HDAC2基因RNA干扰载体的构建

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)基因RNA慢病毒干扰质粒载体.方法:对比HDAC2基因序列,设计并合成短发夹RNA(shRNA)干扰靶点序列,克隆入经AgeI与EcoRI双酶切后的RNA干扰载体pLKO.1-puro,构建pLKO.1-HDAC2-shRNA重组质粒,采用酶切法和测序法验证重组质粒.结果:成功退火合成3对短发夹RNA序列并将其克隆入pLKO.1-puro载体中,构建重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、pLKO.1-HDAC2-shRNA2及pLKO.1-HDAC2-shRNA3,经酶切鉴定和测序验证重组质粒载体与预期靶序列相同.结论:成功构建HDAC2-shRNA慢病毒干扰载体,为进一步研究HDAC2的功能及应用提供有效工具.     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

逆转录病毒介导ARLTS1基因表达抑制肝癌细胞HepG2的增殖

目的 构建高表达ARLTS1基因的逆转录病毒栽体(PLEGFP-IRES-ARLTS1),探讨外源性ARLTS1基因对人肝癌细胞HepG2增殖的影响.方法 RT-PCR扩增ARLTS1 cDNA,克隆至重组逆转录病毒载体PLEGFP-IRES.重组质粒转染病毒包装细胞PT67,产生病毒后感染HepG2细胞,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达,Western Blot检测细胞内ARLTS1蛋白表达,并对感染后细胞的增殖状况进行分析.结果 酶切及基因测序证实重组质粒PLEGFP-IRES-ARLTS1构建成功;荧光显微镜观察到70%左右靶细胞内有绿色荧光蛋白表达;Westem Blot证实,ARLTS1蛋白在HepG2-ARLTS1内表达显著升高;MTT实验显示,HepG-2-ARLTS1细胞组体外增殖率较各对照组明显降低(P<0.05).结论 获得了稳定表达外源性ARLTS1蛋白的HepG2细胞株,外源性ARLTS1抑制HepG2细胞增殖,为后续研究ARLTS1抗肿瘤机制奠定了基础.     

慢病毒载体介导的RNAi技术构建稳定抑制β-catenin的人鼻咽癌细胞株

目的建立稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在鼻咽癌发生中的作用提供细胞模型。方法于β-catenin CTNNB1基因编码区选择3个siRNA靶点合成3对shRNA干扰序列,分别与pLKO.1载体连接,构建pLKO.1-sh-β-catenin质粒(干扰组1)、pLVTHM-sh-β-catenin(干扰组2)和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒(阴性对照组);将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集含慢病毒颗粒的上清液感染人鼻咽癌6-10B细胞,感染pLKO.1-sh-β-catenin和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒的细胞经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株。Western blot检测干扰组β-catenin抑制效率及下游基因c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测比较细胞增殖状况,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移率。结果 Western blot检测结果显示pLKO.1-sh-β-catenin(干扰组1)干扰效率最佳,β-catenin及c-myc蛋白表达减少;MTT检测显示干扰β-catenin后细胞吸光度下降,细胞增殖受到抑制;穿过Transwell小室底膜的细胞数:干扰组1为(23.5±4.6)个,明显低于阴性对照组(50.3±5.3,P<0.01)及空白对照组(54.3±5.6,P<0.01)。结论成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为进一步研究以β-catenin为靶点的鼻咽癌基因治疗奠定基础。     

MTA1靶向RNA干扰对人肝癌HepG2细胞生物学行为影响的研究

目的 观察转移相关基因1(MTA1)特异性siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 体外构建2个MTA1特异性siRNA表达载体(pRNAi-1、pRNAi-2),实验分为脂质体对照、空质粒转染对照及MTA1 siRNA重组质粒转染组,转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量RT-PCR检测MTA1 mRNA表达情况,检验其对细胞的RNA干扰效果;采用MTT法分析其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响.结果 测序表明MTA1干扰序列完全正确;pRNAi-1与pRNAi-2表达质粒有效抑制肝癌细胞株HepG2细胞中MTA1的表达,MTT 法检测结果显示转染重组质粒组细胞体外生长的抑制率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01);流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01).结论 成功构建了MTA1干扰真核表达载体,重组MTA1特异性siRNA质粒可抑制肝癌细胞中MTA1的表达,并抑制肝癌细胞生长,促进其凋亡.     

