高通量测序技术在新生儿地中海贫血基因筛查中的应用

目的分析高通量测序技术在新生儿地中海贫血基因筛查中的检测效能。方法选取2018年9月-2019年6月在我院接受孕前检查的627例孕妇作为本次对照实验的研究对象,均对其使用高通量测序技术及常规筛查两种方法进行地中海贫血基因筛查,详细记录两种筛查方法的检测效能。结果在627例接受孕前检查的孕妇中,通过多种方法学检测,地中海贫血基因阳性检出219例,占比34.92%,219例阳性孕妇中,α-地贫基因者135例,占比61.64%,β-地贫基因74例,占比33.78%,α合并β地贫基因10例,占比4.56%。通过对219例孕妇采用高通量测序技术进行检测,准确检测出217例,误诊2例,准确率99.08%;而对孕妇实施规筛查,准确检测出168例,准确率76.71%。由此可见,高通量测序技术的检查准确率较高,且明显高于常规筛查,数据间差异具有明显可比性(P<0.05)。结论通过使用高通量测序技术来对产前孕妇进行地中海贫血基因进行筛查,准确率高,为孕妇提供优生优育咨询,防止出生缺陷等方面具有重要意义。     

500例地中海贫血基因检测分析

目的分析地中海贫血基因监测诊断的相关内容,为该疾病产前诊断与遗传咨询提供参考。方法选取500例孕妇为研究对象,采用跨越断裂点的PCR(GAP-PCR)和反向点杂交(RDB)技术分析本组孕妇α珠蛋白和β珠蛋白基因缺失与突变情况,并通过NGS测序法进行文库构建,结果进行生物信息学分析。结果在本文所选择的500例样本中,共筛查出49例地中海贫血阳性的孕妇,其中α地中海贫血基因携带者28例,β地中海贫血基因携带者19例,α合并β地中海贫血2例。结论本地区孕妇的地中海贫血基因检测阳性率相对较高,因此为了能够切实保证母婴安全,在孕前产前筛查中应该高度重视地中海贫血基因筛查,这是降低妊娠不良事件发生率的关键。     

目标基因捕获测序技术检测1例肥厚型心肌病致病基因突变

目的通过靶向捕获高通量测序技术初步筛查肥厚型心肌病(HCM)致病基因突变。方法收集1例HCM患者临床信息和外周血,并提取基因组DNA,制备DNA全基因组文库。挑选导致HCM的8个候选基因,用GenCap基因序列捕获技术靶向富集该患者外周血DNA候选基因并行高通量测序。通过生物信息学分析筛选致病突变。用Sanger测序来验证相应致病基因突变位点。结果目标基因靶向捕获测序结果经与公共数据库和内部健康人测序数据库对比,发现致病基因突变位点MYBPC3 D770N,该致病基因突变与Sanger测序结果一致。结论用目标基因靶向捕获测序技术可实现对HCM致病基因突变的初步筛查,对HCM的临床基因诊断具有潜在的应用价值。     

妊娠期糖尿病孕妇外周血胎儿游离DNA检测及其临床意义

目的通过检测妊娠期糖尿病孕妇外周血胎儿游离DNA浓度变化,分析基因表达水平是否正常,为诊断和阐明妊娠期糖尿病及其遗传效应提供理论依据。方法用血浆基因组DNA磁珠法抽提12~25周孕早中期孕妇外周血中胎儿游离DNA,妊娠期糖尿病组和健康对照组各15例,通过高通量测序检测孕妇胎儿染色体基因拷贝数及评估其风险值。结果与健康对照组比较,妊娠期糖尿病组的孕妇胎儿游离DNA文库浓度差异无统计学意义(P>0.05),染色体基因拷贝数无显著变化,但个别存在18号染色体基因微重复,可能与妊娠期糖尿病基因表达异常相关。结论对妊娠期糖尿病孕妇外周血胎儿游离DNA检测,将有助于进一步研究妊娠期糖尿病形成的分子机制及其临床诊断。     

