氧化高密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的制备

目的 制备抗氧化高密度脂蛋白(Ox-HDL)和氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)单克隆抗体(McAb).方法 以Ox-HDL和Ox-LDL为抗原,免疫BALB/C小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌抗相关抗原的McAb.用protein A柱亲和层析法纯化腹水中McAb,用Dot-ELISA和ELISA等鉴定其生物学活性.结果 获得3株不同结合特性的抗Ox-HDL和Ox-LDL的单克隆杂交瘤细胞(IC4Gl2,6H9A4A11和8C1A6),2株为IgG1亚型,1株为lgG2b亚型;腹水效价大干10',Dot-ELISA和ELISA检测证实1C4G12为具有对Ox-HDL和Ox-LDL交叉反应性的McAb,其与Ox-HDL单抗6H9A4A11可构成双抗体夹心体系测定0x-HDL水平,而与Ox-LDL单抗8C1A6构成的体系可测定Ox-LDL水平.结论 本实验通过构建3株不同特性的交叉反应性McAb,可用于测定Ox-HDL和Ox-LDL免疫方法 的建立.     

人H-FABP单克隆抗体制备和纯化及其特性鉴定

目的制备人心肌型脂肪酸结合蛋白(Heart type fatty acid-binding protein;H-FABP)单克隆抗体。方法(1)应用淋巴细胞杂交瘤技术,将重组人H-FABP腹腔注射免疫BALB/C小鼠。(2)将鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合、培养。通过HAT和间接ELISA法筛选、鉴定制备稳定分泌抗人H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)利用Protein G Sepharose 4 Fast Flow亲合纯化体内诱生法制备的腹水抗体,并对抗体特性进行鉴定。结果得到7株特异性识别人H-FABP单克隆抗体,并纯化两株亲合力高、空间位点远的单克隆抗体。结论成功制备了稳定分泌抗人H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶(Fba1)单克隆抗体,用以研究胞壁蛋白Fba1在侵袭性念珠菌感染(IC)中的致病作用。方法取重组白念珠菌Fba1蛋白免疫BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选分泌抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法克隆化。用ELISA测定单克隆抗体的效价,western blot和免疫荧光技术鉴定其特异性,用IsoStrip鉴定其抗体类型。结果筛选到1株稳定分泌抗Fba1单克隆抗体的杂交瘤细胞,抗体类型为IgG2a,轻链为κ型。鉴定结果表明,ELISA效价为1×106,能与念珠菌裂解物中天然Fba1和基因重组Fba1特异性结合。免疫荧光检测表明,该株单克隆抗体与白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌均发生反应。结论建立了1株持续分泌高效价抗念珠菌属特异性Fba1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为研究Fba1在IC中的致病作用提供了实验材料。     

抗胎儿血红蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的 制备和鉴定抗胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)单克隆抗体(mAb),为相关疾病的研究提供支持与工具.方法 用脐带血红细胞裂解物免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(NS-1)融合制备杂交瘤,经筛选和三次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体.用ELISA以及western blot等方法鉴定单克隆抗体的特性(效价、Ig亚类、特异性以及亲和力).结果 筛选到3株可稳定分泌抗HbF单克隆抗体的杂交瘤细胞6A5、5C8、2C8,腹水效价分别为1×10-6、 2×10-6和4×10-6.单抗亚类均为IgG1,抗体亲和力分别为7.8×109、2.2×108和8.6×109.ELISA和western blot结果显示,6A5、5C8、2C8 mAb只与HbF的二聚体特异性结合,与其他类型血红蛋白不发生交叉反应.结论 获得3株能特异性识别HbF的高亲和力mAb,可结合二聚体与单体HbF,为临床检测HbF水平及相关研究提供了有效的工具.     

抗HCCR单克隆抗体的制备及其鉴定

目的制备抗人宫颈癌癌基因（HCCR）单克隆抗体（mAb）,并进行鉴定。方法以HCCR重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,常规筛选杂交瘤细胞。腹水诱导法制备抗人HCCR单克隆抗体,并经蛋白A亲合层析进行纯化。用Western blot和免疫荧光等方法检测HCCR mAb的特异性。用纯化HCCR蛋白进行包被,建立间接ELISA方法,检测系列稀释的HCCR mAb,确定其灵敏度。结果筛选出2株分泌抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株。Western blot结果表明抗人HCCR抗体能与HCCR蛋白特异性结合,免疫荧光结果显示肝癌HepG2细胞中胞浆和胞膜均呈阳性染色。间接ELISA方法检测HCCR mAb的灵敏度可达到1μg/L。结论成功制备并鉴定了特异性抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株,为进一步深入研究HCCR的生物学特征和临床应用打下基础。     

