神经再生素促大鼠背根神经节生长作用的研究

目的研究神经再生素（NRF）对体外培养新生大鼠背根神经节生长及NF—H表达的影响。方法体外大鼠背根神经节（DRG）培养;免疫荧光细胞化学、实时荧光定量PCR和Western blot等方法。结果免疫荧光细胞化学结果提示,NRF能促进背根神经节神经突起的生长,浓度为2．0mg／L时生长状况最佳;实时荧光定量PCR和Western blot结果提示,NRF能增加体外培养的背根神经节NF-H mRNA和蛋白的表达,在浓度为2．0mg／L时表达最高。结论NRF能促进体外培养背根神经节神经突起的生长和NF—H的表达,表明NRF对发育期感觉神经元具有神经营养作用。     

体外获得高纯度大鼠背根神经节神经元的原代培养

目的：建立一种切实可行的胚胎大鼠背根神经节神经元培养及纯化方法。方法：用显微解剖获取足够数量的胚胎大鼠背根神经节,通过胰蛋白酶+EDTA消化、交替使用NB培养基与加入了5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸/尿苷的抗有丝分裂NB培养基等方法,在体外获得纯化的背根神经节神经元,采用神经丝蛋白免疫细胞化学染色法与DAPI染核的方法鉴定并测定神经元的纯度。结果：获得的背根神经节神经元在体外生长良好,纯度可达到96%以上。结论：本实验方法可以获得大量高度纯化的大鼠背根神经节神经元。     

神经生长颗粒含药血清对大鼠背根神经节生长的影响

目的: 研究神经生长颗粒(NGG)含药血清对体外培养新生大鼠背根神经节生长及高分子量神经丝蛋白(NF-H)和生长相关蛋白43(GAP43)表达的影响.方法: 采用体外大鼠背根神经节(DRG)植块培养,通过免疫荧光细胞化学法,观察不同剂量的含药血清对DRG神经突起生长的影响;采用DRG单细胞分离培养,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹法分别观察不同剂量的含药血清对DRG细胞NF-H和GAP43基因及蛋白表达的影响.结果: 免疫荧光细胞化学法提示NGG含药血清能促进DRG神经突起的生长;实时荧光定量PCR和免疫印迹法结果提示NGG含药血清能增加体外培养的DRG细胞NF-H、 GAP43 mRNA和蛋白的表达.结论: NGG含药血清能促进体外培养DRG神经突起的生长并促进NF-H和GAP43的表达,表明NGG对发育期感觉神经元具有一定的神经营养作用.     

肿瘤抑制因子PTEN蛋白在成年大鼠腰段脊髓和背根节中的表达与分布

目的　观察肿瘤抑制因子PTEN蛋白在成年大鼠腰段脊髓和背根节中的表达和分布。　方法　免疫组织化学ABC法显示大鼠脊髓和背根神经节中PTEN阳性免疫反应产物。　结果　背根节神经元及穿越背根节神经纤维轴突有阳性免疫反应产物存在 ;PTEN阳性免疫反应产物在脊髓主要位于灰质神经元。　结论　PTEN在成年大鼠腰段脊髓和背根节神经元及神经纤维轴突中表达。     

神经营养因子-3对大鼠脊髓半横断后背根神经节c-Jun表达的影响

目的：研究神经营养因子-3(NT-3)对脊髓半横断后背根神经节c-Jun表达的影响，探索NT-3促进脊髓修复的作用机制。方法：将实验动物分为：对照组，损伤组和NT-3注射组，应用荧光免疫组化法结合激光扫描共聚焦显微镜，观察各组背根神经节c-Jun的表达，并计数细胞核完整的神经元数目。结果：脊髓损伤后，背根神经节的细胞内c-Jun的表达上调；NT-3注射组脊髓损伤侧背根神经节神经元的c-Jun表达明显上调，背根神经节内细胞核呈完整状态的神经元数量明显增多。结论：(1)c-Jun在轴突损伤后表达上调。(2)NT-3对轴突损伤后的神经元有保护作用。(3)NT-3可能通过使c-Jun表达上调而发挥其促神经再生作用。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰后间充质干细胞的生长与分化

