1-磷酸鞘氨醇促进胰岛素分泌及可能机制研究

目的研究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌效应及其分子机制,探索糖尿病治疗药物的作用靶点。方法使用胶原酶P消化SD大鼠胰腺,Histopaque 1077梯度离心获得胰岛,Dispase II消化得到胰岛细胞。不同浓度S1P(0~20μmol·L~(-1))干预,观察低糖(2.8 mmol·L~(-1))和高糖(16.7 mmol·L~(-1))条件下胰岛素分泌的变化。膜片钳技术记录β细胞电压依赖性钾通道电流(Kv电流),观察S1P干预后Kv电流的变化。钙成像技术记录β细胞内Ca~(2+)浓度,观察不同浓度S1P(0~20μmol·L~(-1))干预后细胞内的Ca2+浓度变化。结果与低糖组相比,高糖组明显刺激了胰岛素的分泌(P<0.01)。低糖条件下,S1P没有改变胰岛素分泌量(P>0.05)。高糖条件下,S1P浓度依赖性增加了胰岛素分泌量(P<0.01)。与对照组相比,S1P明显抑制了β细胞Kv电流(P<0.01)。高糖条件下,S1P浓度依赖性升高了胰岛细胞内Ca~(2+)浓度(P<0.01)。结论 S1P可能通过抑制β细胞Kv电流、升高细胞内Ca2+浓度,最终促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌。     

多巴胺激活Kv通道抑制胰岛素分泌的电生理机制

目的探讨多巴胺激活电压依赖性钾(Kv)通道抑制葡萄糖刺激胰岛素分泌的电生理机制。方法分离雄性SD大鼠胰岛和β细胞,根据实验使用多巴胺(DA)、D;样受体激动剂(SKF38393)和D;样受体激动剂(Quinpirole)及阻断剂(Eticlopride)进行干预。酶联放射免疫实验测定胰岛素含量;膜片钳电压钳记录β细胞膜上Kv通道电流的变化,电流钳记录动作电位时程的长短;DiBAC4(3)染色观察INS-1细胞膜电位的变化。结果 SKF38393对胰岛素分泌和Kv通道均没有明显影响;Quinpirole明显抑制胰岛素分泌,并且增加Kv通道电流;多巴胺明显抑制胰岛素分泌,增加Kv通道电流,缩短β细胞动作电位时程,且均可被Eticlopride逆转;此外,多巴胺降低INS-1细胞膜电位。结论多巴胺作用于D;样受体,活化Kv通道,缩短动作电位时程,降低β细胞膜电位,从而发挥抑制葡萄糖促进胰岛素分泌的作用。     

生物素对高糖状态下大鼠胰岛β细胞功能的影响

目的 探讨生物素对高糖损伤胰岛β细胞功能的影响.方法 采用Dextran密度梯度离心法分离纯化大鼠胰岛,在含5.5 mmol·L~(-1)葡萄糖、5.5 mmol·L~(-1)葡萄糖+1 μmol·L~(-1)生物素、含27.0 mmol·L~(-1)葡萄糖及27.0 mmol·L~(-1)葡萄糖+1 μmol·L~(-1)生物素的RPMI 1640培养基中培养48 h,分析3.3、27.0 mmol·L~(-1)葡萄糖刺激的胰岛素分泌及胰岛细胞中胰岛素的含量;提取总mRNA,RT-PCR扩增前胰岛素源基因,电泳并进行灰度分析.结果 在5.5 mmol·L~(-1)葡萄糖培养条件下,生物素增加高糖诱导的胰岛素释放及胰岛细胞的胰岛素含量,前胰岛素源mRNA也增加;在27.0 mmol·L~(-1)葡萄糖培养铝h的胰岛中,胰岛细胞中的胰岛素浓度降低,高糖诱导的胰岛素释放及前胰岛素源mRNA显著减少;生物素的共培养,部分提高了高糖诱导的胰岛素释放及前胰岛素源mRNA含量.结论 生物素通过促进胰岛素的合成显著改善了高糖损伤胰岛β细胞的功能紊乱.     

