血清抗甲状腺过氧化物酶抗体ELISA定量方法的建立

摘要：目的：建立一种ELISA方法用于定量分析血清抗甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体（TPOAb）。 方法：用生物素化牛血清清蛋白（BSA）和链霉亲合素包被微孔板,同时加入生物素化TPO抗原和待检血清,再加入酶标记抗人IgG,建立间接包被模式酶联免疫法测定抗TPO抗体。经方阵滴定确定生物素化抗原和酶标抗体的最适浓度,优化反应条件,并进行方法学评价。 结果：本法抗原包被量为0.083 μg/mL,检测灵敏度为0.165 IU/mL;高、低浓度混合血清批间变异系数（CV）为9.2%、9.0%,批内CV为4.6%、5.6%;回收率为96.0%~104.0%;包被板37 ℃放置5 d保持稳定;与抗甲状腺球蛋白抗体（TGAb）交叉反应率为0.22%。经检测120例健康人,将参考值定为<65.7 IU/mL。与Abbott公司试剂盒检测结果的相关系数（r）为0.985（P<0.01）。 结论：间接包被模式适合TPOAb测定,包被抗原用量少,方法灵敏度高,特异性强;操作简单,成本较低,适合基层医院。     

固相亲合素在游离甲状腺素免疫检测中的应用

目的：以亲合素－生物素分离技术为基础,尝试通过固化抗原（标记抗体）或固化抗体（标记抗原衍生物）两种免疫分析构型实现具有代表性的游离激素－游离甲状腺素（FT4）的固相免疫分析测定。方法：应用牛血清白蛋白－亲合素联接物制备固相亲合素,以此为基础制备固相生物素化甲状腺素衍生物或固相生物素化抗甲状腺素抗体,并分别用于标记抗体法或标记抗原衍生物法的FT4免疫分析。结果：标准曲线的四参数非线性拟合度良好;标记抗标法测定的灵敏度为0.42pmol/L,批内批间的CV％均小于7％,标记衍生物法的灵敏度为0.36pmol/L,批内批间的CV％均小于7％,两种方法相关性良好（r=0．9734,P＜0．01）。结论：通过应用固相亲合素固化抗原或固化抗体两种方式,进一步肯定了固相亲合素作为通用固相分离技术在免疫分析中的应用价值,为游离甲状腺素测定提供了实验 依据。     

β-人绒毛膜促性腺激素光激化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种检测人血清β-人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）浓度的光激化学发光免疫分析方法。方法采用2株针对不同抗原表位的抗β-HCG抗体,其中一株抗体用来包被发光微粒,另一株抗体标记生物素,以双抗体夹心法检测人血清中的β-HCG浓度,并与Beckman-Coulter公司试剂（化学发光法）进行比较。结果发光微粒浓度为100μg/mL、生物素标记抗体浓度为7μg/mL时,检测范围为0~1 000 mIU/mL,灵敏度为0.16 mIU/mL,平均回收率为100.3%,批内变异系数（CV）为0.80%~3.99%,批间CV为2.25%,与TSH、FSH和LH的交叉反应率低,稳定性较好,与化学发光法的符合率好（r=0.99）。结论光激化学发光免疫分析方法测定β-HCG具有较高灵敏度、精密度和准确性,与化学发光法的符合率较好,适用于临床测定。     

定量检测人表皮生长因子试剂盒的研制及应用

目的研制亲和素生物素酶联免疫吸附法(ABCELISA)定量检测人表皮生长因子(EGF)试剂盒。方法以纯化的重组人表皮生长因子(rhEGF)为抗原,制备兔抗rhEGF多克隆抗体和鼠抗rhEGF单克隆抗体(McAb),并鉴定其生物学特性。用生物素标记抗rhEGFMcAb,建立ABCELISA定量检测人EGF的方法,同时用该方法检测50名正常人和38例肿瘤病人血清EGF含量,并与YAS公司EGFABCELISA试剂盒(n=88)进行比对。结果本研究建立的ABCELISA定量检测法的灵敏度为0.050ng/ml,批内变异系数(CV)<4%,批间CV<6.3%,回收率95.7%～102.5%,特异性鉴定显示,与相关蛋白无交叉反应,同YAS公司同类试剂盒检测结果无差异(P>0.05)。肿瘤病人血清EGF含量(0.426±0.084ng/ml～0.456±0.095ng/ml)比正常人(0.243±0.086ng/ml)明显增高(P<0.05)。结论本研究成功制备的抗人EGF多克隆抗体和McAb特异性好,亲和力高;初步建立的ABCELISA检测人EGF试剂盒与YAS公司同类试剂盒质量相当,适于推广应用。     