背景：近年来,研究表明外源性神经营养因子或化学诱导剂可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化,但外源性诱导剂诱导作用短暂且化学性物质不可避免的对细胞活力造成负面影响,一定程度上限制了骨髓间充质干细胞的基础研究与临床应用空间。 目的：以载胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因重组腺病毒(Ad-rGDNF-GFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞,观察目的基因在靶细胞内的表达、对细胞的营养作用及对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响。 方法：转染组中以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞,感染复数分别为10,50,80,100,150,200;对照组加入等量的培养液作为对照。转染后12 h,倒置荧光显微镜观察2组中绿色荧光蛋白的表达情况;转染后72 h,流式细胞仪测定转染组中转染效率;MTT法测定2组中细胞活力;转染后5,10 d,PCR检测转染组中胶质细胞源性神经营养因子mRNA的表达;转染后5 d免疫荧光鉴定2组中神经元烯醇化酶的表达情况,转染后10 d鉴定微管相关蛋白2的表达。 结果与结论：转染后12 h,细胞中可观察到绿色荧光蛋白的表达,随时间延长荧光强度逐渐加强。以感染复数=100时绿色荧光蛋白的表达强度、稳定性较好,转染后3 d,转染效率近90%;转染后转染组细胞活力增加;转染5 d后,骨髓间充质干细胞表达神经元烯醇化酶,细胞伸出神经样细胞突起;转染10 d后,胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达显著增强,骨髓间充质干细胞表达神微管相关蛋白2,细胞突触样结构明显且相互连接成网,呈现典型神经样细胞形态。说明以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞,感染复数=100时,可获得较高的转染效率,胶质细胞源性神经营养因子表达后明显提高了骨髓间充质干细胞活力,并诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞定向分化。     

退变和健康椎间盘组织提取细胞外基质诱导背根神经节轴突生长的差异

背景:研究发现,在退变的椎间盘组织中神经纤维的密度明显高于正常椎间盘,神经末梢和神经肽的出现远远多于正常数量。而正常生理老化的椎间盘并没有这种现象发生。目的:评估人痛性椎间盘细胞外基质对小鼠背根神经节神经轴突生长所产生的促进作用和神经肽P物质的诱导作用。方法:获取椎间盘源性下腰痛患者的椎间盘组织(退变组),以及正常人腰椎间盘组织(正常组),提取细胞基质,对大鼠背根神经节神经元进行培养,通过形态学观察神经元轴突生长和酶联免疫吸附法检测P物质含量。结果与结论:退变组神经生长因子浓度显著高于正常组;退变组神经元轴突平均长度明显高于正常组(P0.05),两组加入抗神经生长因子β干预后神经元轴突平均长度均明显短于未干预组;在退变组椎间盘组织培养液中P物质比率明显高于正常组(P0.001)。提示人退变椎间盘细胞外基质中高表达的神经生长因子能促进感觉神经轴突的生长以及诱导和疼痛相关神经肽的释放。     

P38/caspase-3介导的MEF2C信号通路参与大鼠脑缺血再灌注损伤

目的观察大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区肌细胞促进因子(MEF)2C磷酸化(激活)和蛋白水平的变化规律,并探讨其可能的分子机制。方法采用SD大鼠四动脉结扎模型,用免疫印迹法检测蛋白表达,给药组大鼠在缺血前20min脑室给药。结果脑缺血再灌注可诱导MEF2C激活,6h达高峰;其蛋白表达在再灌后期(3～5d)明显下降。Caspase-3蛋白和激活的caspase-3(17ku)水平在再灌后期均显著增加;Caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO可明显阻止再灌3d的MEF2C蛋白表达降低。P38激酶抑制剂SB202190不但抑制再灌注6h的MEF2C激活,而且也降低了再灌注3d的caspase-3激活;但胞外信号调节激酶(ERK)5的反义寡核苷酸未显著影响MEF2C的磷酸化水平。结论P38/caspase-3依赖的MEF2C信号通路可能参与了大鼠脑缺血再灌注诱发的神经元凋亡过程。     

大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子真核表达载体的构建及其体外表达的鉴定

背景：星形胶质细胞被激活后表现出神经干细胞的特性,细胞表面的神经营养因子(表皮生长因子、睫状神经营养因子)受体超表达,通过改善复杂的内环境,有利于定向诱导神经干细胞向神经元的分化。 目的：构建大鼠pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达质粒,检测其在cos-7细胞中的共表达。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术从大鼠颌下腺、坐骨神经组织总RNA中扩增出表皮生长因子、睫状神经营养因子基因功能区,将上述基因片段分别连接到真核表达载体pSecTag2/Hygro B,聚合酶链反应初步筛选、双酶切鉴定后送测序。将构建成功的两种重组载体单独及共转染cos-7细胞,Western blot法鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白的瞬时表达。 结果与结论：反转录-聚合酶链反应结果证实成功获得大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子cDNA。DNA序列分析证实2种真核表达载体中的表皮生长因子、睫状神经营养因子序列与GenBank中目的序列一致。脂质体介导转染cos-7细胞48 h后,Western blot鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白在cos-7细胞中的表达,分别在Mr6 000,22 000处出现阳性条带。提示大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF构建成功,共转染cos-7细胞后能够共表达重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白。     