PGF_(2α)对NIT-1β细胞葡萄糖刺激性胰岛素分泌的影响

目的探讨PGF2α对葡萄糖刺激性胰岛素分泌和[Ca2+]i变化的影响。方法运用放免方法检测不同浓度的PGF2α在不同情况下对NIT-1β细胞葡萄糖刺激性胰岛素分泌量的变化,并以F luo-3AM为探针,利用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙的改变。结果在16.5 mmol.L-1葡萄糖刺激下,0.1、1、5μmol.L-1的PGF2α剂量依赖性的促进了NIT-1β细胞葡萄糖刺激性胰岛素分泌,其中5μmol.L-1时作用最强(P<0.01),而在10μmol.L-1时,PGF2α却抑制了葡萄糖刺激的胰岛素分泌(P<0.05);预先加入0.5 mmol.L-1EGTA后,5μmol.L-1的PGF2α不能促进胰岛素分泌,同样在预先加入n ifed ip ine或EGTA+n ifed ip ine后,PGF2α也无促进胰岛素分泌(P>0.05)。在0、5.5 mmol.L-1葡萄糖刺激下,5μmol.L-1的PGF2α无促进胰岛素分泌作用(P>0.05)。另外,应用5μmol.L-1的PGF2α能够引起β细胞内钙升高(P<0.01),在无钙环境下,PGF2α只引起缓慢的幅度较小的细胞内钙升高,恢复细胞外钙浓度时,β细胞内钙升高(P<0.01)。结论在NIT-1β细胞,一定范围浓度的PGF2α能够促进高浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌,可能与PGF2α增加细胞外钙内流有关。     

替米沙坦通过直接抑制Kv2.1通道促进离体大鼠的胰岛素分泌

目的 研究替米沙坦促进大鼠胰岛素分泌作用相关的信号通路。方法 (1)分离成年Wistar大鼠胰腺获得胰岛和胰岛细胞,通过胰岛素分泌实验观察药物对胰岛素分泌的影响,通过钙成像实验和全细胞膜片钳技术观察药物对β细胞内Ca²⁺浓度的变化和对离子通道的作用。(2)使用过表达电压门控性钾(voltage-gated potassium channel, Kv)通道2.1亚型(Kv2.1)的慢病毒转染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞构建CHO-Kv2.1细胞系,使用膜片钳技术观察替米沙坦对Kv2.1通道的直接作用。结果 缬沙坦和厄贝沙坦无类似替米沙坦的高糖浓度下促胰岛素分泌、升高β细胞内Ca²⁺浓度和抑制β细胞的Kv通道等作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)阻断剂GW9662亦未阻断替米沙坦的上述作用。而替米沙坦可以浓度依赖性地抑制CHO-Kv2.1细胞的Kv2.1通道电流。结论 替米沙坦的促胰岛素分泌作用可能与血...     

Efaroxan对胰岛素分泌的调控机制研究

目的观察Efaroxan的促胰岛素分泌作用特点,并探讨其相关作用机制。方法应用放免法测定不同条件下Efaroxan对大鼠胰岛素分泌的影响。c AMP放射免疫试剂盒测定胰岛细胞内c AMP含量。结果 Efaroxan促进胰岛素分泌作用具有葡萄糖浓度依赖性,其特点是在高浓度葡萄糖条件下(8.3、11.1 mmol·L-1)增强胰岛素分泌,而在低浓度葡萄糖条件下(0、2.8 mmol·L-1)则没有作用。Efaroxan的拮抗剂KU14R可明显抑制Efaroxan对胰岛素分泌的促进作用,并明显的抑制了forskolin和IBMX对胰岛素分泌的促进作用。胰岛c AMP含量检测发现,forskolin和IBMX明显增加了胰岛细胞c AMP含量,但是Efaroxan和KU14R对胰岛c AMP含量没有影响。结论 Efaroxan促进胰岛素分泌作用与激动c AMP下游信号通路有关,KU14R通过阻断c AMP下游信号转导通路发挥抑制Efaroxan、forskolin和IBMX的促胰岛素分泌作用。     

TCM-040抗心律失常作用及电生理机制

目的通过细胞-组织-器官-整体水平的筛选平台研究,初步明确TCM-040的抗心律失常作用及电生理机制。方法组织器官水平采用SD大鼠,雄性,230～270 g。大鼠麻醉后摘取心脏,进行Langendorff逆向灌流(灌注压80 mmHg),将Mapping电生理标测系统的两个64道探头分别贴附于左心房和左心室,评价受试物对心脏自律性和传导系统的作用;optical mapping评价须在离体心脏灌流液中依次加入兴奋-收缩偶联阻断剂、电压敏感染料和钙离子指示剂,评价受试物对心肌细胞钙离子内流速度和强弱的调节作用;细胞水平采用hERG-HEK293稳转细胞系和急性分离的心肌细胞,用700B单细胞膜片钳系统,全细胞技术记录hERG电流,评价受试药物在10～100μmol·L~(-1)水平对h ERG电流的影响;Langendorff逆向主动脉灌流酶解法分离单个的心室肌细胞,电流钳模式下记录豚鼠心室肌细胞的动作电位,电压钳模式下记录大鼠心室肌细胞的K~+电流和Ca~(2+)电流,开展受试药物对动作电位时程APD90、K~+通道和Ca~(2+)通道电流的研究;整体动物模型采用大鼠冠脉结扎和豚鼠哇巴因诱导的经典心律失常模型,评价受试物灌胃给药对模型动物心律失常评分及室速、室颤持续时间的作用。结果离体心脏Mapping结果提示,TCM-040可显著降低心室的传导速度和房室延搁,明显降低心率;optical mapping显示,HDJ可明显降低钙离子内流的电压幅值和速率,改善心肌细胞内钙超载现象;细胞水平膜片钳试验结果提示,TCM-040在10～100μmol·L~(-1)水平可以阻断hERG通道,浓度相关性的抑制hERG电流;100μmol·L~(-1)水平的TCM-040能够明显延长急性分离心肌细胞的动作电位时程,并且对K~+通道和Ca~(2+)通道有抑制作用;整体动物模型TCM-040明显降低大鼠冠脉结扎心律失常的评分和室速、室颤的持续时间;明显增加豚鼠模型出现室性早搏、室颤和心脏停博时的哇巴因用量。结论 TCM-040具有抗心律失常的作用,其作用机制与减慢心脏电传导,延长心肌细胞动作电位和抑制K~+、Ca~(2+)通道电流活性相关。     

