IFNαA－HBVPre－S融合基因的克隆及序列测定

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｐｒｅ－Ｓ蛋白是ＨＢＶ与靶细胞结合的重要蛋白。ＩＦＮ是生物体内具有多种生物功能的细胞因子，ＩＦＮ在乙型肝炎的防治中具有重要意义。通过ＰＣＲ技术，我们在体外扩增了ＩＦＮαＡ基因的全序列和ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ基因的全序列。为了便于融合基因的克隆和表达，我们在引物的５’端设计了相应的酶切位点，保护位点，起始密码和终止密码。通过基因克隆技术，我们构建了ＩＦＮαＡ－ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ融合基因的克隆并进行了序列测定。大量研究表明，ＨＢＶ和靶细胞的结合可能是由ＨＢＶ包膜上的Ｐｒｅ－Ｓ蛋白表位介导的，因此带有附着位点的Ｐｒｅ－Ｓ蛋白，可能比ＨＢｓＡｇ疫苗保护效果好。另一方面，α－干扰素作为治疗乙型肝炎的重要生物制剂，也是乙肝免疫接种过程中良好的免疫性剂。ＩＦＮαＡ－ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ融合基因克隆的成功，为表达同时具有ＩＦＮαＡ生物学活性以及ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ蛋白免疫原性的双特性蛋白奠定了基础。     

BPI23-Fcγ1重组融合蛋白在E.coli中的表达

目的 构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＰＢＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α细胞,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白。结果 （１）ＲＴ－ＰＣＲ     

IFN α A—HBV Pre—S融合基因的克隆及序列测定

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｐｒｅ－Ｓ蛋白是ＨＢＶ与靶细胞结合的重要蛋白。ＩＦＮ是生物体内具有多种生物功能的细胞因子。ＩＦＮ在乙型肝炎的防治中具有重要意义。通过ＰＣＲ技术，我们在体外扩增了ＩＦＮαＡ基因的全序列和ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ基因的全序列，为了便于融合基因的克隆和表达，我们在引物的５’端设计了相应的酶切位点，保护位点，起始密码和终止密码。通过基因克隆技术，我们构建了ＩＦＮ α Ａ－ＨＢＶ Ｐｒｅ－Ｓ     

IFNαA—HBV preS融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物…

本实验利用重组ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因ｐｌｙ５质粒大大肠杆菌ＤＨ５α中表达ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白，该融合基因产物的分子量为３９ｋＤ左右，融合蛋白的表达率为１１．８％，对该融合蛋白的初步鉴定表明，该融合蛋白既具有ＨＢＶｐｒｅＳ蛋白的免疫原性，又具备ＩＦＮα的生物学活性。     

IFNα A-HBV preS 融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性的初步鉴定

本实验利用重组ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因ｐｌｙ５质粒在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白。该融合基因产物的分子量为３９ｋＤ左右，融合蛋白的表达率为１１．８％。对该融合蛋白的初步鉴定表明：该融合蛋白既具有ＨＢＶｐｒｅＳ蛋白的免疫原性，又具备ＩＦＮα的生物学活性。     

HBsAg PreS1肽段的基因工程表达与分离纯化

目的 用基因工程的方法表达和纯化ＨＢｓＡｇ－ＰｒｅＳ１（１～６５）太。方法 以ＨＢＶ全基因为模板,ＰＣＲ扩增ＰｒｅＳ１（１～６５）基因,导入谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ－１,构建ｔａｃ启动子控制下的ＧＳＴ－ＰｒｅＳ１（１～６５）融合蛋白表达质粒,转化大肠杆菌ＢＬ２１宿主。结果 工程菌ＢＬ２１ ＰｒｅＳ１（１～６５）产物为可溶性蛋白,表达量约为菌体总蛋白的２０％。用ＮＢＳ－ＢＩＯＦＬ     

HBV Pre S2单链抗体基因在大肠杆菌中的克隆及初步表达

利用基因重组技术，在成功构建ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２单链抗体基因基础上，引人ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ酶切位点，克隆到原核高效表达质粒ｐＢＶ２２０中，筛选到２个重组克隆，经转染大肠杆菌ＤＨ５α，４２℃热敏诱导５～６小时后，超声裂解细菌产物在包被有ｐｒｅ Ｓ２抗原的阻断ＥＬＩＳＡ中，有明显的阻断亲本３Ｂ９单抗对ｐｒｅ Ｓ２抗原的亲和活性，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中，分子量２．８×１０~４处显示一条表达产物带，表达产物占菌体总蛋白的４％左右。初步表明单链抗Ｐｒｅ Ｓ２基因抗体在大肠杆菌中表达，且有较好的Ｐｒｅ Ｓ２抗原结合活性。     