变应原特异性IgE抗体检测试剂盒的研制

目的 研制变应原特异性IgE抗体检测试剂盒。 方法 采用广州地区变应原作为包被抗原,在传统间接ELISA法基础上进行了改良,结合生物素-亲合素系统,建立快速、敏感、特异、重复性好的变应原特异性IgE抗体检测试剂盒,并对其各项指标进行评价。 结果 研制的试剂盒最低检出限为0.35 IU/ml,批内、批间的变异系数（CV）均<10%,稳定性良好,与Pharmacia公司CAP系统的检测结果相关性高。 结论 试剂盒各项指标均达到临床检测要求,适于临床检测和科研应用。     

抗风疹病毒IgM类抗体生物素-亲合素时间分辨荧光免疫分析捕获法的建立与性能评价

摘要：目的：建立抗风疹病毒IgM类抗体（RV IgM）生物素-亲合素时间分辨荧光免疫分析捕获法（BA Mac TrFIA）并评价其分析性能。 方法：用鼠抗人μ链单克隆抗体（抗-μ McAb）作为包被抗体,生物素化RV重组抗原为桥接抗原,链霉亲合素标记铕作为示踪物,配制以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液,测定抗RV IgM抗体,并对其检测限、重复性、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、试剂热稳定性进行评价,与同类方法学比对检测1 020例样本,比对实验的一致性分析采用Kappa检验。 结果：本方法检测国家检测限参考品L1、L2和L3的结果均为阳性反应（S/CO≥1.00）,批内变异系数（CV）＜15.00%,国家阴性参考品符合率为10/10,国家阳性参考品符合率为5/5;本方法的试剂盒于37 ℃恒温放置6 d后,检测性能无明显改变;与珠海海泰公司试剂结果符合率为98.82%,Kappa=0.96。 结论：本方法灵敏度高,特异性强,精密度好;与同类方法学检测结果相关性好,能满足临床应用需要。     

血清肌红蛋白光激化学发光免疫测定法的建立

目的采用光激化学发光免疫测定技术（LICI）建立定量检测肌红蛋白（Mb）的方法。方法使用针对Mb不同表位的2株单克隆抗体，一株包被发光微粒，另一株进行生物素化，与包被有链霉亲合素的感光微粒共同构成检测试剂，优化检测条件并评价检测性能。结果该方法的灵敏度为1．36ng／ml，在33．8～1521．0ng／ml的范围内线性良好。批内和日间变异系数分别为3．05％～4．41％和5．80％～6．56％。在血红蛋白浓度〈2．6g／L，总胆红素浓度〈342μmol／L、三酰甘油浓度〈11．3mmol／L时的干扰率无临床意义。与Roche Elecsys电化学发光法有较好的相关性（r=0．9971）。结论血清MbLICI的建立有助于进一步对检测试剂盒的研制。     

人C肽时间分辨免疫荧光分析试剂盒的研制

目的研制人C肽(C peptide)时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)试剂盒。方法采用双抗体夹心一步法建立C肽TRFIA试剂盒,对试剂盒的各项指标进行评价。结果试剂盒的可测范围为0.5～22ng/ml,灵敏度为0.045ng/ml,批内、批间的变异系数(CV)分别为4.1%～6.7%和5.4%～6.8%;与胰岛素无交叉反应,与胰岛素原的交叉反应率为9.0%。30份血样用本试剂盒与国外同类试剂盒同时检测,其相关系数为0.992。结论试剂盒各项指标均达到临床检测要求,可替代国外同类产品试剂盒。     

