胆固醇结石患者固醇携带蛋白2基因单核苷酸多态性的检测

目的:检测胆固醇结石患者和非胆石患者固醇携带蛋白2(SCP2)基因单核苷酸多态性(SNP),并探讨SNP与胆固醇结石的关系.方法:应用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染技术并结合DNA直接测序,检测了58例散发胆固醇结石病人和50例非胆石病人SCP2基因的部分启动子区、全部编码区及部分3,未翻译区序列.结果:SCP2基因第14外显子检出变异DNA单链泳动条带.58例散发胆固醇结石病人中共有31例检测出变异DNA单链泳动带,突变率为53.45%;而50例非胆石病人仅有7例检测到变异泳动带,突变率为14.00%;两组突变率差异有显著性(x2=20.123,P＜0.001).部分病例pCR产物直接测序发现G284→A碱基颠换,为同义突变.结论:SCP2基因 284位点突变不影响SCP2蛋白的结构和功能,但G284→A的基因型频率在胆固醇结石患者较非胆固醇结石病人为高,有一定的诊断参考价值.     

ctDNA与肿瘤

循环肿瘤DNA(ctDNA)主要是指肿瘤体细胞在凋亡/死亡时以及肿瘤细胞异常分泌释放进入循环系统一种无细胞状态的胞外DNA,包括单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物。ctDNA作为一种特征性的肿瘤生物标记物,可以被定性、定量和追踪,将在肿瘤的早期诊断、发展过程监测、预后判断以及个性化用药指导等方面发挥重要作用。     

散发性乳腺癌中BRCA1和BRCA2基因突变的研究

目的检测BRCA1和BRCA2基因在散发性乳腺癌中的突变情况,探讨BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关系。方法选取2000年12月至2005年9月收治的144例乳腺癌患者标本作实验组,另取非癌乳腺组织标本30例作对照组。用酚-氯仿抽提法提取DNA。针对各个外显子的碱基序列特征,设计有助于筛查基因碱基突变的聚合酶链反应（PCR）引物。每例DNA标本均用PCR扩增BRCA1基因的全部22个外显子和BRCA2基因的exon10和exon14两个外显子。分别将每例外显子的PCR扩增产物进行单链构象多态性分析,对泳动变位或出现异常区带的PCR扩增产物进行DNA测序。结果对照组未检测出BRCA1和BRCA2基因突变,实验组中检测出20例BRCA1基因碱基改变,总突变率为13．9％,其中错义突变率为11．1％。BRCA2基因exon10和exon14未检测出突变。结论BBCA1突变与乳腺癌密切相关,筛查BRCA1基因突变对于中国人群乳腺癌患病风险评估、早期诊断及基因治疗具有重要意义。     

MicroRNA与肾脏

MicmRNAs（miRNAs）是一类真核生物高度保守的内源性非编码单链小分子RNA,长度约21～24个核苷酸。由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体（pre2miRNA）经过Dicer酶（an RNase Ⅲ enzyme,核糖核酸Ⅲ酶）加工后生成,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对,引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而在转录后水平调控基因的表达,其基因表达具有时序性和组织特异性。转录后调节,     

微卫星不稳定性,缺乏基因错配修复和大肠癌之间的关系

从目前研究看 ,大肠癌的发生无外乎有以下二种途径之一。第一是染色体不稳定性 (chromosomal in-stability,CI) ,另一种是微卫星不稳定性 (microsatel-lite instability,MSI)。染色体不稳定可以影响成百上千对碱基改变 ,而 MSI影响的是单个或一小段碱基的改变 ,其表现是 DNA片段的高度重复性改变 ,即高频端卫星不稳定性 (high- frequency MSI,MSI- H)。引起染色体不稳定性的原因目前尚不清楚 ,而 MSI- H基因表型是由于缺少 DNA复制后的错配修复引起的。错配修复功能是保证人体 30 0万对碱基忠实复制的校正系统 ;从目前研究看 ,至…     

肿瘤表观遗传研究的现状与展望

表观遗传是指在不改变DNA碱基序列的情况下DNA碱基及DNA所缠绕的组蛋白的共价修饰在细胞分裂过程中的可遗传性。20多年前人们发现在肿瘤细胞及组织中存在异常的DNA甲基化并由此引起很多抑瘤基因的失活，DNA甲基化被认为是一种很有希望的瘤标和治疗肿瘤的切入点。近十年来，大量的文献报道了几乎所有肿瘤中存在这样的甲基化异常及其所关联的抑瘤基因失活。     