孕妇血浆中胎儿游离 DNA 在唐氏综合征无创性产前诊断中的应用研究

目的：探讨应用孕妇血浆中游离胎儿高通量基因测序技术在无创性产前诊断中的可行性。方法对3368例孕妇进行中孕期血清学筛查的同时,筛查出的高风险病例平行进行 cffDNA 高通量测序;对需进行产前诊断者,同时进行胎儿染色体核型以及 MLPA 分析。结果中孕期三联血清学筛查3368例,血清学筛查21三体高危共347例,经高通量基因测序技术检测后结果为唐氏高危20例;经 MLPA 分析,结果得出347例标本中21-三体病例为20例;最后通过羊水细胞核型分析证实20例与无创基因检测结果一致。应用孕妇血浆中游离胎儿 DNA高通量基因测序技术诊断胎儿的21号染色体非整倍体异常的敏感度为100．00％（20/20）,特异性为100．00％（347/347）,假阳性率为0．00％（0/347）。结论无创性产前诊断技术具有无创、准确、快速的诊断优势,该技术具有良好的临床应用前景。     

高通量测序技术筛检地中海贫血的临床意义

目的:评价高通量测序(NGS)技术在地中海贫血基因筛查中的诊断价值。方法:收集2014年10月-2016年10月在东莞市第三人民医院产科进行孕前或孕期检查的2 858例广东户籍夫妇的外周血,进行血常规检测、血红蛋白电泳分析,传统地中海贫血基因筛查及高通量测序。结果:运用NGS筛选α地中海贫血和β地中海贫血的漏诊率分别为0.87%、1.59%,传统筛查模式筛选α地中海贫血和β地中海贫血的漏诊率分别为26.77%、2.38%;运用NGS筛选α地中海贫血和β地中海贫血ROC曲线下面积分别为0.994和0.991,而传统筛查模式筛选的地中海贫血ROC曲线下面积分别为0.866和0.988;运用NGS进行α和β地中海贫血筛查的灵敏度、漏诊率、约登指数、阴性预测值优于运用传统筛查模式。结论:与传统筛查模式相比,NGS筛查地中海贫血基因的结果精确度高,可避免了常规方法的漏诊,因而诊断价值高,可广泛应用于临床,为地中海贫血的早期诊断提供保障。     

孕妇血浆游离DNA高通量测序用于胎儿性染色体非整倍体检测的初步探讨

摘要：目的：初步探讨孕妇血浆游离DNA高通量测序用于产前胎儿性染色体非整倍体检测的效果及临床可行性。 方法：2011年至2012年收集早、中孕期单胎孕妇5 540例,在知情同意的原则下采集外周血血浆进行游离DNA的高通量测序检测,通过生物信息学分析,获得测序结果;对测序检出的性染色体非整倍体患者行羊水穿刺,进行染色体G显带分析。 结果：5 540例样本中测序方法共检出10例性染色体非整倍体,其中6例与G带核型分析结果一致,包括3例45,X,1例47,XXY,2例47,XYY,其余4例G带核型正常。 结论：孕母血浆游离DNA高通量测序可对性染色体非整倍体胎儿进行无创性产前检测,但存在假阳性,还需进一步完善实验方案以提高检测效果。     

基于第三代基因测序对地中海贫血基因检测的研究进展

地中海贫血是世界上分布最广泛的单基因常染色体隐性遗传病,其临床表现从无症状到需要持续输血来维系生命的严重贫血,这对社会及家庭造成了严重的经济负担,因此,在产前进行相应的筛查与诊断很有必要。常规的检测方法大多只能检测出常见的地中海贫血基因型,对于罕见的基因变异容易造成误诊或漏诊,这对于临床遗传咨询造成一定困难。第三代基因测序(Third-generation sequencing, TGS)目前已应用于地中海贫血基因的检测,相较于常规检测方法,其更加准确、可靠,更具有优越性。本文就第三代基因测序技术在地中海贫血基因检测方面的最新研究进展作一综述。     