抗内毒素单链抗体基因的构建、序列分析及表达

目的：构建抗内毒素（ＬＰＳ） 单链抗体基因, 并尝试其在Ｅ．ｃｏｌｉ 中的表达。方法： 采用ｌｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍ ｅｒ Ｍｉｘ ,按ＶＨｌｉｎｋｅｒＶＬ 的结构将鼠抗ＬＰＳ ｍ Ａｂ Ｃ３Ａ２ 的ＶＨ ,ＶＬ 基因拼接成单链抗体（ＳｃＦｖ） 基因;用ＰＥ３７３Ａ 型全自动ＤＮＡ序列分析仪测定其核苷酸序列。ＰＣＲ 扩增抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因并更换两端接头序列后,插入谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１ ;转染Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ,以ＩＰＴＧ 诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物。结果：扩增出的ＳｃＦｖ基因长７３５ｂｐ , 序列分析表明,该序列完整、正确;ＳＤＳＰＡＧＥ 显示,转染入重组质粒ｐ４ＴＣ３Ａ２Ｆｖ 的ＪＭ１０９ 菌经诱导后,有相对分子质量（ Ｍｒ） 约为５２ ０００ 的外源蛋白表达。结论：成功地构建了鼠抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达了ＧＳＴＳｃＦｖ 融合蛋白。     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

HBV PreS2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达

ＨＢＶＰｒｅＳ２单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达程云，罗清华，周继文，杨守纯，韩风连，戎广亚，曹阳，季伟３Ｂ９单抗是一株抗ＨＢｖＰｒｅＳ２抗原的单抗。作者利用基因重组技术，在成功构建抗ＨＢＶＰｒｅＳ２３Ｂ９单抗单链可变区抗体（ＳｃＦＶ...     

Prokaryotic expression, purification and identification of VEGFR2 D3.4/GST fusion protein in E.coli

AIM: To construct a prokaryotic expression vector for the expression of VEGFR2 D3.4/GST fusion protein, Express and purify the fusion protein. METHODS: The coding sequence of the third and fourth extracellular domain of human VEGFR2 gene fragment was synthesized and subcloned into pGEX4T-1 vector downstream of the GST fragment, an E.coli expression vector, to construct a recombinant plasmid pGEX4T-VEGFR D3.4. Then the plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) pLysS and induced to express fusion protein VEGFR2 D3.4/GST with IPTG. The expressed protein was purified by washing in urea and detected by SDS-PAGE and Western blot. RESULTS: SDS-PAGE analysis showed that a novel protein with the expected molecular mass (M(r);) about 46 000 was expressed with the inducement of IPTG. And it existed mostly in the form of inclusion body. Grayscale scanning showed that the expressed VEGFR2 D3.4/GST fusion protein accounted for 38.6% of the total bacterium protein. After the purified product was washed by urea, its purity reached 87.1%. Western blot confirmed the recombinant protein was VEGFR2 D3.4/GST fusion protein. CONCLUSION: High purification VEGFR2 D3.4/GST fusion protein is obtained through the E.coli expression system.     

HBV Pre S1蛋白在酵母细胞中的转录激活功能

目的 探索应用双杂交体系统克隆与乙型肝炎病毒（HBV）Pre S1蛋白结合的肝细胞受体的可行性。方法 构建编码HBV Pre S1全序列或部分序列与酵母蛋白GAL 4 DNA结合区域融合蛋白的酵母表达质粒，应用这些质粒转化酵母报道菌株SFY526，检测β－半乳糖苷酶活性作为酵母中转录激活的指标。构建编码Pre S1全序列与GAL4 DNA结合区域融合蛋白的哺乳动物细胞表达质粒，与CAT报道质粒共转染肝癌细胞系Huh-7，使用薄层层析法检测细胞提取物的氯霉素乙酰转移酶活性。结果 全序列Pre S1蛋白与GAL4 DNA结合区域的融合蛋白在酵母细胞中呈现转录激活功能，其转录激活序列被定位于Pre S1第21－47氨基酸之间。全序列Pre S1蛋白与GAL 4 DNA结合区域的融合蛋白在哺乳动物细胞中未呈现转录激活功能。结论 HBV Pre S1蛋白在酵母细胞中的转录激活功能，限制了研究人员应用酵母双杂交体系统克隆与Pre S1结合的HBV受体。然而，Pre S1蛋白在哺乳动物细胞未呈现转录激活功能。哺乳动物细胞双杂交体系统可能是克隆与Pre S1蛋白作用的肝细胞受体的可行途径。     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT—PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX—1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS-PAGE和Western blowing对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21％;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.     

