p53病毒增强型质粒在血管平滑肌细胞中的表达

目的研究腺相关病毒增强型质粒载体介导的P~（53）基因在血管平滑肌细胞中的表达。方法构建带有野生型P~（53）基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体，通过阳离子脂质体介导，转染血管平滑肌细胞。PCR检测外源基因整合，RT－PCR分析外源基因mRNA的表达，免疫组织化学检测基因表达产物。结果P~（53）基因转染血管子滑叽细胞表达相应的mRNA和蛋白质。结论血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的靶细胞．所构建的P~（53）腺相关病毒增强型质粒可作为基因治疗的载体。     

p53病毒增强型质粒-脂质复合物对移植静脉新内膜增生的影响

目的　为了预防冠状动脉旁路术后移植血管再狭窄,观察外源性ｐ５３ 基因对移植静脉新内膜增生的影响。方法　阳离子脂质体介导ｐ５３ 腺相关病毒增强型质粒表达载体,腔内加压灌注转染移植静脉。ＲＴＰＣＲ 和免疫组化检测外源基因在移植血管中的表达,病理形态学检测实验血管新内膜增生改变。结果　外源性ｐ５３ 基因在移植血管中表达出相应的ｍ ＲＮＡ及ｐ５３ 蛋白;组织学检查显示基因治疗组新内膜厚度为（５２±７） μｍ ,空载体组为（７８ ±５） μｍ ,差异有显著性（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。结论　外源性ｐ５３ 基因对动脉旁路术后移植静脉新内膜增生有明显的抑制作用。     

肝癌特异性p53基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建一种肝癌细胞靶向性的腺相关病毒载体以用于肝癌的促凋亡基因治疗的研究。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物,选择地从人基因组中出入甲胎蛋白（α－fe-toprotein,AFP）启动子序列并克隆以真核表达载体pTR－UF5上;再通过平端连接的方法,构建成含甲胎蛋白启动子和人野生型p53基因的重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）质粒rAAV－AFP－53和绿色荧光蛋白基因GFP（green fluorescence protein）的质粒rAAV－AFP－GFP。结果 成功地构建了以腺相关病毒为载体、受人甲胎蛋白启动子调控表达人野生型p53基因的质粒系统。结论 从理论上说,我们构建的重组腺相关病毒质粒rAAV－AFP－p53,可以特异性地转染到肝癌细胞中从而为肝癌基因治疗提供一种有效手段。     

脂质体与腺病毒转染EDRz抑制自体移植静脉内膜增生的比较研究

目的探讨以脂质体和腺病毒为载体,早期生长反应基因-1 DNA酶(Egr-1 DNA enzyme,EDRz)局部外用对自体移植静脉血管平滑肌(VSMC)增殖和内膜增生的抑制作用。方法大鼠建立自体静脉移植模型后随机分为脂质体组、腺病毒组和对照组,两实验组分别用脂质体-EDRz和腺病毒-EDRz涂抹移植静脉行在体转染。于术后1,2,6,24 h及3,7,14,28 d取材,荧光显微镜检测移植静脉的转染情况;采用原位杂交方法检测Egr-1 mRNA的表达;用免疫组织化学方法检测Egr-1蛋白表达,同时进行组织形态学观察。结果术后1 h,EDRz主要位于移植静脉的外膜、中膜和部分内皮细胞。脂质体组荧光灰度值为70.3±13.5,腺病毒组荧光灰度值为60.5±11.2。术后2～24 h,EDRz主要位于移植静脉的中膜;移植7 d,EDRz主要位于移植静脉的内膜。移植早期Egr-1蛋白表达主要位于中膜的血管平滑肌细胞(VSMC)和部分单核细胞、内皮细胞;移植后期未检测到Egr-1 DNA酶的表达。移植后期在中膜和新生内膜的VSMC均未检测到Egr-1蛋白的表达。移植2 h阳性表达率,脂质体组为(15.3±4.2)%,腺病...     