RNAi cyclin E对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨RNAi cyclin E对肝癌细胞生长的影响。方法:肝癌细胞系HepG2采用体外培养,选取siRNA合成双链发卡样DNA;将其重组入pGFP-V-RS得到重组子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RSsiCE1122;两重组子分别进行DNA序列测定、同源性比较;将两重组子和pGFP-V-Con分别转入人肝癌HepG2细胞中,同时设空白对照组(不转染任何质粒,仅加转染试剂)。检测4组HepG2细胞cyclin E mRNA表达情况及细胞的增殖情况。结果:经过同源性检索和优选确定cyclin E基因的siRNA载体pGFP-V-RSsiCE951和pGFP-V-RS-siCE1122;干扰1组(转染pGFP-V-RS-siCE951)和干扰2组(转染pGFP-V-RSsiCE1122)细胞cyclin E mRNA的相对表达量显著低于空白对照组和无关siRNA对照组(P<0.05);干扰1组和干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组比较,在3、4、5 d细胞孔内的吸光度值显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:siRNA载体pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122转染人肝癌HepG2细胞能显著降低细胞cyclin E基因的表达,是理想的siRNA靶区段。抑制肝癌HepG2细胞cyclin E基因表达,可以降低肝癌HepG2细胞的生长速度。     

shRNA抑制COX-2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制COX-2基因,观察其对肝癌细胞HepG2生长的影响.方法:构建靶向抑制COX-2基因表达的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载pshRNA-COX-2,转染肝癌细胞HepG2,用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA和蛋白水平检测其对COX-2的抑制效应,MTT法检测对HepG2细胞生长的影响.结果:与未转染组相比,pshRNA-COX-2重组表达质粒抑制了HepG2细胞COX-2 mRNA及蛋白表达,抑制率分别为69.9%和50.3%;并可抑制HepG2细胞生长,72 h后有统计学差异(P＜0.05).结论:pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制肝癌细胞COX-2基因表达,从而抑制肿瘤细胞增殖.     

CDK2干扰RNA对人肝癌细胞HepG_2细胞周期和增殖的影响

目的:探讨CDK2 siRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞CDK2 mRNA表达及其对HepG2细胞周期和增殖的影响.方法:利用脂质体转染法将特异性的携带绿色荧光蛋白的CDK2干扰RNA的重组质粒PGenesil-1-CDK2导入HepG2细胞,同时设立阴性对照空载体转染组PGenesil-1-HK.G418筛选稳定表达细胞株扩增培养.并用倒置荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术(FCM),分别检测转染后的HepG2细胞CDK2 mRNA和细胞周期的变化,噻唑蓝(MTT)法检测癌细胞生长增殖率.结果:经1mo的G418筛选得到稳定表达细胞株,与阴性对照组及空白对照组相比,转染组CDK2 mRNA 水平明显下降,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生阻滞.结论:RNA干扰技术可明显抑制CDK2基因的表达,引起 HepG2细胞周期阻滞及肿瘤细胞生长抑制作用,为CDK2介导的肿瘤基因沉默疗法提供实验依据.     