胰腺癌microRNA与DNA甲基化修饰相互调控研究进展

microRNAs (miRNAs)是内源性非编码的单链小分子RNA,与DNA甲基化修饰在肿瘤的发生及发展的过程中有着重要的作用,并且两者之间也存在着复杂的互相调控的机制.miRNAs受DNA甲基化调控并影响DNA甲基化的程度.而miRNAs在胰腺癌中的异常表达,致使其靶基因的相应生物功能紊乱,促进胰腺癌的发展.随着研究的深入,miRNAs也将用于胰腺癌的临床诊断及治疗.本综述就miRNAs在胰腺癌中的表达谱及DNA甲基化参与miRNA的调控进行阐述,了解调控胰腺癌表达的遗传学途径,丰富其发病机制.     

人原发性肝癌中多种基因CpG岛甲基化研究进展

1概述在表观遗传学(epigenesis※)这个发展非常快的领域,DNA甲基化,组蛋白去乙酰化和RNA介导是基因沉默(silencing)的三大主要原因。在人类基因组DNA中,约3%～4%的胞嘧啶碱基以5甲基胞嘧啶形式存在,结果导致在人类正常组织细胞DNA中,5甲基胞嘧啶占所有核甘酸碱基的0.75%～1%。大约70%～80%的5甲基胞嘧啶存在于CpG序列中,CpG二核甘酸集中的区域称之为CpG岛,这部分通常是未甲基化,这些CpG岛跨过许多基因的5’末端———包括启动子,未翻译区和第一外显子。现在知道的哺乳类基因组中至少一半基因的启动子区存在CpG岛,其甲基化只发生在…     

微小RNA-192在肾脏疾病中的研究进展

正微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类由18~24个核苷酸组成的单链小分子RNA。在生物体内,微小RNA不直接编码蛋白质,而是与靶mRNA 3’端非翻译区(3’-UTR)的特异性碱基序列配对,降解靶mRNA或抑制其翻译,从而抑制靶基因转录后的表达。目前已发现的微小RNA达千种,其自身表达具有高度保守性、时序性和组织特异性。MicroRNAs在生物体内主要以三种形式存在:固有细胞中     

DNA复制错误在年轻结直肠癌病人中的预后价值

目前研究发现，负责修复DNA错配核苷酸的基因突变与绝大多数遗传性非息肉病结直肠癌综合征（HNPPC）和一部分散发的结直肠癌病例有关。测定这些基因的改变可通过检测染色体随体来完成。染色体随体是分散到人体基因中的短片重复的基因序列，通常由6个或更少的重复的DNA碱基组成，其总长度不超过100个碱基。在酵母菌、细菌及HNPPC肿瘤细菌中这些重复的序列常表现为不稳定性，其特征是重复碱基数量上的显著差异，称为复制错误（Replicationerrors，简称RER）。或称为随体不稳定性。材料与方法36例结直肠癌患者均为40岁以下，家族性腺瘤…     

人原发性肝癌中多种基因CpG岛甲基化研究进展

在表观遗传学(epigenesis)这个发展非常快的领域，DNA甲基化，组蛋白去乙酰化和RNA介导是基因沉默(silencing)的三大主要原因。在人类基因组DNA中，约3％～4％的胞嘧啶碱基以5-甲基胞嘧啶形式存在，结果导致在人类正常组织细胞DNA中，5-甲基胞嘧啶占所有核甘酸碱基的0．75％～1％。大约70％～80％的5-甲基胞嘧啶存在于CpG序列中，CpG二核甘酸集中的区域称之为CpG岛，这部分通常是未甲基化，     

