HBx基因缺失型突变体HBx-d382与HBx-d431原核表达载体的构建和鉴定

目的为探讨HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431在临床上应用的价值,构建HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431原核表达载体。方法以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的HBx基因片段。HBx基因PCR扩增产物与载体pET-28a(+)经双酶切、连接,形成重组DNA后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经卡那霉素筛选、酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组HBx基因缺失型突变体原核表达载体。结果成功构建了重组pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)HBx-d431原核表达载体,重组前后HBx基因片段序列一致。结论pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)/HBx-d431原核表达载体构建成功,为HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431蛋白的免疫原性和临床应用的研究奠定了基础。     

人可溶性TALL-2突变体的原核表达及纯化

目的 制备人可溶性(soluble TNF and apoptosisligand-relatedleukocyte-expressedligand 2,sTALL-2)的3种突变体,为寻找sTALL-2的竞争抑性制剂创造条件.方法 采用一步反向PCR,将编码sTALL-2第187位谷氨酰胺(Gln)的核苷酸序列分别置换为丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)的编码序列,测序正确后,亚克隆到原核表达载体pQE-80L;经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物,Ni2 -NTA柱层析纯化目和蛋白,进而经Sepha-dex G-75柱层析,获得同源三聚体分子.结果 经一步反向PCR扩增后均得到441bp的DNA片段,测序分析表明分别为sTALL-2第187位谷氨酰胺残基置换为Ser、Asp、Arg的序列,3种突变体蛋白在大肠杆DH5α中获得成功表达,并得以有效纯化.结论 成功制备了sTALL-2的3种突变体蛋白,为进一步探讨sTALL-2结构与功能的关系及寻找基于sTALL-2突变体的抗肿瘤分子奠定了基础.     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

PCNA蛋白突变体的真核表达载体构建及鉴定

目的 构建带FLAG标签的细胞增殖核抗原(PCNA)蛋白Y211A、Y211D突变型重组质粒,真核表达及鉴定.方法 以FLAG-PCNA野生型基因为模板,运用PCR定点突变技术扩增出带突变位点的基因序列,将其插入真核表达载体pCMV-N-FLAG,进行双酶切实验和测序验证.然后,利用脂质体将重组质粒转染至293T细胞,Western blotting鉴定融合蛋白的表达.结果 FLAG-PCNA(Y211A)、FLAG-PCNA(Y211D)重组质粒测序结果正确,获得PCNA蛋白突变体.结论 成功构建了带FLAG标签的PCNA蛋白Y211A、Y211D真核表达载体,验证了突变型PCNA融合蛋白的     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

内源性血管生成抑制因子Arresten原核表达载体的构建及表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并在E.coliDH5α进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coliDH5α进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因并构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

复苏促进因子Rpf结构域突变体蛋白的原核表达和纯化

【目的】构建藤黄微球菌复苏促进因子Rpf结构域突变体基因E54K、E54A的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达和纯化。【方法】采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域E54A、E54K突变体基因,连接进入pMD-18T载体中,测序正确的基因插入到pGEX-4T-1表达载体中,转化大肠杆菌DH5ct,经IPTG诱导,SDS—PAGE鉴定表达蛋白,利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western—blotting分析。用GS-4B亲和层析柱纯化目的蛋白。【结果】获得藤黄微球菌Rpf结构域E54K和E54A突变体基因,测序结果与GenBank公布的序列相同,突变体位点与设定一致;表达蛋白相对分子质量与文献报道一致;Western—blotting结果显示,在相对分子量约32KD处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带。通过GS-4B系统,得到纯化的GST融合蛋白。【结论】成功表达、纯化了Rpf结构域突变体E54K、E54A融合蛋白,为上述蛋白在结核病中的应用奠定基础。     

