Limk1在FMR1基因敲除小鼠脑组织的表达及意义

目的：通过免疫组化方法观察LIM-kinase 1（Limk1）在不同年龄组的FMR1基因敲除鼠（FMR1 knockout mouse,KO）和野生鼠（wild type mouse,WT）脑组织不同部位的表达差异.方法：取FVB品系新生和生后2、6周KO鼠（KO0d、KO2周和KO6周）,并分别与同龄WT鼠作对照.每组6只通过免疫组化染色,观察Limk1在不同年龄组的KO和WT小鼠脑组织各部位的表达差异.结果：Limk1在新生鼠的海马、皮层、丘脑、小脑表达丰富,以染色阳性纤维为主,染色阳性细胞少见.生后2周、6周小鼠的大脑皮质和海马仅见少量散在弱阳性细胞表达,但在丘脑未定带、腹后外侧核,小脑蒲肯野细胞和脑干前庭蜗神经核可见强阳性细胞表达.各年龄组KO与WT小鼠Limk1在脑区的分布特点基本一致.KO0d、KO2周及KO6周组小脑、蜗神经核Limk1强阳性表达脑区的平均光密度值以及KO2W及KO6W组丘脑部位的阳性细胞计数均高于同龄WT组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：Limk1在KO与WT小鼠脑组织的表达均有着明显的时空特异性,FMRP能负性调控Limk1表达.     

表皮生长因子在小鼠耳蜗发育中的表达

运用免疫组织化学技术（LSAB法），对表皮生长因子（EGF）在昆明种小白鼠内耳发育中的表达进行研究。结果显示：EGF在小鼠胚胎第13d和14d的耳蜗上应及螺旋神经节的神经细胞中有阳性表达，但在前庭感觉器官的上皮中表达很弱。EGF在内耳间充质及内耳软骨包囊中无表达。结果表明：EGF在小鼠耳蜗上皮发育中的表达呈现明显的阶段性及组织特异性分布的特点，说明EGF参与小鼠耳蜗上皮的发育过程，其在小鼠耳蜗上皮发育的增殖期有阳性表达。     

Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白在缺氧性细胞中的表达及其对细胞缺氧性损害的保护作用

目的研究Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白（ABAD）在缺氧性细胞中的表达及其对细胞缺氧性损害的保护作用，以探讨急性缺氧性疾病的治疗新方法。方法①观测缺氧状态下细胞Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白表达水平的变化：体外培养的COS-1细胞置于缺氧箱诱导缺氧1～16h（氧浓度控制1％～2％），收集细胞，裂解，离心得到蛋白提取液，同时用TRlzol方法提取总RNA；Northern blot法检测正常和缺氧状态下细胞ABADmRNA的表达水平；15μg总RNA于10％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离并转移至尼龙膜，采用QuikHyb快速杂交系统与α-^32P标记的全长ABAD cDNA探针杂交，杂交膜于-80℃放射自显影18h；Western blot检测正常和缺氧状态下细胞ABAD蛋白的表达水平：20μg蛋白样品于SDS-NuPAGE胶电泳分离，电转移使样品印迹至尼龙膜上，后者依次与鼠抗人ABAD单克隆抗体（一抗）和兔抗鼠抗体（二抗）孵育，用化学发光法显示印迹条带；②观测上调ABAD表达对细胞缺氧性损害的影响：采用逆转录PCR（RT—PCR）方法，扩增ABAD全长编码序列，PCR产物直接克隆至pcDNA3表达质粒中，构建ABAD-pcDNA3表达质粒；将1μgpcDNA3-ABAD表达质粒DNA用Lipofectmine2000转染剂转染至COS-1细胞株，培养36h。正常对照组则以1μg pcDNA3空载体转染；转染后细胞按上述方法进行缺氧处理，收集细胞，裂解，采用DNA片段化检测试剂盒定量检测ABAD正常表达和高表达条件下缺氧诱导的细胞死亡事件。结果与正常表达组相比，ABADmRNA及蛋白水平均于缺氧后1h开始下降，4～8h后显著降低，至16h表达几乎完全消失；提高ABAD的表达可明显降低缺氧所致的DNA片段化水平（P〈0．05）。结论ABAD是缺氧高度敏感性蛋白，同时又是一个对缺氧性损害有明显保护作用的蛋白。因此，它可望成为急性缺血缺氧性疾病临床监测的一个新指标，并具有潜在治疗应用价值。     