新抑癌基因PIGl1高表达HepG2细胞株的建立

目的构建人PIGll逆转录病毒载体，建立高表达PIGll基因的HepG2细胞，为进一步研究PIGll基因在肝癌细胞中的功能提供一个理想的试验平台。方法将已有的peDNA3，1／NT—GFP—PIGll质粒用PCR法扩增出PIGll片段，构建含人PIGllcDNA的重组质粒pLXSN—PIGll。重组载体经PcR鉴定和DNA测序分析。将该重组质粒用lipofeetamine^TM 2000转染包装细胞PA317，获得DLXSN—PIGll逆转录病毒。用病毒感染HepG2细胞，获得PIGll高表达的HepG2细胞株。结果获得384bp人PIGll基因，测序证明PIGlleDNA编码序列与Genbank中报道的一致，转染PA317细胞后用病毒上清感染HepG2细胞，经RT—PcR检测发现HepG2细胞中PIGllmRNA表达明显升高。结论成功构建了高表达PIGll基因的HepG2细胞株，为进一步研究其生物学行为奠定了基础。     

hTWEAK基因重组慢病毒载体构建、病毒包装及蛋白表达分析

目的:构建携带人肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(hTWEAK)基因的慢病毒表达载体,体外包装成病毒颗粒,并分析其感染人肝癌细胞HepG2后TWEAK的表达情况。方法:以pORF5-TWEAK为模板,采用普通PCR扩增TWEAK基因,通过酶切、连接等步骤构建Plentilox3.7-TWEAK重组质粒,利用酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。在293T细胞中包装含TWEAK基因的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞,采用荧光定量PCR和Western-blot检测TWEAK表达水平,并通过间接免疫荧光(IMF)检测其细胞表达定位。结果:酶切与测序结果证明重组质粒构建成功,并能在293T细胞中与病毒包装质粒成功包装病毒颗粒。病毒转染的HepG2细胞中,TWEAK基因mRNA表达量约为对照组的500倍,TWEAK蛋白表达量明显高于对照组,且主要定位于胞浆。结论:本研究成功构建了含人TWEAK基因的慢病毒表达载体,其可在人肝癌细胞系HepG2中稳定表达,为后续的功能学研究打下了基础。     

Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

Ang2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siR-NA慢病毒转移质粒,再以pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白包膜质粒和包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,证明Ang2-siRNA核苷酸序列插入的正确性。利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Ang2基因的RNAi慢病毒表达载体,为下一步进行干扰体内外恶性黑素瘤Ang2的表达奠定基础。     

肝癌基因治疗的研究进展

基因治疗是向靶细胞或组织引入外源基因片段,通过纠正或补偿缺陷基因,关闭或抑制异常表达的基因,从而达到治疗目的的一种生物医学技术。肝癌是全球发病率较高的恶性肿瘤之一,通过基因治疗的方法来治疗肝癌,既达到治疗肝癌的目的,又不会造成正常细胞损伤,是具有较好应用前景的肝癌治疗方法。现就病毒载体和非病毒载体对肝癌细胞HepG2基因治疗的研究进展予以综述。     

SUMF2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因过表达慢病毒载体,以便进一步研究SUMF2功能。方法 针对人SUMF2 DNA序列设计带酶切位点的引物,PCR法获得目的基因片段;用AgeⅠ和NheⅠ酶双酶切SUMF2基因片段及PLJM1-EGFP载体。用T4连接酶对两种酶切产物进行连接、PCR鉴定、测序。将阳性克隆质粒与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293T细胞,并荧光显微镜观察EGFP的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了SUMF2的慢病毒表达载体,病毒效价为1×10⁸ TU/ml。结论 成功构建SUMF2-PLJM1-EGFP慢病毒载体,并在293T细胞中得到表达。     

荧光表达载体Podocin过表达对HEK293细胞中CD2AP分布的影响

目的:构建podocin荧光表达载体,并观察其转染HEK293后对CD2AP细胞内分布的影响.方法:PCR扩增NPHS2eDNA全长,通过T/A克隆连接至pGEMT-easy载体,应用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,再将NPHS2全长亚克隆人pEGFP-C2.将构建好的荧光表达载体pEGFP-NPHS2转染HEK293细胞,通过免疫荧光的方法观察转染前后CD2AP细胞内的分布情况.结果:①成功构建pEGFP-NPHS2荧光表达载体;②Podocin表达载体转染HEK293细胞后,CD2AP由核周转为弥散的细胞质分布.结论:Podocin转染HEK293细胞可使CD2AP由核周转为弥散的细胞质分布.     