前胡丙素对分离的成年鼠正常及肥厚心室肌细胞内游离钙的影响(英文)

目的:研究分离的成年大鼠正常及肥厚左室肌细胞[Ca~(2 )]_i及前胡丙素的作用.方法:用Fura 2-AM测定单细胞[Ca~(2 )]_i.结果:外钙为1.0mmol·L~(-1)时,正常左室肌细胞静息钙87±4 nmol·L~(-1),肥厚细胞123±7 nmol·L~(-1).肥厚心肌细胞中,加入KCl 20,40,60 mmol·L~(-1),[Ca~(2 )]_i增加29％,78％和185％,幅度高于正常细胞.前胡丙素1,10,100 μmol·L~(-1)浓度依赖地抑制KCl及去甲肾上腺素诱导[Ca~(2 )]_i增加.作用与硝苯啶相似.结论:肥厚心肌细胞静息钙高于正常细胞;前胡丙素抑制激动剂引起的[Ca~(2 )]_i升高源于其钙通道阻断作用.     

TMB-8抑制神经递质引起的单个脑细胞内游离钙的升高(英文)

目的:研究TMB-8对神经递质引起的单个脑细胞内游离钙升高的作用。方法:应用AR-CM-MIC阳离子测定系统测定游离大鼠单个脑细胞内钙离子浓度。结果:当细胞外液Ca~(2 )浓度为1.3mmol·L~(-1)时,TMB-8 30μmol·L~(-1)能降低谷氨酸,组织胺,5-羟色胺引起的脑[Ca~(2 )]_i浓度的升高。而当细胞外液无钙时,TMB-8能降低细胞内静息[Ca~(2 )]_i;TMB-8 10μmol·L~(-1)则几乎完全抑制了组织胺和5-羟色胺引起的脑[Ca~(2 )]_i升高作用。结论:TMB-8能降低谷氨酸,组织胺,5-羟色胺引起的脑[Ca~(2 )]_i升高。     

尼克酰胺对白介素—1β损伤的离体大鼠胰岛细胞的保护作用

目的 观察尼克酰胺（ＮＡ）对白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）诱导的胰岛细胞损害的保护作用。方法应用体外单层培养的大鼠胰岛细胞,分别检测ＩＬ－１β,ＮＡ（１０,２０ｍｍｏｌ／Ｌ）及其联合对胰岛细胞亚硝酸盐生成,胰岛素分泌以及胞内ＤＮＡ,胰岛素含量和细胞活性的影响。结果 由ＩＬ－１β诱导的胰岛细胞亚硝酸盐生成量显著增加,同时胰岛素基础分泌以及葡萄糖刺激的胰岛素释放均明显减少;胰岛细胞内 ＤＮＡ,胰岛素含量及细胞活性（ＭＴＴ值）均显著下降（Ｐ均＜０．００１）;较高浓度及其的 ＮＡ（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ）能阻断这些抑制作用（Ｐ均＜ ０．００１）;而较低浓度的 ＮＡ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）虽不能阻断 ＩＬ－１β诱导的 ＮＯ生成对葡萄糖刺激的胰岛素释放的抑制作用,但对 ＩＬ－１β介导的其它抑制作用仍呈现保护性效应（Ｐ均＜ ０．００１）。结论 一氧化氮（ＮＯ）虽然参与ＩＬ－１β诱导的胰岛细胞的损害过程,但可能不是唯一的效应分子。ＮＡ可能通过包括抑制ＮＯ生成等多方面机制,实现对ＩＬ－１β诱导的胰岛细胞损害的保护作用。