血清心肌肌钙蛋白Ⅰ光激化学发光免疫测定法的建立

目的采用光激化学发光免疫测定法（LICLIA）建立血清心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的定量检测方法。方法使用2株特异性的cTnI单克隆抗体,一株包被发光微粒,另一株进行生物素化,与包被有链霉亲合素的感光微粒共同构成检测试剂,优化检测条件并评价检测性能。结果方法的分析灵敏度为0.05 ng/mL,在1.10～29.36 ng/mL范围内线性良好。批内和日间变异系数（CV）分别为4.89%～5.93%和6.76%～8.96%。cTnI浓度为161 ng/mL时方法无Hook效应。与Biocheck cTnI酶联免疫吸附试验（ELISA）具有较好的相关性（r=0.964）。结论血清cTnI的LICLIA定量检测方法的建立有助于急性心肌梗死诊断试剂盒的研制。     

乳腺癌患者血清HER-2/neu 蛋白化学发光免疫定量分析方法的建立

目的建立吖啶酯化学发光免疫分析定量检测乳腺癌患者血清HER-2/neu蛋白的方法。方法用吖啶酯和生物素分别标记2株不同的HER-2/neu蛋白单克隆抗体,并用链霉亲合素包被微粒,通过链霉亲合素-生物素系统分离固相和液相,采用双抗体夹心法对建立方法的性能指标进行鉴定评估。结果建立的方法线性范围5~300 ng/m L,最低检测限为0.58ng/m L,批内变异系数≤3.0%,总变异系数≤8.8%,与西门子公司HER-2/neu蛋白测定试剂盒(化学发光法)的检测结果比对,相关系数(r)=0.991 9,总符合率98.9%。结论建立的方法能够满足乳腺癌的临床诊疗要求,值得在临床推广应用。     

血清肌红蛋白光激化学发光免疫测定法的建立

目的采用光激化学发光免疫测定技术(LIC I)建立定量检测肌红蛋白(Mb)的方法。方法使用针对Mb不同表位的2株单克隆抗体,一株包被发光微粒,另一株进行生物素化,与包被有链霉亲合素的感光微粒共同构成检测试剂,优化检测条件并评价检测性能。结果该方法的灵敏度为1.36 ng/m l,在33.8~1 521.0ng/m l的范围内线性良好。批内和日间变异系数分别为3.05%~4.41%和5.80%~6.56%。在血红蛋白浓度<2.6 g/L,总胆红素浓度<342μmol/L、三酰甘油浓度<11.3 mmol/L时的干扰率无临床意义。与Roche E lecsys电化学发光法有较好的相关性(r=0.997 1)。结论血清Mb LIC I的建立有助于进一步对检测试剂盒的研制。     

心肌营养素-1 ELISA测定法的建立及初步应用

目的 应用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附法(BSA-ELISA)建立血浆心肌营养素-1(CT-1)测定法,并初步应用于冠心病患者血浆CT-1水平的检测。方法 用鼠抗重组人CT-1单抗包被酶标板,加入待测抗原,并依次加入生物素化羊抗重组人CT-1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记链霉亲合素,用H2O2-邻苯二胺显色。检测35名冠心病患者及对照组血浆CT-1含量的变化。结果 方法的线性范围为10～2000pg／ml,检测下限为10pg／ml,批内变异系数为1．76％～7．64％,批间变异系数为5．96％～9．04％。结论 该方法简便、快速,特异性、敏感性、重复性均在临床检测可接受范围内,标准曲线线性良好,适用于基础研究与临床检验。     

人诱骗受体3酶联免疫定量检测方法的建立

目的建立检测人诱骗受体3(DcR3)含量的ELISA方法。方法建立固相双抗体夹心法定量检测DcR3:用抗DcR3抗体包被ELISA板,捕捉样本中DcR3,再加入生物素标记的抗DcR3抗体及亲合素标记的辣根过氧化物酶,形成含酶的固相复合物,最后以底物显色,以同板上的标准曲线定量。对所建立的方法进行灵敏度、特异性、精密度、回收率、线性范围及血浆DcR3参考范围的评估。结果所建立方法分析灵敏度为0.051 ng/m L,重复性和期间精密度分别小于10%和15%,平均回收率为90.50%。在包被抗体中加入2倍量抗TNF-α、在检测抗体中加入10倍量生物素标记的抗LIGHT、抗FAS或抗TNF-α或在DcR3标准品中加入10倍量的LIGHT纯蛋白,均不影响标准曲线的状态。检测方法的线性范围为0.25~16 ng/m L(r≥0.98)。128例正常成人血浆DcR3的均值为(0.21±0.05)ng/m L,95%可信限参考值范围为0.14~0.28 ng/m L,无年龄及性别差异。结论所建立的ELISA检测方法具有特异性高、灵敏度、精密度及线性好、可测范围大等特点,可用于检测人血DcR3含量。     

