问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL41/1融合基因原核表达系统的构建及其应用

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL41/1融合基因及其原核表达系统,了解钩体野生株lipL32和lipL41基因携带和表达情况及钩体患者的血清抗体水平.方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL41/1融合基因,常规方法构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rLipL32/1-rLipL41/1表达情况.采用Western blot鉴定rLipL32/1- rLipL41/1的免疫原性.采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株lipL32和lipL41基因及其表达情况.采用ELISA检测228例钩体患者血清lipL32和lipL41基因产物的抗体.结果:与报道的相关序列比较,lipL32/1-lipL41/1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%和99.8%.目的重组蛋白rLipL32/1-rLipL41/1表达产量约为细菌总蛋白的10%,主要以包涵体形式存在.rLipL32/1和rLipL41/1兔抗血清均能与rLipL32/1-rLipL41/1结合.97.9%和87.6%问号钩体野生株分别有lipL32和lipL41基因.95.9%和84.5%问号钩体野生株分别与rLipL32s和rLipL41s兔抗血清出现效价,为1:4～1:128的MAT阳性结果.分别有94.7%～97.4%和78.5%～84.6%患者血清rLipL32s和rLipL41s抗体阳性.结论:本研究成功地构建了lipL32/1-lipL41/1融合基因及其原核表达系统,所表达的产物具有良好的免疫原性.lipL32和lipL41是广泛存在于不同血清群问号钩体并有较高表达率的基因,且其不同基因型的表达产物有交叉抗原性.     

问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定.方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统.采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量.采用免疫双扩散试验及Western Blot,鉴定rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2的免疫原性.结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coli BL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2.表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78 mg/L,是优化前的3.7倍.rLipL32/1-LipL21- OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4.rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2.rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号.结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原.     

问号钩端螺旋体lipL21基因改建及其表达产物免疫原性变化和定位

目的:改建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL21基因核苷酸序列以提高表达产量并了解基因改建前后表达产物免疫原性变化,确定外膜脂蛋白LipL21在钩体表面的定位。方法:参照大肠杆菌偏爱密码子设计,合成lipL21基因核苷酸序列并构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测改建前后lipL21基因表达量变化。采用钩体TR/Patoc抗血清为一抗的Western blot鉴定改建前后两种目的重组蛋白rLipL21s的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)比较改建前后rLipL21s抗血清对不同钩体血清群的交叉免疫凝集效价变化。应用免疫电镜技术对LipL21进行定位。结果:改建前后lipL21基因表达量分别为细菌总蛋白的8.5%和46.5%。两种rLipL21均能与TR/Patoc抗血清发生免疫结合反应,免疫家兔后均能产生特异性抗体。两种rLipL21兔抗血清对我国15群15型钩体参考标准株MAT效价相近,均为1∶80~1∶320。LipL21位于钩体外膜表面。结论:LipL21是钩体表面抗原。改建后的lipL21基因可明显提高原核表达产量,其产物可保持良好的抗原性和免疫反应性,其抗体具有广泛的交叉免疫凝集活性。     

问号钩端螺旋体lipL32／1-zipL21-OmpL1／2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析

目的：构建问号钩端螺旋体（简称钩体）lipL32／1-lipL21-OmpL1／2融合基因及其原核表达系统，优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法：采用连接引物PCR构建lipL32／1-lipL21-OmpLl／2融合基因，并用常规基因工程方法建立其原核表达系统。采用SDS—PAGE及Bio—Rad凝胶图象分析系统，检测目的重组蛋白rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2表达量。采用免疫双扩散试验及WesternBlot，鉴定rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2的免疫原性。结果：获得了序列正确的lipL32／1-lipL21-OmpL1／2融合基因及其原核表达系统E．coli BL21DE3^pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2。表达条件优化后的rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2产量为37．78mg／L，是优化前的3．7倍。rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2兔抗血清免疫双扩效价为1：4。rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2抗血清能识别rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2以及rLipL32／1、rLipL21、rOmpL1／2。rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号。结论：成功地构建了lipL32／1-lipL21-OmpL1／2融合基因及其原核表达系统，表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性，可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原。     