突触素在FMR1基因敲除小鼠脑组织中的表达

目的：了解FMR1基因敲除小鼠脑组织中突触素Ⅰ（SYN）表达的改变，以探讨脆性X综合征的发病机制。方法：将40只小鼠按基因型及年龄组的不同分为：1周龄基因敲除型组（KO^1W组）、1周龄野生型组（WT^1W组1、6周龄基因敲除型组（KO^6W组）、6周龄野生型组（WT^6W组）4组，每组10只。取小鼠脑组织用免疫组织化学法检测SYN的分布和表达。用图象分析仪采集各脑区的平均光密度值（MOD），分析不同基因型及不同年龄组SYN在各脑区MOD值的差异。结果：按基因型分析，KO型小鼠大脑皮质SYN的表达均较WT型小鼠显著降低（P〈0．01）；但在苔藓纤维层，新生KO小鼠SYN的表达较其WT型显著增高（P〈0．01）。按年龄组分析，KO^1W组小鼠中的SYN在各脑区的表达较KO^6W高（P〈0．05），在大脑皮质及苔藓纤维层（P〈0．01）处比在CA1区（P〈0．05）更明显：WT^1W组SYN的表达在皮质及CAl区高于WT^6W组（P〈0．01），但在苔藓纤维层却比WT^6W组低（P〈0．01）。结论：FMR1基因敲除小鼠大脑皮质突触数量减少而新生期海马苔藓纤维层突触数量异常增多，可能与患者智能低下、神经兴奋性增高有关。     

连接蛋白29在小鼠耳蜗中的表达

目的研究连接蛋白29（connexin 29, Cx29）在小鼠内耳的表达,探讨Cx29突变致聋的原因。方法野生型小鼠耳蜗冰冻切片,用神经丝蛋白(neurofilament, NF)、髓鞘相关糖蛋白抗体（myelin associated glycoprotein, MAG）和神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）抗体与Cx29抗体行双重免疫荧光染色,荧光显微镜观察染色结果。结果Cx29主要表达于位听神经和螺旋神经节细胞髓鞘,MAG与Cx29的共同表达于内耳位听神经处,表达呈圈状;GFAP只在内听道以外的脑干部位表达,与Cx29无共同表达;Cx29形成一个个圈样围绕NF;血管纹处可见Cx29微量表达。结论Cx29在小鼠内耳中大量表达,可能对维持小鼠正常听觉功能起重要作用。     

人载脂蛋白A1基因转基因小鼠的建立

目的 建立系统性表达人载脂蛋白Al(APOA1)基因的转基因小鼠.方法 将人APOA1基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOA1转基因C57BL/6J小鼠.并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标.结果 建立了2个不同表达水平的人APOA1基因的转基因小鼠品系；转入的人APOA1基因在血液、肝脏、心脏、肾脏、脾脏、血管组织中均有明显表达；血生化分析结果显示不同月龄转基因小鼠的血浆高密度脂蛋白胆固醇水平高于同龄的野生型小鼠,甘油三酯水平低于同龄野生型小鼠.结论 成功建立了系统性表达人APOA1基因的转基因小鼠,为研究高血脂以及高血脂相关的心血管病提供了工具.     