光激化学发光免疫分析法检测孕妇血清W物质

摘要：目的：建立定量检测孕妇血清W物质的光激化学发光免疫分析（LICIA）法并进行方法学评价。 方法：包被有W物质（T₂S类似物）的感光微粒与兔抗W物质抗体连接,与生物素化羊抗兔IgG及包被有链霉亲合素的发光微粒构成检测体系;对LICIA法反应条件进行探索并进行方法学评价。 结果: LICIA法的检测灵敏度为5 pg/mL,线性范围为5~10 000 pg/mL;批内、批间变异系数（CV）均<10%;回收率为89.2%~108.1%;T₃S＜10 ng/mL、T₄S＜100 ng/mL、Hb＜5.0 g/L、T-Bil＜500 mol/L、TG＜3 mmol/L对LICIA法检测W物质无显著干扰;LICIA法稳定性较好;与放射免疫分析（RIA）法比较,LICIA法检测W物质差异无统计学意义（t=1.012,P＞0.05）。检测孕早期孕妇血清W物质的参考值上限为847 pg/mL。 结论：LICIA法检测W物质灵敏且简便易行,可用于孕妇血清W物质的检测。     

酶联免疫卵清蛋白定量试剂的研制及验证

目的 研制酶联免疫定量检测试剂，用于流感疫苗中卵清蛋白含量的测定。方法用卵清蛋白分别免疫豚鼠和家兔获得抗血清；采用盐析和柱层析法制备纯抗体。用豚鼠抗体包被酶联反应板，兔抗体标记辣根过氧化物酶，经条件优化建立酶联免疫双抗体夹心法检测试剂。用卵清蛋白参考品制备定量标准曲线，对待检标本进行检测并与国外试剂进行比较。结果 试剂的最佳定量范围是3ng-50ng／ml，回归曲线相关系数r≥0．99。精密度（CV）≤10％。对样品测定结果与Serazym Ovalbumin试剂测定结果相比较（P〉0．05），无显著性差异。结论 试剂的精密性和准确度高，稳定性可靠，可用于流感疫苗中卵清蛋白的定量检测。     

应用FITC系统建立非均衡竞争游离雌三醇(E3)化学发光法

目的 建立可以广泛应用于游离雌三醇(E3)检测的方法.方法 制备辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗人多克隆抗体及异硫氰酸荧光素(FITC)标记雌三醇类似物.以抗FITC抗体包被发光板,FITC-E3类似物与抗FITC抗体结合形成固相抗原,并与血清中的free E3竞争结合抗E3抗体-HRP,建立化学发光血清free E3检测系统(FITC系统),进行方法学评价,并与E3-牛血清白蛋白直接包被系统(非FITC系统)和西门子ADVIA CentaurXP系统进行比较.结果 FITC系统检测线性范围为0.1～40 ng/mL,灵敏度为0.1 ng/mL;批内变异系数小于5%优于非FITC系统;与西门子ADVIA CentaurXP系统检测结果有良好的相关性(r=0.965 7).结论 应用FITC系统建立的非均衡竞争free E3化学发光免疫分析系统灵敏度高、特异性强,可用于临床标本的检测.     