星形胶质细胞和神经生长因子对新生大鼠脑内P物质受体阳性神经元存活与突起生长的影响──体外培养研究

本实验用无血清培养进行神经元与星形胶质细胞的联合培养，观察了星形胶质细胞和神经生长因子对新生大鼠基底神经节和下位脑干内的P物质受体阳性神经元存活与生长的影响。结果表明：（1）含神经生长因子的NeurobasalMedium／N2supplement（N／N2）能支持新生鼠脑神经元的存活和神经元突起的生长，其效果与加血清的Dulbacco改良Eagle培养基（s－DMEM）相似；（2）利用星形胶质细胞作为滋养细胞，种植新生鼠基底神经节和下位脑干细胞于其上，可见星形胶质细胞对神经元的突起生长（生长锥）有明显的促进作用，其中基底神经节神经元神经突的生长优于下位脑干神经元；（3）免疫组织化学反应结果显示，来源于基底神经节的培养神经元有87％为P物质受体阳性神经元，而下位脑干为84％，P物质受体阳性神经元的胞体形态完整，突起生长良好。本实验表明含神经生长因子的N／N2Medium或s－DMEM可作为P物质受体神经元体外培养的培养基，星形胶质细胞可在一定程度上支持新生大鼠脑P物质受体神经元的存活与突起生长，并可保持其分化特性。     

部分背根切断对备用DRG神经元和胶质细胞NGF表达上调的影响

本研究目的在于探讨部分背根切断后备用背根节(DRG)中各类细胞NGF及其mRNA的量变状况。将成年雄猫10只分为正常组、单侧部分背根切断后7天组等2组,每组5只。实验组切除一侧L1～L5,L7～S2 DRG,保留L6 DRG为备用根。取正常组一侧和术后7天组手术侧的L6 DRG制成20μm厚冰冻纵切片,分别用NGF抗体及其cRNA探针进行免疫组织化学及原位杂交反应。观察NGF及其mRNA在DRG各类细胞的分布,测定NGF及其mRNA的光密度值以反映其相对含量。结果表明,在正常组,L6DRG中仅存在少量的NGF及其mRNA阳性神经元,此外,一些胶质细胞也呈阳性反应。在手术组,各类神经元及胶质细胞内NGF及其mRNA的光密度值较正常者显著升高(P<0.05)。结论:部分背根切断导致备用DRG神经元和非神经元表达NGF增多,提示NGF可能有利于促进备用背根生芽。     

二脱氧肌苷引发培养的背根神经节神经元的形态学改变(英文)

为探讨二脱氧肌苷(ddI)对培养的背根神经节(DRG)神经元的影响,我们对分散培养的胎鼠DRG神经元培养3d后,再分别以不同浓度的ddI(1μg/ml,5μg/ml,10μg/mll和20μg/ml)孵育3d。终止培养后,行微管相关蛋白2(MAP2)标记,用共聚焦激光扫描显微镜观察神经元胞体和突起的改变。结果表明,DRG神经元用ddI孵育3d,神经元突起的数目减少和长度变短,呈剂量依赖性,而神经元的直径则没有变化。本研究的结果表明,ddI可影响培养的DRG神经元突起的再生和生长。     

胶质细胞源性神经营养因子对培养的背根神经节的影响

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在体外促进正常胚胎大鼠背根神经节(DRGn)的存活及突起生长情况。方法 用原代分离培养法建立体外胚胎大鼠背根神经节单细胞培养体系，通过活体观察、MTT微量比色法、NSE免疫组织化学染色观察不同浓度GDNF对体外培养的正常感觉神经元的影响。结果 GDNF组培养的DRG神经元存活数量增加，神经元突起的长度比对照组明显增长。结论 GDNF能明显促进体外培养的正常大鼠胚胎背根神经节感觉神经元的存活及突起生长，表明GDNF对正常大鼠胚胎发育期感觉神经元具有神经营养作用。     

Resveratrol inhibits angiotensin II-induced ERK1/2 activation by downregulating quinone reductase 2 in rat vascular smooth muscle cells