前列腺增生症所致膀胱出口梗阻患者膀胱平滑肌中bFGF的表达变化

患者膀胱平滑肌中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）的表达变化。方法:同龄对照组16例患者、BPH梗阻逼尿肌稳定组24例患者和BPH梗阻逼尿肌不稳定组16例患者的膀胱壁逼尿肌组织，应用免疫组织化学SABC法检测膀胱平滑肌细胞中bFGF蛋白的表达变化。结果:bFGF在同龄对照组、BPH梗阻逼尿肌稳定组和梗阻逼尿肌不稳定组患者的膀胱平滑肌细胞中均有表达。BPH梗阻逼尿肌稳定组和梗阻逼尿肌不稳定组bFGF的表达水平均高于同龄对照组，差异有统计学意义（P＜0.05)，但BPH梗阻逼尿肌稳定组与梗阻逼尿肌不稳定组bFGF表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:BPH引起BOO后，膀胱平滑肌细胞中bFGF的表达水平增高与膀胱平滑肌细胞的肥大以及平滑肌细胞间胶原纤维的增多有关，但可能与逼尿肌不稳定的发生无关。     

β淀粉样肽结合乙醇脱氢酶及胆碱乙酰转移酶在糖尿病小鼠海马内表达的时程变化

目的本研究通过观察β淀粉样肽结合乙醇脱氢酶(amyloid-βpeptide-binding alcohol dehydrogenase,ABAD)及胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase,ChAT)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)小鼠海马CA1区表达的时程变化,探讨DM脑病发病的相关机制。方法 48只雄性昆明小鼠采用数字表法随机分为对照组(control,C,n=24)和DM组(n=24)。小鼠禁食12 h后,按200 mg/kg腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素(streptozocin,STZ),3 d后尾部测非禁食血糖,大于15 mmol/L者为DM模型复制成功。分别在造模后1周、4周及8周应用免疫组织化学染色方法观察C组与DM组小鼠海马CA1区ABAD及ChAT阳性细胞的变化。结果 1)ABAD免疫组织化学染色结果显示,C组小鼠海马CA1区ABAD阳性细胞数量少,染色浅;而造模后1周、4周、8周,DM组小鼠海马CA1区ABAD阳性细胞数量较C组增多,染色深。细胞计数结果显示,1周、4周及8周,DM组小鼠海马CA1区ABAD阳性细胞数量(18.50±2.72,21.10±2.47,18.90±2.08)比C组(14.30±2.63,15.30±3.13,14.10±3.07)明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。2)ChAT免疫组织化学染色结果显示,C组小鼠海马CA1区ChAT阳性细胞数量多,染色深;而造模后1周、4周及8周,DM组小鼠海马CA1区ChAT阳性细胞数较C组减少,染色变浅。细胞计数结果显示,1周、4周及8周DM组小鼠海马CA1区ChAT阳性细胞数量(21.20±2.15,19.60±3.50,21.30±3.20)比C组(25.50±3.63,26.40±3.37,26.30±4.88)明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 DM早期(1周)小鼠海马内即出现ABAD表达增加,并持续至实验终点(8周),同时DM小鼠海马内ChAT表达明显减少。ABAD可能参与DM小鼠胆碱能神经元的变性过程,在DM脑病的发病机制中具有重要作用。     

成纤维细胞生长因子受体各亚型与小鼠肺纤维化及衰老的关系

目的观察成纤维细胞生长因子受体（FGFR）各亚型与肺组织的纤维化及衰老之间的关系。方法应用荧光定量聚合酶
链反应方法,分别检测不同鼠龄的小鼠肺组织FGFR1-4的表达水平;同时,采用常规病理切片（HE染色和Masson染色）观察不
同鼠龄小鼠肺组织的纤维化状况。结果（1）FGFR各亚型在小鼠肺组织中表达水平不均匀,FGFR2的含量高于其他几个亚型;
（2）8月龄小鼠肺组织中FGFR亚型表达水平均显著低于5周龄小鼠肺组织中FGFR的表达;（3）8月龄的小鼠肺组织表现出肺纤
维化的变化。结论小鼠肺组织中FGFR水平的下降可能与年龄的增加相关;不同年龄组均以FGFR2的含量为高;小鼠肺组织
随着鼠龄增加呈现不同程度的纤维化,可能与FGFR的表达下降相关;提示FGFs/FGFR可能参与衰老的发生及肺纤维化调节。
     