采用Amplicon文库构建法对地中海贫血的基因检测

目的 进一步完善现有地中海贫血的检测方法并且建立一种新的基于高通量测序的基因诊断方法,研究α/β地中海贫血基因的突变类型及分布情况.方法 采用Amplicon文库构建法,基于高通量测序平台,对219例地中海贫血患者全血样本进行上机测序与数据分析. 结果 在219例地中海贫血患者中,共计检测出14种突变类型,包括CD122、CD125、CD142 3种非缺失型α-地贫突变及IVS-Ⅱ-654、CD41-42、CD17等11种常见β-地贫突变型别.此外,通过生物信息学软件作图分析,筛查出--SEA、-α37、-α42 3种缺失型α-地贫. 结论 本研究进一步完善了基于高通量测序的基因诊断方法,建立了一套Amplicon文库构建法,能准确、有效地用于诊断α/β地中海贫血基因的缺失与突变类型,对人群筛查,优生优育的遗传咨询,防止该病重症患儿的出生等具有重要意义.     

唐氏综合征高危孕妇血浆中游离胎儿DNA的Y染色体微缺失筛查

目的 利用孕妇血浆中游离胎儿DNA在孕早期进行Y染色体微缺失筛查,诊断男性胎儿无精子症因子(AZF)缺失情况。方法 留取2013年6月～2014年8月参加产前检测的16～34孕周唐氏综合征筛查高危孕妇的外周血标本89例,提取出全血基因组DNA后利用Y染色体微缺失检测试剂盒检测AZF微缺失。结果 86例孕妇妊娠至胎儿出生,其中男胎孕妇45例,女胎孕妇41例。妊娠女性胎儿的孕妇血浆DNA仅扩增出ZFX/ZFY对照基因,而妊娠男性胎儿的孕妇血浆DNA同时扩增出SRY,ZFX/ZFY对照基因,且有3例样本检测出AZF基因微缺失。结论 通过提取孕妇血浆中游离胎儿DNA能够检测出胎儿是否伴有AZF基因微缺失,从而提前预测胎儿今后罹患生精障碍的风险。     

孕妇外周血胎儿游离DNA在产前筛查胎儿染色体非整倍体疾病中的价值

目的探讨孕妇外周血胎儿游离DNA在产前筛查胎儿染色体非整倍体疾病中的临床应用价值。方法接受产前诊断孕12~26周孕妇4 300例,采集外周血提取胎儿游离DNA,应用高通量测序技术检测风险值,对检测结果提示高风险者进一步行羊水穿刺胎儿染色体核型分析及基因芯片检测,对检测结果提示低风险者电话随访至分娩。结果胎儿游离DNA高通量测序检测提示高风险者45例,其中21-三体综合征29例,18-三体综合征11例,13-三体综合征5例;1例13-三体综合征羊水穿刺胎儿染色体核型分析未见异常,基因芯片检测发现孕妇13号染色体存在微重复,余44例高风险妊娠均经羊水穿刺胎儿染色体核型分析证实;胎儿游离DNA高通量测序提示低风险4 255例,其中3 008例完成随访,新生儿未见明显异常。结论孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查可高效、准确筛查胎儿染色体非整倍体疾病,且较介入性产前诊断易接受,具有较好的临床应用价值。     

无创产前基因检测在血清学筛查结果为高风险的非高龄孕妇中的应用

目的探讨用无创产前基因检测(NIPT)对血清学标志物筛查结果为高风险的非高龄孕妇(18~34岁)进行产前诊断的意义。方法选取4 168例血清学标志物筛查结果为高风险的非高龄孕妇,用高通量测序技术检测孕妇血浆中胎儿游离DNA(cff DNA),对检测结果为高危的孕妇进行胎儿染色体核型分析,个别病例用微阵列比较基因组杂交技术(array-CGH)验证。结果 NIPT结果显示共有41例孕妇为高风险,阳性率为0.98%,包括32例21-三体综合征(T21),4例18-三体综合征(T18),1例13-三体综合征(T13),4例性染色体异常;经胎儿核型分析证实为30例T21,2例核型正常;另外9例NIPT检测其他染色体非整体结果为高风险者经胎儿核型分析证实为3例T18,1例T13,2例性染色体异常;1例经NIPT检测为45,XO,而胎儿核型分析为46,XX,del(X)(q23→q25),array-CGH验证缺失片段大小为11.6×106bp。结论 NIPT用于血清学筛查结果为高风险的非高龄孕妇检测可减少侵入性的产前诊断,但存在一定的假阳性,仍需有创检查进行确诊。     

