重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定

目的 :构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT6 4重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 .方法 :用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出MPT6 4基因片段 ,插入 pGEM T easy载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体pProEXHTb中 ,在大肠杆菌DH5α中表达 .结果 :获得结核分枝杆菌MPT6 4成熟蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致 ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与文献报道一致 ;重组蛋白经蛋白印迹实验 ,在Mr2 .6× 10 4位置有特异条带 .MPT6 4蛋白在宿主菌中表达量约占菌体总蛋白的 13.5 % .结论 :基因重组表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于结核病的预防疫苗的研制和皮肤免疫诊断试剂的制备 .     

MPT64检测作为结核分枝杆菌生长指标的研究

目的分析把检测MPT64作为结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）生长指标的可行性。方法对MTB阳性液体培养物进行MPT64检测,分析其作为MTB生长指标的有效性;对不同稀释浓度（1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml和0.001mg/ml）的MTB阳性液体培养物进行MPT64检测,分析该项检测的指示最低限;对不同放置时间（10d、30d、60d）的MTB阳性液体培养物进行MPT64检测,分析指示的稳定性。结果 20份MTB阳性液体培养物的MPT64检测均阳性,该项检测能100%有效指示MTB的生长;3份MTB阳性液体培养物1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml稀释浓度的MPT64检测均阳性,其中2份MTB阳性液体培养物0.001mg/ml稀释浓度的MPT64检测阳性,而另1份则检测阴性,该项检测的指示最低限为0.01mg/ml;10份MTB阳性液体培养物放置30d、60d后MPT64检测均为阳性,该项检测用于指示MTB生长具有很好的稳定性。结论 MPT64检测可作为MTB生长的一种指示手段。     

结核分枝杆菌抗原MPT83和MPT64 二价基因疫苗的研究

目的探讨结核杆菌两种抗原MPT83 和MPT64基因疫苗的免疫原性和免疫保护性.方法用成对引物扩增MPT83 和MPT64两种抗原基因,构建到同一载体pJW4303中,测序正确和体外表达验证后免疫小鼠,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定3次免疫后小鼠的抗体滴度.对3次免疫后的小鼠脾细胞进行培养,抗原刺激,用夹心 ELISA方法测定细胞因子IFN-γ和IL-4的含量.免疫小鼠攻毒,进行细菌培养,检测肺脏和脾脏的载菌量.结果每次免疫后抗原的滴度分别为 1∶ 200、1∶ 800、1∶ 6400,而卡介苗(BCG)组的抗体滴度为1∶ 800,空载体组未检测到抗体滴度.融合的二价基因疫苗免疫小鼠,主要诱发Th1 型细胞因子,IFN-γ占优势,二价组中的含量为7520 pg/ml, IL-4的含量仅为ng级.H37Rv攻毒后,二价组小鼠的肺脏载菌量为(2.21±0.03) ×105,比空载体免疫小鼠低103倍,比BCG免疫小鼠低10倍.结论抗原MPT83和MPT64二价基因疫苗有效提高了机体保护效力,对于结核病的防治具有一定的借鉴价值.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白MPT64的免疫学特性. 方法:用原核表达的MPT64蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果. 分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激,MTT方法检测IFN-γ产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖,并对脾脏细菌负荷计数. 结果:MPT64免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激,淋巴细胞的增殖较显着. MTT方法检测小鼠的IFN-γ量为1024 ng/L,而生理盐水对照组低于80 ng/L. 结论:MPT64蛋白有可能作为新型结核疫苗的组分.     

MPT64 DNA疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的:研究MPT64 DNA疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.方法:C57BL/6小鼠36只,随机分为4 组.A组(PBS)、B组(pcDNA3.1)、C组(BCG)、D组(pcDNA/MPT64);分别于胫前肌注射质粒DNA免疫,70 μg/次,1次/2 wk,共3次.末次免疫后5 wk用106 CFU H37Rv经尾静脉攻击,攻击后6 wk处死小鼠,测血清总IgG,特异性脾淋巴细胞增殖实验、IFN-γ及IL-4分泌水平.作脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及观察小鼠存活时间.结果:MPT64基因疫苗诱导小鼠特异性IgG的产生、脾淋巴细胞增殖以及IFN-γ的分泌.MPT64 DNA免疫组肺、脾组织荷菌量,病理学改变和小鼠存活时间明显优于阴性对照组.结论:MPT64 DNA疫苗在抗结核分枝杆菌(Mtb)感染过程中具有一定免疫保护作用.     