人肠癌RKO细胞周期依赖性激抑制因子基因启动子区甲基化状态的研究

目的 探讨人结肠癌RKO细胞周期依赖性激酶抑制因子(CKIs)家族启动子区CpG岛甲基化状态及其甲基化可逆性特征.方法 应用特异性DNA甲基转移酶(DNMTs)抑制剂5-Aza-2]-deoxycytidine(5-Aza-CdR)处理肠癌细胞,甲基特异性聚合酶链反应(Methylation-Specific PCR,MSP)、T-A克隆及DNA测序法分析RKO细胞CKIs家族抑癌基因p15ink4b、p16ink4a/CDKN2、p21/cip、p27/kip启动子CpG岛甲基化状态.结果 未经5-Aza-CdR作用的肠癌RKO细胞,其p15ink4b、p16ink4a/CDKN2基因组DNA胞嘧啶(C)保持不变,这提示在其单链DNA中胞嘧啶呈甲基化状态;而经5-Aza-CdR作用的肠癌RKO细胞,其p15ink4b、p16ink4a/CDKN2、p21/cip和p27/kip基因组DNA胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,表明在DNA单链中胞嘧啶已呈去甲基化状态.结论 肠癌RKO细胞周期INK4家族(p15ink4b和p16ink4a/CDKN2)基因的启动子区处于异常的高甲基化状态,而KIP/CIP家族(p21/cip和p27/kip)基因未处于高甲基化状态;5-Aza-CdR能较好地逆转肿瘤细胞INK4家族基因DNA高甲基化状态.     

人乳腺癌组织中p53基因单核苷酸多态性位点变异的研究

目的 观察乳腺癌患者p53基因的单核苷酸多态性位点(SNPs)变异,探讨p53基因在乳腺癌癌基因学中的意义.方法 选取p53基因位于外显子及内含子的共3对引物,利用SSCP(单链多肽构象)分析方法对30例乳腺癌样品进行分析及DNA测序.结果 在检测的30例乳腺癌组织样品中,p53基因在第一内含子和第七内含子中共有4个碱基替换被检测出,其中3个为Hapmap(Hapolotype Map Project,国际单倍型图谱计划)中已公布的SNP位点,另外1个从未被确认.在p53第7内含子位置处发现一高突变率(20%)的G→A(rs12947788)类型基因替换,在其上游20个碱基位置处存在另一已知高突变率的SNP位点A→C(rs12951053),此两者联合出现,在所检测的30例乳腺癌组织样本中共发现6例,占所检测标本的20%.结论 p53基因的SNPs分析对乳腺癌的早期发现、治疗和预后有一定意义.     

利用噬菌体展示技术制备人血管生成素2单链抗体

目的 用纯化的人血管生成素2(Ang2)蛋白,通过噬菌体展示技术从非免疫小鼠噬菌体展示抗体库中淘选、鉴定Ang2单链抗体.方法 以纯化的人Ang2蛋白为抗原,对非免疫小鼠噬菌体展示抗体库进行富集和筛选,获得Ang2单链抗体,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot法检测目的蛋白的表达并测序.结果 经过3轮富集和筛选,获得了1个能特异性识别Ang2蛋白的阳性噬菌体克隆,DNA测序表明其含有完整的单链抗体基因片段,大小约750 bp,表达蛋白相对分子质量约33.7×103；通过SDS-PAGE进一步实现Ang2单链抗体(phage-Ang2-scFv)的鉴定.结论 成功分离并鉴定人Ang2-scFv,为进一步的功能学研究奠定了基础.     

瘢痕疙瘩CAMTAl基因G65551片段突变的研究

目的 利用变性高效液相色谱法(DHPLC)结合DNA直接测序法,筛选和鉴定瘢痕疙瘩CAMTA1基因G65551片段突变情况.方法 PCR扩增13例瘢痕疙瘩患者的瘢痕组织和血液标本1p6区域CAMTA1基因G65551片段.采用DHPLC技术,对扩增片断进行基因变异检测,随机选取不同类型PCR片断,进行全序列测定并对照分析.结果 DHPLC筛查显示,在扩增片段中出现单个色谱峰,提示为纯合链;双峰则表示是杂合异源双链.瘢痕疙瘩组双峰出现率92.3%(12/13);对照组为38.5%(5/13);DNA测序发现2个突变位点,其中第54位碱基G/T的颠换突变率:瘢痕疙瘩组为69.2%(9/13),对照组为38.5%(5/13),第412位碱基T的缺失突变率:瘢痕疙瘩组为92.3%(12/13),对照组为15.4%(2/13).经X2检验(确切概率法),第54位点突变差异无统计学意义(P>0.05);第412位点突变差异有统计学意义(P<0.05).结论 DHPLC结合DNA直接测序是一种高效、经济、简便、可靠的筛选碱基位点突变的方法 ;CAMTA1基因G65551片段突变与瘢痕疙瘩的发生有关,CAMTA1基因可能是瘢痕抑制基因.     