基于高通量测序技术的重庆市渝中区育龄人群地中海贫血流行病调查及基因分析

目的:调查重庆市渝中区育龄人群地中海贫血携带率,了解本地区地中海贫血基因的分布。方法:对重庆渝中区1000对孕前检查夫妇进行调查,抽取外周静脉血,采取高通量测序技术进行地中海贫血基因的筛查。结果:1000对孕前检查夫妇中,地中海贫血基因携带率为7.45%,α地中海贫血基因携带率为4.60%,β地中海贫血基因携带率为2.10%。其中α地中海贫血基因型主要为αα/-α3.7(53.26%)、αα/--SEA(23.91%)、αα/-α4.2(11.96%);β地中海贫血基因型主要为Codons17(A T)(26.19%)、Condon41/42(-TTCT)(26.19%)、IVS-Ⅱ-654(C T)(14.29%)。同时,检测出3例α、β复合型地中海贫血,3对同型地中海贫血基因夫妇,新发现基因5种12例。结论:重庆市渝中区为地中海贫血高发区,基因突变类型较为多样,在孕前对备孕夫妇进行地中海贫血筛查,对提高出生人口质量有重要的意义。     

孕妇血浆游离胎儿DNA中地中海贫血突变的基因诊断

本研究旨在建立一种妊娠早期、简便、快速且无创伤性的检测胎儿常见地中海贫血突变的导流杂交技术,用于地中海贫血的产前诊断.采用PCR技术与低密度基因芯片导流杂交技术相结合,设计6组PCR引物单管多重PCR体系及29种DNA探针,快速检测60例妊娠5-17周贫血孕妇血浆游离胎儿DNA中缺失型α-地中海贫血及β-地中海贫血.结果表明：60例贫血孕妇血浆的游离胎儿DNA中,检出缺失型α-地中海贫血胎儿4例,β-地中海贫血胎儿3例,α及β混合型-地中海贫血胎儿1例.结论：采用本检测方法能快速准确地检测出3种常见的缺失型α-地中海贫血及17种常见β-地中海贫血的突变.     

血浆游离DNA高通量测序用于21-三体综合征无创产前检测

目的初步探讨高通量测序技术检测孕母血浆游离DNA用于21-三体综合征(T-21S)胎儿产前诊断的可行性。方法收集10例T-21S胎儿的孕母血浆和100例健康胎儿孕母血浆(均经过羊水细胞G显带核型确认),分别作为T-21S组和健康对照组,用高通量测序技术对两组标本进行检测,数据经生物信息学统计分析,并将两组测序结果与羊水细胞染色体核型结果比较,评价高通量测序技术的检测效果。结果 10例T-21S组和99例健康对照组的测序结果与羊水细胞染色体核型结果符合率为100%,另1例健康孕妇血浆因胎儿DNA浓度较低未达到检测要求。结论孕母血浆游离DNA高通量测序检测技术用于T-21S胎儿产前诊断具有无创伤、高通量、高准确率等优点,有重要的临床应用价值。     

用不提取核酸PCR扩增孕妇血浆中胎儿游离DNA的SRY和FMR1基因

摘要：目的：建立一种不提取核酸的孕妇血浆中胎儿游离DNA的检测方法。 方法：构建不提取核酸PCR法,用巢式PCR扩增Y染色体上的SRY基因序列和X染色体上的FMR1基因序列,检测44例孕妇血浆中游离DNA。根据随访判断结果的准确性。 结果：44例孕妇经随访确认24例有男性胎儿,20例有女性胎儿。24例孕男性胎儿的孕妇血浆标本中有21例扩增出SRY基因和FMR1基因,敏感性为87.5%（21/24);20例孕女性胎儿的孕妇血浆标本中有17例扩增出FMR1基因,敏感性为85.0%（17/20)。 结论：建立的不提取核酸PCR法具有快速、简便等优点,可用于性连锁遗传病的产前诊断。     