人arresten基因转染对自体移植静脉内膜增生的影响

目的:探讨体内转染arresten基因对自体移植静脉内膜增生的影响。方法:建立大鼠自体静脉移植模型。血管吻合术前，用脂质体介导重组质粒pSecTag2-AT（Ⅰ组），空载体pSecTag2转染（Ⅱ组）移植血管，等体积脂质体溶液处理移植血管(空白对照组，Ⅲ组）。各组动物均于4周后切取移植血管，RT-PCR检测移植血管中arresten mRNA的表达；常规HE，Verhoeff弹力纤维染色；计算机图象分析检测移植静脉血管内膜及中膜面积、厚度；免疫组化检测移植血管内膜α-SMA及PCNA的表达；Western blot检测TGF-β1蛋白的表达。结果:Ⅰ组转染的移植静脉中有目的基因mRNA的表达, 而Ⅱ、Ⅲ组无Ⅰ组内膜、中膜面积小均于Ⅱ组和Ⅲ组，差异有显著性（P<0.05）。而内膜面积/中膜面积3组间无统计学差异（P>0.05）；Ⅰ组内膜厚度小于Ⅱ组和Ⅲ组，组间比较有统计学差异（P<0.01）；α-SMA染色表明增生内膜中的细胞是血管平滑肌细胞；PCNA阳性细胞数及表达指数Ⅰ组均低于Ⅱ组和Ⅲ组（P<0.05）；Ⅰ组TGF-β1蛋白的表达明显低于Ⅱ组和Ⅲ组。结论:移植血管转染arresten基因，可有效抑制自体移植静脉内膜的增生，在防治血管移植术后再狭窄方面显示出良好的临床应用前景。     

p27kip1基因表达对大鼠移植静脉内膜平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的观察以聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）纳米粒子为载体的人p27^kip1基因局部转染自体移植静脉后，对大鼠静脉内膜平滑肌细胞增殖及凋亡的影响。方法Wistar大鼠120只建立自体静脉移植模型，随机分成3组。转基因组：移植静脉转染以PLGA纳米粒子为载体的p27^kip1基因；空白对照组：转染不含有p27^kip1基因的单纯PLGA纳米粒子；单纯静脉移植组：使用生理盐水。分别于术后3、7、14、28d取材，常规HE、Verhoeff弹力纤维染色，Western blot检测p27^kip1蛋白的表达，免疫组化（SABC）法检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达、TUNEL法观察内膜平滑肌细胞凋亡的动态变化。结果转基因组内膜中p27^kip1蛋白表达水平高于其他组；内膜平均厚度7、14、28d低于其他2组（P〈0．01）；转基因组内膜PCNA的表达7、14d明显受到抑制（P〈0．01），平滑肌细胞的凋亡细胞百分比于7、14d较对照组明显增加（P〈0．01），单纯静脉移植组与空白对照组之间各项监测指标差异无统计学意义。结论p27^kip1基因的过表达能够有效抑制自体静脉移植后的内膜增生（IH），促进平滑肌细胞的凋亡。     

外源性p16基因对食管癌患者癌细胞系的生长抑制作用

目的 观察外源性p16基因质粒导入食管癌患者食管鳞癌细胞系Ec109后的表达及其对Ec109细胞增殖生长状况的影响。方法 根据转染质粒的不同或是否行p16 cDNA质粒转染分为三组,每组分别为5个样本。PcDNA3-P16转染组（P16转染组）：采用脂质体（Lipofectamine）为载体,将PcDNA3-P16表达质粒寻入Ec109细胞;空载体转染组：用PcDNA－3－neo空载体以上述相同方法转染,作空白对照;未转染组：未用PcDNA3－P16质粒转染,作阴性对照。应用Northern斑点杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测转化细胞的P16蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,DNA片段化电泳检测细胞凋亡。结果 P16转染组外源性p16基因在Ec109细胞中表达后,细胞生长速度减慢,克隆形成能力下降,瞬时表达时有细胞凋亡发生,稳定表达后细胞存在G1期阻滞;空载体转染组和未转染组均未观察到以上结果。结论 脂质体介导的外源性p16基因转染对Ec109细胞有生长抑制作用,p16基因瞬时表达可诱导细胞凋亡。     