血清甲胎蛋白和游离β绒毛膜促性腺激素双标记时间分辨荧光免疫试剂盒的研制与评价

目的 研制一种用于产前筛查的母血清甲胎蛋白(AFP)和游离β绒毛膜促性腺激素(free hCG β)双标记时间分辨荧光免疫法(TrFIA)试剂盒.方法 采用AFP单克隆抗体铕(Eu3+)标记物和free hCGβ单克隆抗体钐(Sm3+)标记物作为示踪物,以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分制备增强液,应用双抗体夹心法研制出hAFP和free hCG β双标记时间分辨荧光免疫法试剂盒,并对其进行分析性能评价,平行比对试验采用线性回归分析.结果 自制试剂盒AFP和free hCG β的剂量-反应曲线线性相关系数(r)可达0.999 0以上;批内、批间CV(%)均小于10.00%;AFP和free hCG β的灵敏度分别为0.12 U/ml和0.08 ng/ml;以国家标准品为对照,AFP和free hCG β的标准品效价比在0.900～1.100间;检测AFP和free hCG β的线性范围分别为0.25 U/ml～500 U/ml和0.2 ng/ml～200 ng/ml;试剂盒在4℃保存下可至少稳定12月;与国外同类试剂比对,AFP和free hCG β的回归方程的线性相关系数(r)分别为0.973 0和0.992 7.结论 自制试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确度好、线性范围宽等优点,与国外的同类产品检测结果相关性好,能满足临床需要.     

免疫PCR检测HIV-p24抗原的实验研究

目的建立检测HIV-p24抗原的高灵敏度免疫PCR方法。方法以金磁微粒为免疫PCR载体、鼠抗HIV-p24单抗为捕获抗体、生物素化的羊抗p24多克隆抗体为检测抗体,通过链亲和素的桥联标记生物素化的多抗,被双抗体夹心捕获的人重组HIV-p24抗原通过PCR扩增报告DNA的方式予以检测;用方阵滴定法确定最适链亲和素和标记DNA浓度,用Quantity One凝胶定量软件分析电泳图像。结果链亲和素浓度和用于标记的DNA的浓度分别控制在0.1mg/L和10ng/L;免疫PCR检测的灵敏度为0.1ng/L,比传统ELISA法检测的灵敏度高。结论高灵敏度的免疫PCR适用于早期筛检HIV-p24抗原。     

牛奶过敏单组分特异性IgG4抗体光激化学发光定量检测方法的建立和评价

目的建立并评价基于光激化学发光分析(LICA)平台的牛奶过敏单组分(Bos d 5)特异性IgG_4抗体(sIgG_4)定量检测方法(sIgG_4-LICA)。方法以生物素标记的Bos d 5抗原、待检血清、抗人IgG_4抗体包被的发光微球和链霉亲合素包被的感光微球组成分析体系,基于LICA平台,采用间接法模式,建立Bos d 5 sIgG_4抗体定量检测方法(sIgG_4-LICA),并对其进行条件优化和性能评价。结果 sIgG_4-LICA方法的批内精密度、日间精密度和批间精密度分别为1.78%～3.13%、6.65%～8.41%和7.94%～12.30%,功能灵敏度为4.71 ng/mL,线性范围为28.13～1 800 ng/mL,线性回归方程为Y=0.98X-1.31(r~2=0.997),最大稀释度为1∶64,血红蛋白、三酰甘油、总胆红素、抗坏血酸及生物素的干扰率为-6.38%～8.60%。结论本研究建立的Bos d 5 sIgG_4抗体定量检测方法性能良好,可满足临床监测sIgG_4抗体的需要。     

乙丙肝酶免试剂盒临床应用准确性评价

[目的]采用酶联免疫方法对准备新引进的和实验室现使用的两种乙丙肝酶免试剂盒进行临床应用准确性和精密度评价。[方法]采用卫生部临检中心己明确预期阴、阳结果的乙肝两对半和丙肝抗体质控血清，进行乙丙肝酶免试剂盒临床应用准确性评价；用HBsAg不同含量定值血清进行HBsAg最低检测限分析；用定值血清进行批内和批间精密度评价。[结果]待评价的乙丙肝酶免试剂盒除HBeAg和HBeAb的符合率为92％，抗-HCV的特异性为90．91％外，其余各项的灵敏度、特异性、总符合率均低于90％；HBaAg在2ng／ml含量时的阳性检出率为76．52％，但在1ng／ml和0．5ng／ml时阳性检出率均为0％；批内精密度CV在10％以上，批间精密度CV均在20％以上，HBeAb和HBcAb达到42．86％和60％。而实验室现使用的乙丙肝酶免试剂盒各项评价指标均优于待评价的试剂盒。[结论]所评价的乙丙肝酶免试剂盒其灵敏度、特异性、总符合率均较低，而HBaAg最低检测限也达不到卫生部所要求的0．5ng／ml检测水平，加上重复测定精密度较差，待评价的乙丙肝酶免试剂盒无法满足临床检测要求。