOS质粒,脂质体转染人骨髓来源的内皮祖细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测heNOS在内皮祖细胞中的表达。结果重组人pEGFP-heNOS质粒构建成功,体外转染人人内皮祖细胞中,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测到heNOS的表达。结论重组人pEGFP-heNOS质粒体外转染人内皮祖细胞后,目的基因能够在细胞中有效表达,为下一步基因治疗提供了理论支持。     

稳定高表达Uroplakin Ⅱ基因人膀胱癌细胞株的建立及其意义

目的　建立稳定高表达UroplakinII(UPII)基因的人膀胱癌细胞株。方法　采用分子克隆技术构建含全长UPII结构基因的真核表达载体 ,进行酶切鉴定、核酸序列分析 ,并将其在阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0的介导下转染UPII基因缺陷型膀胱移行细胞癌 (TCC)细胞株EJ ,经G418筛选获得抗性亚克隆细胞株 ;逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblotting方法对亚克隆细胞株进行UPII基因表达鉴定。结果　所获UPII基因真核表达载体pcDNA3 UPII转染EJ细胞后 ,通过G418持续压力筛选 4周获得亚克隆细胞株EJ/UPII ;RT PCR、Westernblotting均未检测到EJ细胞的UPII基因表达 ,而EJ/UPII细胞中UPIImRNA和蛋白表达水平显著增高 (P <0 .0 1)。结论　通过基因转染方法建立了稳定高表达UPII基因的膀胱TCC细胞株 ,为进一步探讨UPII基因在膀胱TCC生物学行为中的作用及其靶向生物治疗策略奠定了基础。     

小干扰RNA抑制雄激素受体基因表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制雄激素受体(AR)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响.方法 化学合成针对AR的siRNA,用脂质体转染T24细胞.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测AR mRNA和蛋白的变化.转染细胞48 h后用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活性的变化,流式细胞术检测细胞的凋亡状况.结果 成功的转染T24细胞,实时荧光定量RT-PCR筛选出一条AR mRNA抑制效率最高的siRNA,行Western blot检测可抑制AR蛋白表达至70.3%.转染细胞48 h后,T24细胞增殖活性抑制率达到(25.9±5.4)%,细胞凋亡率达到21.61%.结论 应用siRNA干扰技术能有效的抑制AR基因的表达,同时可抑制人膀胱癌T24细胞的体外增殖活性及促进其凋亡的发生.     

Uromodulin基因启动子在真核细胞中表达的特异性及活性

目的 观察Uromodulin基因启动子在各种真核细胞中表达的特异性及活性.方法 对含Uromodulin基因启动子的真核表达质粒pEGFP-URO进行测序鉴定,利用脂质体转染技术,将质粒转染人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)、人肾癌细胞株(ACHN)、人膀胱癌细胞株(T24)、大鼠系膜细胞株(HBZY-1),用荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.经激发光照射后发出绿色荧光的为阳性细胞,并和pEGFP-N3进行对照研究.结果 转染24 h后HK-2、ACHN阳性率较高(7～12/HP),流式检测结果为13.2%和11.4%;而T24、HBZY-1阳性率较低(0～1/HP),流式检测结果为0%和0.8%.pEGFP-N3在各组细胞中均有较高表达,其阳性率分别为23.08%(HK-2)、19.24%(ACHN)、26.14%(T24)和18.03%(HBZY-1).结论 小鼠Uromodulin基因启动子在HK-2及ACHN中具有特异性的启动活性,其活性约为CMV的50%.     

重组质粒pEGFP-N2-GPC3的构建及GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进细胞增殖的影响

目的 构建GPC3基因真核表达重组质粒,观察GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进肝癌细胞增殖的影响.方法 自行设计引物从GPC3原核扩增重组质粒pDNR-LIB.GPC3中获得编码GPC3的基因片段.应用基因重组技术,将GPC3基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,然后经脂质体介导转染SK-Hep-1,并通过C418(600 mg/L)筛选出抗性克隆,应用荧光显微镜及逆转录-聚合酶链反应(RT-PER)法对转染细胞内pEGFP-GPC3的表达进行鉴定,采用噻唑蓝(MTT)比色法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2促细胞增殖效应的影响.结果 限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的SK-Hep-1胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR表明GPC3在SK-Hep-1中成功表达,生长因子实验中,GPC3明显抑制FGF2促细胞增殖效应,与空质粒转染组比较差异有统计学意义(P<0.05),IGF2实验组与空质粒转染组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 测序表明,编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用.     

超声靶向微泡破裂介导EGFP质粒转染肝癌细胞的研究

目的探讨超声靶向微泡破裂(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD)介导EGFP质粒转染肝癌细胞株HepG2的有效性、安全性并优化超声辐照参数。方法体外培养HepG2细胞,在不同治疗超声的声强、占空比和辐照时间作用下,观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中的转染。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪检测细胞的转染率,MTT法检测细胞活性。结果在超声声强为2 w/cm2、占空比为20%、照射时间为60 s时,HepG2细胞的7转染率最高,达到11.53%±2.15%,且细胞生存率大于85%。结论 UTMD是一种有效的基因转染方法,不同的超声转染参数对细胞活力和基因传输效率有较大影响,对其进行优化后可减少细胞损伤,增强基因转染。