抗曲霉硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TR)GliT单克隆抗体(单抗)并进行鉴定。方法取重组烟曲霉TR蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选分泌抗TR抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法克隆化。用ELISA法测定抗体效价,IsoStrip鉴定抗体类、型,用western blot、免疫荧光分析技术和免疫组化染色鉴定单抗的特异性。结果筛选到1株稳定分泌抗TR单抗(Anti-TR1)的杂交瘤细胞,抗体亚类为IgG1,轻链为κ型。ELISA法测定效价为5×105,能够与烟曲霉分泌蛋白及菌丝中天然TR特异性结合,还可与基因重组TR特异性结合。免疫荧光检测表明,该株单抗与烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉菌丝均发生反应,是曲霉属特异性的抗体。病理组织免疫组化染色结果显示,该抗体可与曲霉菌丝产生特异性反应。结论获得了1株持续分泌高效价抗曲霉属特异性抗TR单抗的交杂瘤细胞株,为进一步的研究奠定了基础。     

丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备特异性抗人丙氨酸氨基转移酶(ALT)单克隆抗体(McAb)并鉴定其特性。方法用纯化的ALT抗原(20μg/次)免疫BALB/C小鼠5只,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(按细胞数5∶1比例)融合,采用间接ELISA筛选杂交瘤细胞,阳性孔经3次有限稀释法克隆。用ELISA检测腹水及上清的抗体效价和相对亲和力,用Western blotting检测McAb的特异性,用秋水仙素阻断法进行染色体分析。结果得到1株杂交瘤细胞株(7D1),其染色体数目为95—106,其分泌的抗体为IgG1,轻链为κ型;上清和腹水抗体效价分别为10-4和10-6;SDS-PAGE显示该抗体在55和25 kD附近各有1条带,与预计的分子量大小一致。纯化抗体的亲和常数为2.2×1011。PAGE后Western blot检测显示该McAb可与人血清中的ALT结合。结论所制备的杂交瘤细胞株能分泌抗人ALT的特异性McAb。     

蓖麻毒素单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的 制备抗蓖麻毒素单克隆抗体并鉴定其特性.方法 以甲醛处理的蓖麻毒素毒蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 获得了4株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞2F6、4D3、1E4和1C7,诱生的腹水效价分别为1:1×107、1:1×106、1:1×105、1:1×106,亚类鉴定表明2E6为IgG1,其余3株均为IgG2h;特异性鉴定显示它们与多种毒素均无交叉反应,经过亲和层析,获得了纯化的单抗.结论 获得了特异性的蓖麻毒素单克隆抗体,为建立蓖麻毒素的检测及纯化方法奠定了基础,其中2E6的效价最高,可作为检测蓖麻毒素的核心试剂.     

抗人心肌肌钙蛋白T杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

[目的]建立稳定分泌抗人心肌肌钙蛋白T(cardic troponin,cTnT)单克隆抗体的杂交瘤细胞株.[方法]以纯化的cTnT(分子质量为3.7×107)加福氏佐剂免疫8周龄雌性Balb/c小鼠,取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合,以酶联免疫吸附法(ELISA)筛选.阳性克隆以有限稀释法进行克隆化、Western blot法鉴定所制备的单克隆抗体.[结果]共筛出4株稳定分泌抗cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的抗体效价高达10-5,经免疫学鉴定其分泌的免疫球蛋白类型均为IgG1、κ型,且Western b1ot鉴定4株细胞株所分泌的抗体均与人cTnT均有很好的反应性.[结论]获得4株稳定分泌抗人cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为cTnT的临床研究提供了可能性.     

人Survivin蛋白的纯化、单克隆抗体的制备及在肿瘤细胞的表达

目的表达人Survivin重组蛋白、制备单克隆抗体及检测Survivin在多种肿瘤细胞中的表达。方法诱导含有pMS-Survivin重组质粒的E.coli.表达人MS2-Survivin重组蛋白,并作为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA双筛,获得稳定分泌抗人Survivin mAb的杂交瘤细胞株。ELISA检测Survivin mAb的特异性。免疫细胞化学检测多种肿瘤细胞中天然Survivin的表达情况。结果诱导菌在相对分子质量为30KD左右表达出一新的蛋白条带。筛选出2株稳定分泌特异性抗人Survivin mAb的杂交瘤细胞株,亚类鉴定均为IgG1类。两株单克隆抗体的效价均达到6.4×105。ELISA结果显示出抗人Survivin mAb的特异性。在胃癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞中均强表达,且主要在细胞浆中。结论成功制备出特异性抗人Survivin mAb,为以后应用于临床检测奠定了基础,也为其进一步开发成诊断性试剂盒奠定了基础。     