p38 MAPK在自体移植静脉中的表达及其意义

目的　研究丝裂原活化蛋白激酶p3 8MAPK信号传导通路在自体移植静脉中的表达。方法　Wistar大鼠 80只 ,建立自体移植静脉模型。术后随机分为 6,2 4h ,3 ,7d和 2 ,4,6,8周等 8组 ,于相应时点取材 ,半定量逆转录PCR检测移植血管中p3 8MAPK的mRNA表达 ,Western蛋白印迹定量检测 p3 8的蛋白产物及磷酸化蛋白产物表达 ,原位杂交和免疫组化方法定位p3 8mRNA及蛋白表达。结果　移植静脉术后 6hp3 8的mRNA表达即较正常静脉明显增强 (P <0 .0 1) ,并于术后 2周达高峰 ,表达值为 (59± 2 6) % ,与 4,6,8周比较差异极显著 (P <0 .0 1)。Western蛋白印迹提示 p3 8在移植 2～ 4周达高峰 ,之后开始减少 ,8周时仍维持一定表达量 (1/4～ 1/2 )。原位杂交及免疫组化提示阳性表达多定位于移植血管中层或增生内膜中的血管平滑肌细胞 (VSMCs)。结论　p3 8MAPK通路的激活参与了移植静脉的内膜增生以及血管重塑 ,可望成为防治移植静脉狭窄闭塞的治疗靶点     

重组腺相关病毒介导抑癌基因联合诱导人肝癌细胞系凋亡与生长抑制研究

目的 观察腺相关病毒介导的抑癌基因p53,p16和p21联合治疗肝癌的可能性和效果。方法 用携带人野生型p53,p16和p21的腺相关病毒分别或联合转导人肝癌细胞系HLE，HepG2,QGY-7701,QGY-7703,BEL-7402,SMMC-7721，通过体外及裸鼠体内实验研究转基因的表达及对癌的促凋亡和生长抑制作用。结果 腺相关病毒介导的p53,p16及p21对人肝细胞肝癌细胞系均有明显的促凋亡作用，体外凋亡率约30％左右，体内生长抑制率30％－44％；联合感染肝癌细胞效果更明显，体外凋亡率达56％，体内癌生长抑制率65％。结论 腺相关病毒介导的外源抑癌基因p53，p16和p21不仅对多种肝癌细胞系均有诱导凋亡和抑制生长作用，联合应用治疗肝癌更具有明显的相互协同作用。进一步提高病毒滴度和纯度是腺相关病毒作为载体进行基因治疗的目标。     

转化生长因子β1基因转染兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞及其表达

目的 构建TGF-β1基因的重组腺相关病毒载体并将其转入兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞(SMSCs)中,对转染后外源性TGF-β1 mRNA和蛋白的表达进行检测.方法 含TGF-β1全长cDNA的质粒pCMV6-XL4和质粒pAAV-MCS用EcoR Ⅰ+Xba Ⅰ进行双酶切后连接,转化大肠杆菌DHSα感受态细胞,获得重组质粒pAAV-MCS-TGF-β1.通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性.采用磷酸钙共沉淀法,以重组质粒pAAV-MCS-TGF-β1和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒;斑点杂交方法检测重组病毒的滴度,并转染体外培养的SMSCs.以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测目的 基因及蛋白的表达.结果 成功地构建TGF-β1基因腺相关病毒重组质粒,病毒滴度约为3.6×1013vp/ml,感染的SMSCs能稳定、高效地表达外源性目的 基因及蛋白.结论 重组腺相关病毒载体rAAV-TGF-β1能有效感染SMSCs并表达目的基因.