高通量测序技术在遗传性白内障诊断中的应用研究

目的探讨高通量测序技术在遗传性白内障诊断中的应用价值。方法提取先证者(34岁先天性白内障孕妇)及其家系18例家庭成员外周血全基因组DNA,采用高通量测序法筛查先证者可疑致病突变位点,采用Sanger测序方法验证先证者及其他家庭成员的可疑致病位点,在先证者孕16周时进行羊水穿刺,提取胎儿DNA并采用Sanger测序法进行验证。结果先证者和家系另10例患者均存在GJA3基因(NM_021954.3)c.176 CT位点错义杂合突变,8例表型正常的家系成员和胎儿均未检测到该位点突变。结论 GJA3基因c.176 CT位点错义杂合突变为该家系致病基因突变,该突变位点具有致病性;高通量测序结合Sanger测序技术是一种成本相对较低、速度较快、结果可靠的分子诊断方法,可应用到先天性白内障的诊断及家庭成员的生育指导。     

孕妇血浆游离胎儿DNA中缺失型α-地中海贫血的检测

本研究旨在建立一种孕早期、简便、快速且无创伤性的检测胎儿常见缺失型α-地中海贫血突变的单管多重PCR技术,用于α-地中海贫血的产前诊断。选择50例妊娠14—20周的贫血孕妇,采用gap—PCR方案设计4组PCR引物单管多重PCR体系,快速地检测孕妇血浆游离胎儿DNA中缺失型α-地中海贫血。结果表明：在50例贫血孕妇血浆的游离胎儿DNA中检出5例α-地中海贫血,其中3例为东南亚型缺失^--SEA,2例为右侧缺失-α^3.7。结论：采用单管多重PCR检测技术能快速准确地检测出3种最常见缺失型α-地中海贫血,对于防止α-地中海贫血患儿出生、提高人口素质、减轻社会负担有重要意义。     

孕妇血浆中胎儿游离DNA的提取

目的 探索从孕妇外周血浆中检测胎儿游离DNA（cfDNA）,评估利用cfDNA进行无创性产前基因诊断的可行性.方法 收集30例孕妇的外周血,利用柱吸收的方法提取血浆中的cfDNA,经琼脂糖凝胶电泳分离富集小片段cfDNA,用巢式PCR技术扩增胎儿SRY基因.结果 18例孕男胎的孕妇血浆中有16例经巢式PCR扩增出Y染色体SRY基因,12例孕女胎的孕妇血浆中均未扩增出SRY基因.结论 利用琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,可以选择性富集孕妇外周血中的胎儿cfDNA,可用于无创性产前诊断.     

不同妊娠状态下母体循环中胎儿游离DNA—SRY基因的定量检测

目的 依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA并加以鉴定,预防X连锁遗传病患儿的出生.方法 从孕早期、中期及晚期共80名孕妇外周血浆中分离胎儿DNA,采用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain-reaction,FQ-PCR)方法对不同妊娠状态下孕妇外周血中游离的胎儿DNA(fDNA)进行定量分析,初步探讨游离fDNA在不同妊娠状态下的浓度变化,为尽早应用于临床提供科学依据.结果 早孕组28例血浆标本中有25例检测到SRY基因,其平均浓度为58.82 copies/ml,实测浓度范围为33.7～126.2 copies/ml;中孕组20例血浆标本中均检测到SRY基因,其平均浓度为152.08 copies/ml,实测浓度范围为37.7～390.2 copies/ml;晚孕组32例血浆标本中均检测到SRY基因,其平均浓度为212.34 copies/ml,实测浓度范围为87.90～493.56 copies/ml.组间两两比较,差异有统计学显著性意义(P＜0.01).结论 用实时荧光定量PCR的方法最早在孕62 d的孕妇外周血浆中就可以检测到胎儿SRY基因,随孕周的增加,母血中胎儿DNA的量也在逐渐增加.实时荧光定量PCR技术在进行无创性产前诊断中有重要的价值.