抗人肝癌相关基因LAPTM4β胞内肽段单克隆抗体的制备与鉴定及其表达的检测

目的制备和鉴定鼠抗人肝癌相关基因溶酶体相关四次跨膜蛋白B胞内99个氨基酸残基（LAPTM4β-IC-N1-99）的单克隆抗体,检测LAPTM4β在肝癌中的表达,为深入研究其结构和功能奠定基础。方法利用本实验室构建原核表达质粒pGEX-KG-LAPTM4β-IC-N1-99,在大肠杆菌中表达融合蛋白GST-LAPTM4β-IC-N1-99。用纯化的蛋白LAPTM4β-IC-N1-99免疫雌性BALB／C小鼠,以常规杂交瘤技术制备鼠抗人LAPTM4β-IC-N1-99单克隆抗体（LAPTM4β-IC-N1-99 McAb）。进行抗体亚类测定和免疫印迹法（可汜）分析,然后用免疫化学技术检测技术LAPTM4β-IC-N1-99在肿瘤中的表达。结果诱导并纯化了重组GST-LAPTM4β-IC-N1-99蛋白,其相对分子质量约为32000;纯化得到LAPTM4β-IC-N1-99蛋白,其相对分子量约为10000。筛选出6株能稳定分泌抗LAPTM4β-IC-N1-99单克隆抗体的杂交瘤细胞株（D7,B12,H2,H8,A9和A10）,D7、H8、A10分泌抗体亚类为IsG1,B12、A9、H2为IgG2b。Westem blotting鉴定显示,抗LAPTM4β-IC-N1-99单抗可与融合蛋白及细胞内LAPTM4β蛋白特异性结合,具有高度特异性。免疫细胞化学证明,所得抗体能检测到肿瘤细胞中LAPTM4β基因的表达。结论以纯化的LAPTM4β-IC-N1-99蛋白免疫,获得了效价高、特异性好的LAPTM4β-IC-N1-99蛋白的单克隆抗体,用其可检测到LAPTM4β肿瘤细胞中的表达,这为LAPTM4β蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

血红蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定

本研究目的是制备鼠抗人血红蛋白A2（HBA2）单克隆抗体（McAb）并进行初步鉴定。将正常人胎肝组织匀浆离心并分离出人胎肝核总蛋白,用人胎肝核总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特异性鉴定,通过免疫沉淀和Uni-ZAPXR表达文库筛选鉴定抗原。结果表明：通过间接ELISA筛选获得分泌AEE091抗体的杂交瘤细胞1株,其分泌的单克隆抗体Ig亚类（型）为IgG1（κ）;Western blot结果显示,该抗体识别分子量为15kD的蛋白;Western blot识别AEE091免疫沉淀获得的分子量为15kD的抗原;同时应用单克隆抗体AEE091对人肝脏cDNA表达文库（Uni-ZAPXR）进行筛选,筛选所获得的阳性噬菌斑测序结果显示两个阳性克隆插入序列均为HBA2。结论：经筛选获得了分泌AEE091抗体的杂交瘤细胞株。AEE091抗体能特异识别HBA2抗原,因而其在HBA2的功能研究和珠蛋白生成障碍性贫血筛查等方面具有应用价值。     

抗粉螨Ⅰ类变应原单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

目的建立粉螨Ⅰ类变应原(dermatophagoides farinaeⅠ,Der fⅠ)杂交瘤细胞株,并对其分泌的Der fⅠ单克隆抗体进行鉴定。方法用重组Der fⅠ蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和3次克隆化,制备出单克隆抗体,Western blot法确定单克隆抗体的丙种球蛋白特异性,对单克隆抗体进行鉴定。结果获得2株可稳定分泌高效价Der fⅠ单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Western blot试验证明2株单抗与DerfⅠ蛋白均有特异性反应。结论成功制备2株抗Der fⅠ的单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力。     