rLTB/rCTB-rOmpL1/1融合基因及其原核表达系统的构建和鉴定

目的:构建ltB/ctB-ompL1/1融合基因及其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性,检测问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株ompL1基因的携带和表达情况及钩体患者血清特异性抗体水平.方法:采用连接引物PCR构建ltB-ompL1/1和ctB-ompL1/1融合基因,常规方法构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE、Western blot和GM1-ELISA分别检测目的重组蛋白rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1表达量、免疫反应性及与GM1结合的活性.采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株ompL1基因及其表达情况.采用ELISA检测228例钩体患者血清ompL1基因产物的抗体.结果:与报道的相关序列比较,ltB-ompL1/1和ctB-ompL1/1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性,分别为99.7%～99.9%和99.5%～100%.rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1表达产量均约为细菌总蛋白的10%,主要以包涵体形式存在.rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1均分别能与rOmpL1/1兔抗血清和牛GM1结合.89.7%问号钩体野生株含有ompL1基因,87.6%问号钩体野生株分别与rOmpL1/1和rOmpL1/2兔抗血清出现效价,为1:4～1:256的MAT阳性结果.86.8%和88.6%的患者血清标本rOmpL1/1和rOmpL1/2抗体阳性.结论:rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1融合蛋白有良好的免疫原性及与GM1结合的活性.不同问号钩体血清群中广泛存在ompL1基因并高频率表达,不同基因型表达产物有广泛的交叉抗原性.     

不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究

目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体）株携带侵袭相关mce基因情况，原核表达mce基因并制备其抗血清，了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法：采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段，T—A克隆后测序。采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统，SDS—PAGE联合Bio—Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况，采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清，免疫双扩散试验测定其效价。采用实时荧光定量RT—PCR，检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A．1细胞前后mce基因转录水平的变化。结果：我国13株问号钩体株均携带mce基因，双曲钩体三宝垄群patoc型PatocI株则否。与报道的序列（GenBank accession No．：NP_712236）比较，所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．02％～100％和97．91％～100％。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce，其产量为细菌总蛋白的5％。问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce。问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调。结论：mce基因仅存在于致病性的问号钩体中，且其转录水平呈细胞接触上调模式，表明该基因与问号钩体致病性密切相关。mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段。     

基于问号钩端螺旋体rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2融合抗原的ELISAs建立及应用

目的：建立基于问号钩端螺旋体（简称钩体）rLipL32／1-LipL21-OmpLl／2融合抗原的ELISAs，并应用于检测钩体病患者血清特异性IgG和IgM。方法：采用显微镜凝集试验（MAT），检测钩体病患者血清及rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2兔抗血清对我国问号钩体参考标准株的效价。分别以rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2、rLipL32／L、rLipL21和rOmpL1／2为包被抗原，建立检测血清特异性IgM和IgG的ELIsAs，并用于检测107份MAT阳性钩体病患者血清标本。结果：MAT结果证实，66％（71／107）患者感染黄疸出血群问号钩体，rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2兔抗血清对我国15株问号钩体参考标准株的凝集效价为1：20～1：160。rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2、rLipL32／1、rLipL21、rOmpL1／2抗原用于检测IgM的ELISA阳性率分别为89．7％、75．7％、85．1％和79．4％，用于检测IgG的ELISA阳性率分别为99．1％、99．1％、94．4％和86．09／6。rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2-IgM—ELISA检测阳性率高于其它3种检测IgM的ELlSAs（P〈0．05），rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2-IgG—ELISA检测阳性率高于rOmpLl／2IgGELISA（P〈0．05），但与rLipL21-IgGELISA及rLipL32／1-IgGELISA接近（P〉0．05）。结论：rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2-ELISAs可作为敏感、特异的通用型钩体病血清学早期诊断方法。     

我国主要致病钩端螺旋体DNA与OmpL1基因同源性的研究

用＾３２Ｐ标记的ＯｍｐＬ１基因片段与我国１８株钩体进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析。此片段与非致病钩体ＰａｔｏｃＩ株、伊利尼细丝体３０５５株无杂交信号；问号钩体中，除爪哇群、塔拉索夫群、曼耗群和明尼群的４株钩 体外，黄疸出血群、犬群、拜伦群、致热群、澳洲群、波摩那群、流感伤寒群、七日热群、巴达维亚群、赛罗群各群钩体参考株ＤＮＡ均有杂交信号。     