NaKCCl基因缺陷小鼠的内耳组织形态学研究

Na-K-2C1联合转运子-1（Na-K-2Cl cotransporter-1，NKCC1）是动物细胞中广泛分布的一类膜转运蛋白，其作用是将Na^＋、K^＋、Cl-按1：1：2的比例呈电中性跨膜转运。听觉信号的传导依赖于内耳的离子传递，而NKCCl被认为是由耳蜗血管纹的边缘细胞转运分泌K^＋的主要转运蛋白，NKCCl对维持耳蜗内淋巴的高K^＋状态和内耳的K^＋循环起着重要作用。NKCCl的缺乏不仅可以导致内淋巴高K^＋环境的改变，同时也可能导致内耳发育障碍和组织畸形，因此，NKCCl对内耳发育也起重要作用。NKCCl基因敲除小鼠（NKCCl^-/-，纯合子）和NKCCl基因半拷贝小鼠（NKCCl^＋/-，杂合子）均为NKCCl基因缺陷小鼠，是目前研究离子通道病的重要模型，由于各个NKCCl基因型小鼠的基因不同程度的缺陷而可能对内耳组织发育造成不同的影响。本研究利用NKCCl的基因缺陷小鼠模型，对其内耳组织形态进行比较分析，探讨NKCCl基因不同类型和程度的缺陷对小鼠内耳形态发育影响。     

C57BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及Myosin Ⅵ的表达

目的探讨C57BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ在该过程中的表达。方法选择从E10到E20每个时间点的孕鼠,取E10～E17的胚胎头、E18～E20的胚胎内耳,通过冰冻连续切片、HE染色及免疫荧光观察小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ抗体标记阳性毛细胞出现的时间。结果小鼠内耳前庭末梢器官发育早、过程短,E10是听囊,E11已经能区分出背侧较大的前庭囊和腹侧较小的耳蜗囊,E12的前庭囊和耳蜗囊区分已很明显,并且出现内淋巴囊和管、上和后半规管始基,E13可见到上和后半规管壶腹嵴始基,出现水平半规管始基和椭圆囊始基,E14形成球囊和水平半规管壶腹嵴始基,E15椭圆囊、球囊、膜半规管初具成熟形态,所有囊斑、壶腹嵴基本形成,E18形态发育基本完成。MyosinⅥ标记阳性表达的毛细胞在E15的所有壶腹嵴、囊斑里出现,未见支持细胞表达MyosinⅥ。结论 MyosinⅥ在E15开始表达,这个时期可能是毛细胞成熟的关键时期。     

前庭导水管扩大患儿影像与听力结果分析

目的 回顾性分析前庭导水管扩大患儿的耳部影像表现及新生儿听力筛查结果及听力测试结果,探讨单纯前庭导水管扩大及合并其他内耳畸形的患儿的新生儿听力筛查通过率及听力损失程度是否有差异。方法 2009年1月至2019年12月在首都医科大学附属北京同仁医院儿童听力诊断中心就诊,电子计算机断层扫描(computed tomography,CT)显示有前庭导水管扩大伴或不伴其他内耳畸形的患儿92例(182耳),入组者均接受过新生儿听力筛查。收集患儿新生儿听力筛查、听力学测试结果及耳部影像学资料。根据影像学表现分为3组:A组为单纯前庭导水管扩大;B组为Mondini畸形伴前庭导水管扩大及前庭池扩大即不完全分隔Ⅱ型(incomplete partition type Ⅱ,IP-Ⅱ);C组为前庭导水管扩大伴前庭池扩大或半规管畸形。采用卡方检验对比组间的新生儿听力筛查通过率;采用Kruskal-Wallis秩和检验对比组间听力损失程度。结果 92例患儿首次就诊年龄为1.5～65个月,其中男性47例(51.1%)、女性45例(48.9%)。182耳中,A组占40.11%(73/182)、B组占26.37%(48/182)、C组占33.52%(61/182),B+C组约占59.89%。3组新生儿听力筛查通过率比较,差异无统计学意义(χ²=1.122,P=0.571);伴与不伴Mondini畸形间比较,差异无统计学意义(χ²=0.401,P=0.526)。3组听力损失程度及伴与不伴Mondini畸形组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 前庭导水管扩大合并其他内耳畸形约占60%;无论前庭导水管扩大伴与不伴其他内耳畸形,新生儿听力筛查通过率及听力损失程度均差异无统计学意义,提示前庭导水管扩大所致的迟发性听力损失与伴随的其他畸形类型无关。     