人神经元特异性烯醇化酶基因克隆及单克隆抗体的制备与鉴定

目的研究建立克隆人神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因制备鼠抗人NSE单克隆抗体方法。方法用NSE特异引物，通过逆转录多聚酶链式反应从人肺癌细胞株A549中扩增NSE基因，构建重组质粒pGEM-T-NSE，并测序鉴定NSE基因序列。再将NSE基因定向克隆于原核高效表达载体pMS-31b，当表达MS2-NSE融合蛋白后，免疫BALB／C小鼠。并用常规杂交瘤技术，制备鼠抗人NSE单克隆抗体(NSE McAb)。最后，采用免疫细胞化学(ICC)技术检测NSE在肿瘤细胞株中的表达。结果克隆出全长1305bp的NSE基因，其表达的MS2-NSE融合蛋白为57000，表达量1．42mg／L。获得2株能稳定分泌抗NSE单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经检测其分泌抗体的亚型分别为IgG1和IgG2a。ICC检测证明所得NSE McAb能检测到肿瘤细胞中NSE的表达。结论成功克隆了NSE基因，并获得鼠抗人NSE McAb，为深入研究NSE基因的表达提供了有力的工具。     

多囊蛋白-1 LRR-WSC区单克隆抗体的制备及其在免疫组织化学诊断中的应用

目的 用杂交瘤技术制备抗多囊蛋白-1 LRR-WSC区单克隆抗体，检测多囊蛋白-1在肾组织和肾细胞株中的分布和定位。方法 用多囊蛋白-1 LRR-WSC区融合蛋白PCI-e免疫BALB／c小鼠，将其脾细胞与骨髓瘤细胞株SP2／0进行细胞融合，间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选出阳性克隆，有限稀释法将杂交瘤细胞株单克隆化，间接ELISA法和免疫印迹法(WB)鉴定抗体的特异性。用制备的抗多囊蛋白-1 LRR-WSC区单克隆抗体，免疫组织化学和免疫细胞化学法检测多囊蛋白-1在不同肾组织和肾细胞株中的分布。结果 细胞融合后经筛选和克隆得到的杂交瘤细胞株经WB分析表明，该细胞株分泌的单克隆抗体能特异地与多囊蛋白-1 LRR-WSC区结合。免疫组织化学显示，多囊蛋白-1主要分布于正常肾组织的远端肾小管和集合管，在胎肾囊肿组织中表达于近端肾小管，在人常染色体显性多囊肾病(ADPKD)肾囊肿组织中，表达于囊肿衬里上皮细胞，同时在ADPKD肾囊肿衬里上皮细胞系和猪近端肾小管细胞株(LLC-PK1)中也发现了多囊蛋白-1的表达。结论 本实验成功制备了抗多囊蛋白-1 LRR-WSC区的单克隆抗体，该抗体对深入研究ADPKD的发病机制具有重要意义。多囊蛋白-1在肾组织中的表达模式对肾小管的形态发生、维持肾小管结构的完整性非常重要。     

抗HBeAg不同位点的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及其应用

目的建立检测人乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的双单抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂。方法用基因工程HBeAg免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌针对抗原不同位点单抗的杂交瘤细胞株。将构象型位点单抗和线性位点单抗配对做夹心ELISA,选择最匹配的一对建立双单抗夹心HBeAg检测试剂,并与人抗HBeAg多抗包板、单抗标酶的HBeAg检测试剂盒做对比试验。结果建立了89株能稳定分泌小鼠抗HBeAg的杂交瘤细胞株,其中63株单抗针对构象型位点,26株单抗针对线性位点。挑选出最匹配的7E6和e1构建成检测HBeAg的双单抗夹心ELISA检测试剂。与人抗HBeAg多抗包被、单抗酶标检测试剂对比,双单抗试剂具有更高的灵敏度,而其他指标基本一致。结论我们用不同位点的HBe单克隆抗体建立了高灵敏度、高特异性的有实用价值的HBeAg双单抗夹心ELISA检测试剂。     

人5型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人5型腺病毒(HAdV5)六邻体(Hexon)蛋白的单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用纯化的Hexon蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗HAdV5的Hexon蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。纯化获得单克隆抗体,使用ELISA和Western blot鉴定单克隆抗体的敏感性和特异性。结果 ELISA和Western blot结果表明这4株单克隆抗体与HAdV5的Hexon蛋白可以特异性结合。单克隆抗体株4A9-HRP标记和8D6建立的ELISA夹心法具备较高灵敏度和特异性。结论获得4株抗HAdV5的Hexon蛋白的单克隆抗体,为HAdV5相关的疫苗研制和HAdV5感染性疾病的早期快速诊断奠定了基础。