钩端螺旋体groEL基因原核表达及其产物免疫保护作用

目的：构建问号钩端螺旋体（简称钩体）黄疸出血群赖型赖株groEL基因原核重组表达系统,了解重组表达的GroEL蛋白（rGroEL）对金地鼠的免疫保护作用。 方法：采用高保真PCR扩增问号钩体赖株groEL基因并测序,常规方法构建groEL基因原核表达系统。采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检查rGroEL表达情况及其可溶性,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL。观察rGroEL免疫金地鼠对问号钩体赖株感染的保护率。采用MAT法检测免疫动物血清与我国流行问号钩体血清群交叉凝集效价。 结果：所克隆的groEL基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中相应基因完全相同。所构建的groEL基因原核表达系统能表达可溶性rGroEL。100和200 μg rGroEL对金地鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%。rGroEL免疫金地鼠血清可不同程度地凝集各问号钩体血清群。 结论：GroEL蛋白是问号钩体属特异性保护性抗原,可用于制备通用性钩体基因工程疫苗。     

我国主要致病钩端螺旋体DNA与OmpL1基因同源性的研究

用￣（３２）Ｐ标记的ＯｍｐＬ１基因片段与我国１８株钩体进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，此片段与非致病钩体ＰａｔｏｃＩ株、伊利尼细丝体３０５５株无杂交信号；问号钩体中，除爪哇群、塔拉索夫群、曼耗群和明尼群的４株钩体外，黄疸出血群、犬群、拜伦群、致热群、秋季群、澳洲群、波摩那群、流感伤寒群、七日热群、巴达维亚群、赛罗群各群钩体参考株ＤＮＡ均有杂交信号。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛相关外膜蛋白pgmA基因的克隆和表达

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)pgmA基因,构建pgmA基因表达载体,鉴定其表达产物的免疫性.方法:采用高保真PCR分别从牙龈卟啉菌ATCC 33277和47A-1菌株中扩增pgmA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的pgmA表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用兔抗融合蛋白血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,采用ELISA 检测65株临床分离牙龈卟啉单胞菌与PgmA融合蛋白抗血清的反应情况.结果:所克隆的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277与47A-1菌株pgmA基因的核苷酸序列同源性为100%,与报道的相应核苷酸序列同源性为98.98%,氨基酸序列同源性高达99.18%.pET32a-pgmA-BL21DE3系统的PgmA融合蛋白表达量为细菌总蛋白的50%左右.PgmA融合蛋白免疫家兔能获得相应抗体并与PgmA蛋白发生结合反应.ELISA结果证实92.3%的牙龈卟啉菌临床菌株(60/65)能与PgmA融合蛋白抗血清发生结合反应.结论:本研究成功地构建了Pg pgmA高效表达系统,所表达的PgmA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Pg检测试剂盒和Pg疫苗的候选抗原.     

可溶性HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白的构建表达及功能鉴定

目的 构建HLA-B54/IgG1真核表达载体,稳定转染至721.221细胞中,获得HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白.方法 通过RT-RCR我们获得了HLA-B54的胞外段与人IgG1的CH1-CH2-CH3的cDNA,将HLA-B54与IgG1重链的恒定区插入到质粒pcDNA3.1（＋）中形成pcDNA3.1（＋）-HLA-B54/IgG1Fc重组基因.为了获得稳定转染,用电穿孔法将质粒pcDNA3.1（＋）-HLA-B54/IgG1Fc转染到721.221细胞中,大量收集通过G418筛选的721.221阳性克隆株的无血清的上清,通过PEG20000浓缩得到可溶性HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白,双抗体夹心ELISA和Western-blot（利用MHCⅠ类特异性抗体、人IgG的Fc段特异性抗体）来鉴定融合蛋白.结果 限制性内切酶酶切鉴定及序列测定等证实了成功构建了pcDNA3.1＋[HLA-B54/IgG1Fc]重组质粒.ELISA和Western-blot结果表明：HLA-B54/IgG1Fc融合基因能够在721.221细胞中表达.融合蛋白由预期的HLA-B54的胞外段与IgG1的Fc段两个部分组成.结论 二聚体融合蛋白HLA-B54/IgG1的构建有助于理解HLA-B54限制性的T细胞反应.     

先天性长QT综合征KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆先天性长QT综合征KCNE1基因，并构建真核表达载体。方法：从人胎盘组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出KCNE1基因；采用T-A克隆法，将KCNE1基因克隆入pCR2．1 TOPO载体中，经限制性酶切基因重组后，构建真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，经DNA测序鉴定，用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果：采用基因克隆和重组法，得到了KCNE1真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，并在HEK293细胞中得到了表达。结论：KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建和表达为进一步的功能研究奠定了基础。