"促愈瘢痕消"对兔耳增生性瘢痕作用的实验研究

目的：探讨“促愈瘢痕消”对兔耳增生性瘢痕的作用。方法：用新西兰白兔12只，均在右侧兔耳腹侧面制作增生性瘢痕动物模型。待瘢痕形成后随机分为两组，每组6只：试验组（A组）外用“促愈瘢痕消”，对照组（B组）外用生理盐水，均1次／d，连用1月。分别在瘢痕形成时、治疗后4周测量瘢痕厚度，治疗后1、4周切取瘢痕组织做组织病理学及p53、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）测定。结果：A组在4周时较B组瘢痕厚度明显变薄，颜色变浅，质地变软，胶原色淡而排列稀疏，随用药时间延长差异明显；两组间瘢痕厚度差异有统计学意义（P＜0.05）；p53、PCNA阳性表达率在1、4周时两组间差异有统计学意义（P＜0.05），A组在1、4周时差异有统计学意义（P＜0.05），B组在1、4周时差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：“促愈瘢痕消”能够明显抑制兔耳瘢痕的增生，且机理可能是减少p53及PCNA的表达，有望成为治疗增生性瘢痕的有效药物。     

Discernment of the sensitized inner ear by peripheral immunocompetent lymphocytes

Ｅｖｉｄｅｎｃｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｔｈａｔｔｈｅｉｎｎｅｒｅａｒｉｓｎｏｔａｎｉｍｍｕｎｏｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄｓｉｔｅ,ａｎｄｔｈａｔｉｔｃａｎｒｅｓｐｏｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｔｏａｎｔｉｇｅｎｓａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｓＵｎｄｅｒｃｅｒｔａｉｎｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ,ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓａｎａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｎｅｒｅａｒｍａｙｒｅｓｕｌｔｉｎａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｉｎｎｅｒｅａｒｄｉｓｅａｓｅ（ＡＩＥＤ）Ｔｈｅｅｎｄｏ…     

慢性氟中毒对小鼠切牙胚内釉上皮TGF-beta1表达的影响

目的 :观察慢性氟中毒对小鼠切牙胚内釉上皮表达 TGF- beta1的影响 ,探讨TGF- beta1在氟牙症发生机制中的作用。方法 :给小鼠分别喂以含 0、5 0、1 0 0 ppm Na F的饮水 ,6周后免疫组化观察结果。结果 :图像分析显示加氟组 TGF- beta1的表达水平低于空白组。结论 :氟可能通过抑制 TGF- beta1的表达干扰内釉上皮的分化和基质分泌 ,导致氟牙症的发生。     