自由基与前列腺

氧化还原反应是人体内最为广泛和重要的化学反应,自由基是其重要的反应成份。自由基广泛涉及到衰老、退行性疾病及肿瘤的发生。近年来,自由基与前列腺关系的研究受到重视。本文重点讨论一氧化氮对前列腺功能的调节;前列腺增生组织中DNA碱基损伤与抗氧化酶活性;雄激素诱导前列腺癌细胞氧化还原变化原因和结果的研究进展。     

基因直接测序分析HBV多聚酶区基因突变与基因分型

HBV是一种嗜肝DNA病毒,其基因组为3200bp的双链DNA分子,按照全基因序列的异质性,HBV可分为A-H等8个基因型。HBV的变异率极高,而且具有很高的复制率,在由共价闭合环状DNA反转录过程中因HBV聚合酶和反转录酶缺乏校正活性,因此不能去除错误掺入的碱基。HBV常引起慢性持续感染,在长期反复感染和复制中发生变异,并受人体免疫应答、抗病毒药物等环境因素的影响。核苷（酸）类似物拉米夫定和替比夫定等抗病毒药物的作用靶点均为HBV聚合酶和反转录酶,     

抗肝癌单链免疫毒素在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的 构建分泌型抗肝癌单链免疫毒素真核表达载体并在人肝癌细胞系SMMC-7721中表达。方法 采用PCR方法在抗肝癌sFv的5′端引入引导序列使其能够在真核细胞中表达并分泌，在其下游连接人TNF-α基因，构建分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因，并将该基因克隆人带有GFP报告基因的真核表达载体，用磷酸钙共沉淀法转染人肝癌细胞系SMMC-7721进行瞬时表达。结果 DNA序列分析证实在sFv的5′端引入正确的60bp引导肽序列，酶切鉴定证明成功构建了分泌型抗肝癌单链免疫毒素融合GFP真核表达载体，并在SMMC-7721细胞中成功地表达了融合荧光蛋白。结论 成功构建并表达了分泌型抗肝癌单链免疫毒素融合GFP基因，为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

一个影响前列腺癌中L-plastin启动子转录活性的多态性位点的成功鉴定

目的研究已发现的前列腺癌中L-plastin启动子一个多态性位点对其转录活性的影响和意义。方法扩增前列腺癌细胞株LNCaP中L-plastin启动子序列,发现在距离转录起始点-1751上存在多态性位点T后,利用定点突变技术构建文献报道的启动子序列质粒(-1751C),测定含-1751T质粒和含-1751C质粒的荧光素酶活性。用巢式PCR扩增前列腺癌细胞株和癌组织中该位点序列,并进行单链构象多态性分析。结果成功构建L-plastin启动子,并发现一个位于-1751的多态性位点(C/T);成功构建启动子序列含-1751C质粒;荧光素酶活性测定表明(-1751C)质粒启动子转录活性为(-1751T)质粒的4~5倍,2者受到雄激素刺激后活性均升高;单链构象多态性分析表明该位点多态性普遍存在于前列腺癌患者和细胞株。结论鉴定了一个普遍存在于前列腺癌的L-plastin基因启动子的多态性位点,含有不同碱基位点的启动子的转录活性明显不同。     

反义端粒酶RNA抑制肿瘤细胞的研究进展

端粒酶具有很高的肿瘤特异性,迄今发现约90％的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性,而大部分正常细胞不表达端粒酶.抑制端粒酶活性是目前肿瘤治疗的一个新靶点.端粒酶RNA组分中含有与端粒DNA序列互补碱基模板序列,针对该模板序列设计的反义核甘酸可阻断其模板作用,从而使端粒酶合成端粒DNA序列.如此既能高特异性杀死、杀伤肿瘤细胞,对正常组织又不会造成大的毒副作用,因而成为一个很有吸引力的基因治疗靶点.