结核分枝杆菌宁夏分离株MPT64基因的生物信息学分析

目的对结核分枝杆菌H37Rv(宁夏分离株NXT1024)MPT64基因进行生物信息学预测和分析,通过与结核杆菌标准株序列的比对,观察其变异情况。方法提取结核分枝杆菌H37Rv(宁夏分离株NXT1024)基因组,以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR),从中扩增出MPT64基因,并测序,测序结果利用DNA star软件初步预测出该蛋白的分子特征、抗原性和二级结构等生物信息学信息。结果 MPT64基因全长为687bp,BLAST结果显示基因序列与GeneBank公布的标准株的基因序列的核苷酸同源性为93.6%,对该序列编码蛋白质的构象测试发现,该MPT64编码蛋白含有多个β转角结构,及多个明显的具有抗原活性的结构域和免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点。结论以结核分枝杆菌宁夏分离株为模板成功扩增MPT64基因,该株与标准株的核苷酸同源性为93.6%。通过生物信息学分析获得了该蛋白的蛋白构象、抗原活性的结构域及T细胞表位等相关的生物学信息特征。     

结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞凋亡的抑制作用

目的探讨结核分枝杆菌MPT64抗原对RAW264.7巨噬细胞的影响及相关机制。方法将MPT64基因在大肠杆菌中表达、纯化,获得的纯化蛋白用于后续实验。将用佛波醇酯(PMA)分化的RAW264.7巨噬细胞分为对照组、卡介菌纯蛋白衍生物(BCGPPD)诱导组、BCG-PPD+MPT64共同作用组,分别给予相应的处理。孵育16 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,用ELISA试剂盒检测培养细胞上清的细胞因子TNF-α及IL-10水平。结果 BCG-PPD可以诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,BCG-PPD+MPT64组的细胞凋亡水平低于BCG-PPD组(P<0.05)。细胞因子上清检测结果表明,与对照组相比,BCG-PPD作用组的TNF-α水平升高(P<0.01),而IL-10水平无明显变化;与BCG-PPD组相比,BCG-PPD+MPT64共同孵育组的IL-10水平升高(P<0.01),而TNF-α水平无明显变化。结论 MPT64抗原可能是一种毒力因子,能够抑制BCG-PPD诱导的巨噬细胞凋亡,该作用可能是通过提高IL-10水平来实现的。     

应用MPT64为靶标快速检测结核分枝杆菌生长的研究

目的探讨应用MPT64作为快速检测结核分枝杆菌生长指示的可能性,以期建立一种准确、快速、简便、易于普及开展的结核分枝杆菌生长检测方法。方法应用BACTEC MGIT960分枝杆菌快速培养仪器系统培养法对4株结核分枝杆菌1 mg/mL纯培养物菌液进行10倍稀释共7个稀释浓度的32例菌悬液、64例涂片抗酸染色阳性样本及98例非选择性临床送检样本进行培养。同时,对菌悬液,高浓度MPT64检测阳性时,即对下一浓度每天进行1次MPT64检测,对涂片阳性样本培养管每天进行1次MPT64检测,阴性者检测至培养阳性出现或至培养42 d;对非选择性临床送检样本每周定时进行1次MPT64检测,阴性者检测至培养6周。结果(1)4株结核分枝杆菌1 mg/mL纯培养物菌液稀释试验显示:应用MPT64作为快速检测结核分枝杆菌生长指示的最小菌量为10-7～10-6mg/mL,仪器系统培养法为10-6～10-5mg/mL。(2)64例涂片抗酸染色阳性样本63例培养阳性,其中菌种鉴定为结核分枝杆菌的58例样本中56例MPT64检测阳性,检出时间为3～16 d,平均7.8 d,其培养阳性检出时间为6～30 d,平均13.7 d。其余5例非结核分...     

免疫层析法检测MPT64蛋白在结核与非结核分枝杆菌鉴定中的临床应用价值

目的评价免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌的临床应用价值。方法采用免疫层析法检测201株分枝杆菌,其中包括4株结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex,MTC)标准株、135株结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株、17株非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacterium,NTM)标准株和45株NTM临床分离株的MPT64蛋白。结果 4株MTC标准菌株和135株MTB临床分离株中,138株MPT64蛋白检测阳性,1株检测为阴性,敏感性为99.3%(138/139),17株NTM标准株和45株NTM临床分离株MPT64蛋白检测均为阴性,特异性为100%(62/62),201株结核和非结核分枝杆菌MPT64蛋白检测的准确度为99.5%(200/201)。结论应用免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌敏感性高,特异性强,方法简便、快速、准确,具有良好的临床应用前景。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因测序质粒及真核表达重组质粒的构建

目的 构建结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6基因测序质粒及真核表达重组质粒，为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR法对基因ESAT—6进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误，再将PCR反应产物经酶切后，克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。结果 构建了结核杆菌基因ESAT—6的重组测序质粒，并对其进行了测序。真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6亦构建成功。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及相应抗原、抗体的制备打下基础。     

结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .     

结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因的克隆及生物信息学分析

目的获得结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因,进行DNA测序、序列特性生物学特性分析,为研究结核病诊断抗原侯选基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,测序表明该片段由699bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为98%,推导编码氨基酸序列同源性为98%。结论经DNA测序证实,扩增出的片段确为MPT64,该片段阅读框完整。     

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的　克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法　以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( )中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果　重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论　结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性、免疫保护性及其二者之间的相互作用奠定了基础