2型糖尿病小鼠肾脏纤溶酶原激活物抑制物-1表达

目的探讨2型糖尿病动物模型KKAy小鼠肾脏纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)和组织纤溶酶原激活物(tPA)mRNA表达与肾脏细胞外基质蓄积的关系.方法选取8周龄雄性KKAy小鼠和C57BL-J小鼠,分别于16、20和24周处死.采用发色底物法检测不同周龄的KKAy小鼠及参照组C57BL/J小鼠的血浆PAI-1活性,RT-PCR法检测小鼠肾皮质tPA mRNA表达,原位杂交法检测肾皮质PAI-1 mRNA水平,免疫组织化学和免疫印迹法检测肾皮质层粘连蛋白表达.结果不同周龄KKAy小鼠肾皮质层粘连蛋白表达均高于同龄对照组(P＜0.05).2型糖尿病KKAy小鼠与C57BL/J小鼠血浆PAI-1活性的差异没有显著性(P＞0.05);但肾皮质tPA mRNA水平却显著降低,以16周时最为显著,仅为C57BL/J小鼠的47%,随周龄的增加,其差异逐渐减小.原位杂交显示KKAy小鼠PAI-1mRNA可在肾脏多部位表达,并以近端小管上皮细胞内的表达为主,且明显高于同龄C57BL小鼠.结论2型糖尿病KKAy小鼠早期肾病时,细胞外基质蛋白的蓄积可能和tPA mRNA表达下调及PAI-1 mRNA表达上调所致的纤溶酶降解细胞外基质作用降低有关.     

胎儿内耳膜迷路蛋白的提取及电泳分析

使用含０．１％十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ），５％二巯基乙醇（β－ＭＥ）和１０％甘油的提取液制备 胎儿内耳膜迷路蛋白，并采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）技术分析其蛋白 组成。结果：胎儿内耳膜迷路蛋白 Ｍｒ为 １３６ ０００、６８ ０００、６２ ０００、５５ ０００、５０ ０００、４３ ０００、３２ ０００、 ３０ ０００等。结果为进一步分析，纯化内耳特异性抗原，为临床采用免疫印迹法检测抗内耳组织自身 抗体提供了可能。     

蛋白激酶C-βⅠ,βⅡ在糖尿病肾病小鼠肾组织中的分布、表达及替米沙坦对其影响

目的 探讨蛋白激酶C（PKC）-βⅠ,βⅡ在糖尿病肾病（DN）小鼠肾脏中各部位的分布、表达以及血管紧张素受体拮抗剂替米沙坦对其影响。方法 18只小鼠随机分为正常组、DN组和治疗组（TG组）。采用半定量免疫荧光技术检测肾小球内PKC-βⅠ、βⅡ,转化生长因子（TGF-β1）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达情况,激光共聚焦及免疫印迹技术检测PKC-βⅠ,βⅡ在肾组织中的分布与表达。结果 与正常组相比,DN小鼠近曲小管上皮细胞腔膜侧PKC-βⅠ,βⅡ的表达较强,而皮质和内髓集合管上皮细胞PKC-βⅡ的表达消失;DN小鼠肾皮质和外髓PKC-β1的表达量较多（P〈0．01）,而肾皮质内PKC-βⅡ的表达则明显较低（P〈0．01）。半定量免疫荧光进一步表明,PKC-βⅠ、TGF-β1和VEGF在DN小鼠肾小球内的表达量明显高于正常组（分别上调0．48、0．20和0．24倍,均P〈0．01）,而PKC-βⅡ的表达则下调0．27倍（P〈0．05）,其中PKC．[31的表达与TGF．[31呈正相关（r=0．649,P=0．030）而与VEGF无关（r=0．387,P=0．079）,PKC-βⅡ的表达与TGF-β1、VEGF均无关。替米沙坦能部分纠正上述变化。结论 （1）DN小鼠肾组织中PKC-βⅠ、βⅡ的表达和分布发生变化,提示它们参与DN近曲小管功能改变,其中PKC-β1可能通过影响肾小球TGF-β1的表达参与DN肾小球的肥大。（2）DN时肾素血管紧张素系统的活性增加可能是PKC-βⅠ,βⅡ异常激活的重要原因,替米沙坦可能通过部分改善PKC-βⅠ,βⅡ的表达来实现其肾脏保护作用。