人β细胞素基因原核表达载体的构建

目的构建人BTC基因的原核表达载体。方法以人胰岛细胞瘤CDNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCK）扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列，克隆入原核细胞表达载体PET32a（＋）中，经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCK扩增的特异性片段长度为240bp，以此构建的重组质粒PET32a（＋）-BTC，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5．9kb和250bp左右的两条片段，测序结果与Genbank中的人BTC基因eDNA（Genbank序列号NM_001729）序列一致。证明人BTC基因已成功克隆到了原核细胞表达载体PET32a（＋）中。结论成功构建了PET32a（＋）-BTC重组原核表达载体。     

Eotaxin原核表达载体的构建及初步表达

目的：获得人嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin基因，构建其原核表达载体，并初步表达成熟的Eotaxin，为进一步构建其N-端突变体，检测其生物学活性作准备。方法：提取外周血单个核细胞细胞总RNA，经RT-PCR扩增编码人Eotaxin全长cDNA序列，并将其克隆至T载体进行序列测定，然后构建于原核表达载体pET30a^＋中，并转入大肠杆菌表达。结果：RT-PCR扩增得到了400bp左右的DNA片段，序列分析发现其中包含了GenBank中报道的编码EotaxincDNA序列，并获得了正确表达。结论：EotaxincDNA的克隆及其原核表达载体的构建及表达，为进一步构建其N-端突变体，纯化和检测其生物学活性奠定了基础。     

地塞米松对致敏性哮喘小鼠肺组织CCR3和Eotaxin表达的影响

目的观察地塞米松对小鼠哮喘模型气道炎症和肺组织CC型趋化因子Eotaxin和受体CCR3表达的影响.方法建立哮喘模型,自第14天雾化吸入OVA前0.5 h,干预组分别雾化吸入咪喹莫特30 min及ip地塞米松.OVA雾化结束后24 h,每组小鼠眼球摘除采血收集血清.采用酶联免疫吸附法测定血清、支气管肺泡灌洗液及肺组织匀浆中Eotaxin水平:收集肺泡灌洗液进行细胞计数和分类;H-E染色观察肺组织炎症改变;用免疫组化方法检测肺组织Eotaxin和CCR3的表达;用Western blot方法测定肺组织CCR3表达;用逆转录-聚合酶链反应半定量检测肺组织IL-4、IFN-γ、Eotaxin、和CCR3 mRNA表达水平.结果H-E染色可见地塞米松组小鼠气道炎症程度减轻;地塞米松治疗组嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞比哮喘组明显减少;哮喘组小鼠血清和肺组织匀浆Eotaxin水平较正常组升高,地塞米松治疗组小鼠较哮喘组下降;Eotaxin、CCR3均在气道上皮细胞表达,哮喘组小鼠气道上皮细胞Eotaxin、CCR3较正常组增加,地塞米松治疗组较哮喘组减轻;哮喘组小鼠肺组织Eotaxin CCR3和IL-4 mRNA表达较正常组增强,地塞米松治疗组小鼠肺组织Eotaxin、CCR3和IL-4 mRNA表达较哮喘组降低.结论地塞米松减轻哮喘小鼠的气道炎症与抑制哮喘小鼠肺组织Eotaxin、CCR3蛋白和mRNA的过度表达有关.     

孟鲁司特钠对支气管哮喘患者血清Eotaxin水平的影响及其意义

目的探讨孟鲁司特钠对支气管哮喘急性发作期患者血清嗜酸性粒细胞活化趋化因子（Eotaxin）水平的影响及其意义。方法采用双夹心抗体酶联免疫吸附法检测32例支气管哮喘急性发作期患者（治疗组）和15例健康志愿者（对照组）血清Eotaxin的水平。结果治疗组治疗前血清Eotaxin水平明显高于对照组（P〈0.05）,治疗组治疗后血清Eotaxin水平明显低于治疗前（P〈0.05）。结论Eotaxin参与支气管哮喘的病理变化过程,支气管哮喘患者血清Eotaxin的变化可作为判断支气管哮喘预后的评价指标之一。     