Our previous studies showed that resveratrol could inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and repress mRNA and protein expression of quinone reductase 2 (NQO2).This study further explored the potential mechanisms whereby resveratrol inhibits the proliferation of rat VSMCs.Lentiviral vectors that incorporated NQO2 small interfering RNA (siRNA) were constructed and transduced into rat VSMCs.The cell proliferation was detected using the bromodeoxyuridine (BrdU) assay.Cultured rat VSMCs were stimulated with angiotensin II and the level of reactive oxygen species (ROS) was measured using a ROS assay kit.A realtime quantitative PCR was used to detect NQO2 mRNA levels.Extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) and NQO2 protein expression were determined by Western blotting analysis.The inhibitory effect of resveratrol (10 and 50 μmol/L) on the proliferation of rat VSMCs in the NQO2 siRNA group was significantly weaker than that in the normal and scrambled siRNA group (P < 0.01).The ROS level in the NQO2 siRNA and resveratrol (50 μmol/L) treatment groups were lower than that in the normal and scrambled siRNA groups (P < 0.01 in both).Compared with the normal and scrambled siRNA group,the phosphorylation of ERK1/2 was significantly decreased in the NQO2 siRNA and resveratrol (50 μmol/L) treatment group (P < 0.01 in both).In conclusion,high concentration of resveratrol inhibits angiotensin II-induced ERK1/2 phosphorylation and subsequent proliferation by down-regulation of NQO2 in cultured rat VSMCs.     

Reg-2 expression in dorsal root ganglion neurons after adjuvant-induced monoarthritis

Reg-2 is a secreted protein that is expressed de novo in motoneurons, sympathetic neurons, and dorsal root ganglion (DRG) neurons after nerve injury and which can act as a Schwann cell mitogen. We now show that Reg-2 is also upregulated by DRG neurons in inflammation with a very unusual expression pattern. In a rat model of monoarthritis, Reg-2 immunoreactivity was detected in DRG neurons at 1 day, peaked at 3 days (in 11.6% of DRG neurons), and was still present at 10 days (in 5%). Expression was almost exclusively in the population of DRG neurons that expresses the purinoceptor P2X(3) and binding sites for the lectin Griffonia simplicifolia IB4, and which is known to respond to glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). Immunoreactivity was present in DRG cell bodies and central terminals in the dorsal horn of the spinal cord. In contrast, very little expression was seen in the nerve growth factor (NGF) responsive and substance P expressing population. However intrathecal delivery of GDNF did not induce Reg-2 expression, but leukemia inhibitory factor (LIF) had a dramatic effect, inducing Reg-2 immunoreactivity in 39% of DRG neurons and 62% of P2X(3) cells. Changes in inflammation have previously been observed predominantly in the neuropeptide expressing, NGF responsive, DRG neurons. Our results show that changes also take place in the IB4 population, possibly driven by members of the LIF family of neuropoietic cytokines. In addition, the presence of Reg-2 in central axon terminals implicates Reg-2 as a possible modulator of second order dorsal horn cells.     

Functional role of prostacyclin receptor in rat dorsal root ganglion neurons

Recent studies on prostanoids showed that some of prostanoid receptors are expressed in rat dorsal root ganglion (DRG) neurons. These facts suggest that prostanoid receptors might be involved in the excitation mechanism of DRG neurons. In the present study, PCR experiments revealed that one of prostanoid receptor, prostacyclin receptor (IP receptor) was expressed in L6 and S1 rat DRG neurons and that the expression of IP receptor was not changed in DRG neurons obtained from the cyclophosphamide (CYP)-induced cystitis rat. We examined the functional role of IP receptor agonist and other prostanoids by measuring cyclic AMP (cAMP) accumulation and substance P (SP) release in primary cultured DRG neurons. The pretreatment of DRG neurons with prostanoid agonists such as iloprost (IP), butaprost (EP(2)), misoprostol (EP(2-4)), PGE(2) (EP(1-4)) or PGD(2) (DP and CRTH2) sensitized the DRG neurons and hence potentiated the lys-bradykinin-induced SP release. The increase of SP release by lys-BK plus prostanoid agonists was proportion to cAMP accumulation. Iloprost was the most potent agonist to induce cAMP accumulation and SP release among prostanoid agonists evaluated in this study and its effect is mediated by IP receptor. Moreover, capsaicin-, ATP- and KCl-induced SP release was also enhanced by iloprost although iloprost did not change intracellular Ca(2+) and membrane depolarization induced by these chemical stimuli. These results strongly indicate that IP receptor play an important role in the sensitization of rat sensory neuron.     