6His-hEra融合蛋白的高效表达

目的 :在原核表达系统中对人Era基因进行表达。方法 :人era编码区基因克隆入pUC19质粒中 ,经全自动序列分析仪测序正确后 ,再克隆入表达载体pRSETB中 ,构建成融合 6个组氨酸的高效表达载体pRSETB Era ,转化大肠杆菌BL2 1DE3(plysS)诱导表达。结果 :经IPTG诱导后 4h ,SDS PAGE及凝胶密度扫描分析 ,表达出分子量约 4 1kD的蛋白 ,占菌体总蛋白的 5 1 2 %。结论 :该基因在大肠杆菌中的高效表达为人era的功能研究打下了基础。     

人Toll 样受体-9胞外区N端蛋白的表达及其抗体的制备

目的:构建人Toll样受体-9(hTLR-9)基因5′端序列的表达质粒,在大肠杆菌中表达,并以表达的hTLR-9-N免疫小鼠制备抗体。方法:构建hTLR-9基因5′端(707~1167bp)的硫氧还蛋白(thioredoxin)融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.5mmol/LIPTG诱导下表达。表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。以8mol/L尿素溶解的包涵体作为免疫原,免疫昆明种小鼠制备抗hTLR-9-N的抗体。结果:融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N在E.coliBL21(DE3)中以相对分子质量(Mr)为31000的包涵体形式表达;Westernblot分析证明hTLR-9-N在大肠杆菌中得到正确表达。表达的目的蛋白初步纯化后的纯度达90%以上;以hTLR-9-N为抗原制备的抗血清效价为1∶25600;该抗血清可以与转染后稳定表达全长hTLR-9的HEK293细胞产生结合反应。结论:成功地在大肠杆菌中表达hTLR-9N末端蛋白,制备的抗hTLR-9-N抗体可特异性结合表达全长hTLR-9的真核细胞。     

TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白原核载体的构建及表达

目的：构建蛋白质转导结构域（protein transduciton domain,PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶（targeted ribonuclease,TR）融合蛋白的原核表达载体。并在大肠杆菌中表达。方法：将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因，乙肝病毒核心蛋白（HBVcore protein,HBVc)基因，人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素（human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因，克隆入含PTDTAT的pTAT原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）LysS内，以I：PTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果：成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体，并在IPTG诱导下获得特异性表达。结论：Tat-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建。为体内应用靶向核酸酶治疗乙型肝炎奠定了基础。     

血管抑制素和内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

血管抑制素（AS）和内皮抑制素（ES）是两种具有较强活性的内源性血管抑制剂，联合应用具有协同作用。本研究通过大肠杆菌表达AS-ES融合蛋白，观察其对血管生成的抑制作用。首先用RT-PCR方法分别获得AS和ES基因，通过基因拼接获得融合基因，构建了含有该融合基因的原核表达质粒——pET-42（b）／AS-ES。表达菌株经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体形式表达，表达量为14％，分子量约65KD。Western blotting检测表明表达产物可分别与AS和ES抗体产生特异的免疫反应。经复性、肝素亲和层析柱纯化的表达产物对鸡胚尿囊膜血管有明显抑制作用。本研究获得了AS、ES在大肠杆菌中的融合表达．目的蛋白具有特异的免疫反应性和血管抑制活性。     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

HPV16 L1基因的原核表达及免疫反应性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白L1，并鉴定其免疫反应性。方法：将HPV-16L1基因克隆人原核表达载体pThioHisC中，构建重组表达载体。以重组载体分别转化大肠杆菌Top10和DH5α，在IPTG诱导下表达外源基因，用SDS—PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析。结果：构建了HPV—16L1基因的原核表达质粒pThioHisC／HPV—16L1，并在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)约为70800的蛋白。表达的蛋白能与抗HPV—16L1抗体发生特异性反应。结论：在原核细胞中成功地表达HPV—16L1基因，为HPV—16L1疫苗的研制提供了必要的基础。