儿童哮喘患者血清Eotaxin、ECP的测定及其临床意义

目的 探讨嗜酸粒细胞趋化酞（Eotaxin）、嗜酸粒细胞阳离子蛋白（ECP）在儿童支气管哮喘发病机制中的作用。并评价其反映哮喘气道炎症的临床价值。方法 收集23例哮喘急性发作患者、22例哮喘缓解期患者及17名健康儿童的外周血标本。用ELISA法测定血清Eotaxin的水平。以Pharmacia CAP系统检测血清中ECP的含量。结果 哮喘急性发作患儿血清中Eotaxin、ECP水平明显高于缓解期患儿和健康对照组，Eotaxin、ECP水平的升高程度与病情严重程度相关，且两者相互之间呈正相关。结论 Eotaxin在哮喘的发病过程中对气道的嗜酸粒细胞炎症有影响作用。ECP可作为支气管哮喘气道炎症发生发展的重要指标之一。动态监测血清Eotaxin、ECP的变化。可以较好地反映气道嗜酸粒细胞炎症的反应过程。     

血清Eotaxin的变化在毛细支气管炎和哮喘病中的作用和意义

目的探讨嗜酸性粒细胞超化因子（Eotaxin）的血清表达变化在毛细支气管炎和哮喘病中的作用和意义。方法随机将80例患儿分为毛细支气管炎组（毛支组）40例（其中单发组20例及多发组20例）,哮喘组40例,另选择正常健康儿童20例作为对照组。以上各组均采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）测定其血清Eotaxin水平,并进行对比分析。结果毛支组、哮喘组急性期血清Eotaxin水平高于对照组（P〈0．01）;在急性发作期,毛支单发组血清Eotaxin水平明显低于哮喘组（P〈0．01）,而毛支多发组与哮喘组比较,差异无显著性（P〉0．05）。毛支单发组在缓解期的血清Eotaxin水平低于哮喘组（P〈0．01）,与对照组水平接近且差异无显著性（P〉0．05）;毛支多发组缓解期Eotaxin值与哮喘组比较,差异无显著性（P〉0．05）。结论Eotaxin参与毛细支气管炎和哮喘病的病理过程,随着喘息发作的频率表达增加,测定其血清Eotaxin浓度可能将作为预测毛细支气管炎发展成哮喘的高危因素之一。     

哮喘患儿血IL-4及Eotaxin的含量变化及意义

目的　探讨支气管哮喘患儿血浆白细胞介素 - 4 (IL - 4 ) ,嗜酸性粒细胞趋化蛋白 (Eotaxin)含量的变化及临床意义。方法　采用ELISA法测定 4 7例哮喘患儿 (发作期 2 8例 ,缓解期 19例 )的血IL - 4、Eotaxin的含量 ,并与正常对照儿比较。结果　哮喘发作组、缓解组患儿与正常对照儿的IL - 4含量间差别有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;发作组与缓解组患儿的IL - 4含量间差别亦有显著性意义 (P <0 0 5 )。哮喘发作组患儿与缓解组患儿及正常对照儿的Eotaxin含量间差别均有显著性意义 (P <0 0 5 ) ,而缓解组患儿与正常对照儿的Eotaxin含量间差别无显著性意义 (P>0 0 5 )。血IL - 4含量和Eotaxin含量呈正相关 (P <0 0 5 )。结论　哮喘患儿血IL - 4、Eotaxin含量能反应哮喘气道炎症活动情况及疾病的严重程度 ,两者存在正相关。     