针刺对备用DRG的NGF及其mRNA阳性大、中、小神经元数量的影响

本研究观察了 NGF及其 m RNA阳性神经元在 DRG大、中、小神经元中的数量变化 ,目的在于探讨 DRG各类神经元NGF变化与针刺促进脊髓可塑性的关系。对 5只成年猫进行双侧备用根手术。术后当日开始针刺一侧 L6 脊神经后肢分布区的两组穴位即足三里和悬中、伏兔和三阴交 ,每天一次 ,每次 3 0 min,连续针刺 7d后处死动物。取针刺侧与非针刺侧 L6 的 DRG制成 2 0μm厚冰冻纵切片。分别用 NGF抗血清和 NGF的 c RNA探针进行免疫组织化学反应及原位杂交染色。计数两侧 DRG相同面积内大 (>5 7μm)、中 (4 2～ 5 7μm)、小 (<42 μm)型 NGF及其 m RNA阳性神经元的数量。结果显示 :针刺侧备用 DRG NGF及其 m RNA阳性大、小型神经元的数量明显增加 (P<0 .0 5 ) ,而对中型神经元数量影响不明显。结论 :针刺促进脊髓可塑性可能与备用 DRG大、小神经元表达 NGF增多有关。     

NGF,BDNF,NT-3和GDNF在背根节不同神经元的配布的免疫组织化学证据

为了探讨神经生长因子、脑源性神经生长因子 ,神经营养素 -3,胶原细胞源性神经生长因子在成年猫背根节神经元不同大小细胞的分布。取 L6背根节制成 2 0μm厚冰冻切片 ,用上述四种因子抗血清进行免疫组化反应。计数每一种因子阳性大、中、小型 (小于 42μm者为小型神经元 ;42～ 5 7μm者为中型神经元 ;大于 5 7μm者为大型神经元 )神经元的百分数。结果证明 ,此四种因子在背根节大、中、小神经元的阳性百分数分别为 :1.2± 0 .7,2 .1± 0 .9,3.3± 1.1;1.7± 0 .4,11.2± 1.2 ,30 .0± 1.5 ;2 6 .7± 2 .2 ,6 .2± 1.2 ,13.2± 2 .9;2 7.4± 3.3,8.1± 1.7,2 0 .1± 2 .4。表明 :在成年猫 L6背根节仅存在少数神经生长因子阳性细胞 ,而脑源性神经生长因子则主要配布于中、小神经元 ,神经营养素 -3和胶质细胞源性生长因子的免疫阳性细胞主要是大神经元 ,但也包括一些中小神经元。提示此四种因子在成年猫背根节的生理功能可能与神经元的不同大小有关。     

Increase in spontaneous action potentials and sensitivity in response to norepinephrine in dorsal root ganglion neurons of adjuvant inflamed rats

To gain an understanding of the cellular mechanisms of hyperalgesia and spontaneous pain in adjuvant-induced chronic inflammation, we investigated the effects of nerve growth factor (NGF), which is known to increase in inflamed tissues and to cause hyperalgesia, on the spontaneous activities and norepinephrine-induced excitation of dorsal root ganglion (DRG) neurons. Intracellular recordings were obtained from freshly dissociated and cultured DRG neurons (<30 microm) from intact and adjuvant inflamed (AI) rats. Of more than 100 freshly dissociated DRG neurons from the intact rats, none produced spontaneous action potentials, whereas 23% of the neurons from the AI rats did. Spontaneous activities were induced in 34% neurons from intact rats when cultivated for one day with NGF. No neurons from the intact rats responded to norepinephrine (NE), irrespective of whether they were freshly dissociated or cultured with NGF. In contrast, 11% of neurons from the AI rats, both freshly dissociated and cultured without NGF, had a small depolarization in response to NE. The present results suggest that, in AI rats NGF plays an important role in inducing spontaneous activities in DRG neurons, but not in inducing sensitivity to NE.     

瘦素对体外培养大鼠背根神经节神经元中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

目的:研究瘦素对大鼠背根神经节(DRG)神经元中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.方法:用不同浓度(1、 10和100nmol/L)的瘦素处理体外培养大鼠DRG神经元;采用免疫印迹技术,检测神经元中Bcl-2和Bax蛋白的表达变化.结果:10和100nmol/L的瘦素能促进DRG神经元中Bcl-2蛋白的表达;瘦素对Bax蛋白表达没有影响.结论:瘦素能促进DRG神经元中Bcl-2蛋白的表达,提示瘦素可通过提高Bcl-2蛋白表达来抑制Bax的促凋亡作用,从而改善DRG神经元的存活.这对进一步研究瘦素对DRG功能调节具有重要的意义.