构建人白细胞介素2逆转录病毒载体和包装细胞

目的：构建人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）逆转录病毒载体及包装细胞。方法：用基因重组法将ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ与ｐＬＮＣＸ重组成正义和反义ＬＮＣＩＬ－２基因。用磷酸钙－甘油法及感染法将ＬＮＣＩＬ－２基因转入ＰＡ３１７包装细胞内。所得克隆Ａ８的ｈＩＬ－２分泌量，ＤＮＡ、ＲＮＡ分别用ＥＬＩＳＡ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法分析。结果：Ａ８分泌的ｈＩＬ－２量为８．４ｎｇ·（２４ｈ·１０６细胞）１，ｈＩＬ－２基因完整地整合到转导细胞基因组内并有ｈＩＬ－２ｍＲＮＡ表达，细胞上清内病毒滴度为１０６·ＣＦＵ·ｍｌ１。结论：本研究成功地构建编码ｈＩＬ－２的逆转录病毒载体，并筛选出能产生病毒粒子、分泌ｈＩＬ－２的包装细胞。     

干细胞标志Musashi2基因RNAi腺病毒载体的构建及鉴定

Abstract:Objective To construct the adenoviral vectors of RNA interference of a stem cell marker Musashi2(Msi2) gene and to detect the interference effect and the influence on the proliferation of bladder cancer cell line BIU87. Methods Two interference DNA fragments named msi2-1 and msi2-2 and scramble as negative control were cloned into pSES-HUS shuttle vector and sent to sequence. After being digested and identified correctly the clones digested by PmeⅠwere recombinated with the bone plasmid pAdeasy-1 in the BJ5183 bacteria.After being digested by PacⅠ the recombinant plasmids were transfected into 293A cells to package and amplify adenovirus.Real-time PCR and Western blotting were used to test Msi2 mRNA and protein expression respectively in BIU87 cells infected by adenovirus.MTT was employed to detect whether knockdown of Msi2 affected the proliferation of BIU87 cells.Results Two interference and the scramble fragments were cloned into pSES-HUS shuttle vectors correctly.The recombinant vectors named pAdeasy-1-pSES-HUS-msi2 and pAdeasy-1-pSES-HUS-scramble were constructed and also the adenovirus were packaged and amplified successfully.Compared with scramble group,both of the mRNA and protein expression levels of Msi2 in msi2-1 and msi2-2 groups were decreased apparently（P<0.05）;the growth of BIU87 cells was reduced after knockdown of Msi2（P<0.05）. Conclusion The adenoviral vectors of Msi2 RNA interference which could inhibit the expression of Msi2 and cellular proliferation effectively in bladder cancer cell line BIU87 is successfully constructed.     

AC133-2分子的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的克隆人AC133—2全长基因，构建PGEZ—TerM—AC133—2逆转录病毒表达载体。方法采用分段克隆的方法，通过聚合链式反应从胎肝文库中克隆AC133—2，并构建AC133—2基因的逆转录病毒表达载体。结果成功克隆AC133—2全长基因并构建PGEZ-Term—AC133—2逆转录病毒表达载体。结论AC133—2全长基因克隆及构建逆转录病毒表达载体的成功，为构建AC133—2转基因细胞和制备抗人AC133—2单克隆抗体和研究AC133—2的生物学功能奠定了物质基础。     

Antisense Smad2 inhibits high glucose-stimulated production of extracellular matrix in cultured rat glomerular mesangial cells

Transforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)is amultifunctionalpolypeptidethatregulatesanum-berofcellularprocesses,includingcellprolifera-tion,differentiation,apoptosis,migration,matrix synthesis,andtheimmuneresponse[1,2].Inchron-icrenaldiseases,TGF-β1isakeymediatorofex-tracellularmatrix(ECM)accumulation[3].Oneof thetargetrenalcellsforTGF-β1isglomerular mesangialcellsthatarecapableofproducingcom-ponentsofECM,suchascollagens,lamininand fibronectin[4,5].Recentstudiesindicatedthatinhi-bitionofT…