变应性鼻炎豚鼠模型中Eotaxin及STAT6的组织学表达

目的:通过比较正常豚鼠和变应性鼻炎模型豚鼠鼻黏膜中嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)及信号转导和转录激活因子6 (STAT6)的组织学表达,探讨Eotaxin、STAT6与变应性鼻炎的关系.方法:24只健康豚鼠随机分为正常对照组和变应性鼻炎模型组(n=12),以卵清蛋白致敏法建立变应性鼻炎豚鼠模型,免疫组化法测定Eotaxin、STAT6在正常豚鼠和变应性鼻炎模型豚鼠鼻黏膜中的蛋白表达.结果:正常豚鼠和变应性鼻炎模型豚鼠鼻黏膜中均有Eotaxin、STAT6的表达,显微镜下见Eotaxin阳性信号主要位于浆液腺及黏液腺细胞胞质内, STAT6阳性信号主要位于上皮下区的浸润细胞的胞质中;它们在变应性鼻炎模型豚鼠鼻黏膜中的表达明显高于正常对照组(P<0.01).结论:正常豚鼠鼻黏膜中存在Eotaxin、STAT6,变应性鼻炎模型豚鼠鼻黏膜中Eotaxin、STAT6的表达显著增加,提示Eotaxin、STAT6与变应性鼻炎发病相关,可能是导致变应性鼻炎中嗜酸性粒细胞浸润的主要因素.     

IL-8和Eotaxin在哮喘大鼠中的表达及地塞米松的作用

目的研究哮喘大鼠外周血、肺泡灌洗液(BALF)中白介素-8(IL-8)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)水平和肺组织Eotaxin mRNA及蛋白表达及地塞米松(DXM)对其影响。方法 30只SD大鼠随机平均分为正常组、哮喘组、DXM组。以卵蛋白(OVA)致敏和激发建立大鼠哮喘模型,BALF行细胞计数和分类;ELISA法检测血、BALF中IL-8、Eotaxin水平;肺组织切片HE染色观察病理变化;采用实时荧光定量PCR和免疫组化检测肺组织Eotaxin mRNA及蛋白表达。结果哮喘大鼠BALF中白细胞总数,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞百分比显著高于正常组(P<0.01);血清、BALF中IL-8、Eotaxin水平均显著高于正常组(P<0.01),DXM组明显低于哮喘组(P<0.05);哮喘组肺组织Eotaxin mRNA及蛋白的表达水平明显高于正常组(P<0.05,P<0.01),DXM组介于两组之间。结论 IL-8和Eotaxin参与了哮喘炎症过程,DXM可通过抑制其表达来减弱中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的趋化与激活,这可能是DXM减轻哮喘炎症反应的作用机制之一。     

患儿血清嗜酸细胞趋化因子、可溶性细胞间粘附分子-1的检测

目的 探讨哮喘患儿血清嗜酸细胞趋化因子(Eotaxin)、可溶性细胞间粘附分子-1(SIcAm-1)水平相关性及临床意义.方法 哮喘患儿30例,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(SELISA)测定其血清Eotaxin、SIcAm-1质量浓度.结果 哮喘患儿急性期血清中Eotaxin高于对照组(P＜0.01)及间歇组(P＜0.01),间歇期也高于对照组(P＜0.05).哮喘患儿急性期血清中SIcAm-1高于对照组(P＜0.01)及间歇组(P＜0.01),间歇期也高于对照组(P＜0.05).Eotaxin、SIcAm-1血清水平存在相关性(P＜0.01).结论 Eotaxin、SIcAm-1参与小儿哮喘病理过程,可作为哮喘病气道炎症诊断的重要指标.     

1,25-二羟维生素D_3对哮喘大鼠血清中Eotaxin及IL-8表达的影响

目的探索1,25-（OH）2D3对哮喘大鼠血清中Eotaxin及IL-8表达的影响。方法 50只Wistar大鼠随机分为正常对照组（N）、哮喘组（A）、1,25-（OH）2D3组（VD）、布地奈德组（B）及1,25-（OH）2D3＋布地奈德联合治疗组（L）,每组10只。用ELISA法检测血清中Eotaxin及IL-8的表达水平。结果 Eotaxin和IL-8的表达,A组较N组和治疗组明显增高;VD组较A组明显减低,明显高于N组、B组及L组;L组较A组、B组和VD组明显减低。结论哮喘急性发作时血清中Eotaxin及IL-8的表达水平显著增高,1,25-（OH）2D3有效抑制了哮喘时的Eotaxin和IL-8的表达水平,1,25-（OH）2D3与布地奈德联合治疗作用更为明显。