两种粒径量子点在人舌鳞癌细胞中双色荧光成像的应用研究

目的 研究粒径655 nm和525nm的两种量子点(quantum dots,QDs)对人舌癌Tca8113细胞内2种热休克蛋白( heat shock protein,HSP)进行特异性荧光标记的成像效果和稳定性,为今后的连续动态观察提供实验依据.方法利用QD655nm和QD525nm,对人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白进行特异性双重荧光标记,激光连续照射2420391 ms,在共聚焦显微镜下同时观测人舌癌Tca8113细胞内的HSP90蛋白和HSP70蛋白表达及分布,用软件Leica Confocal Software测量量子点QD655nm和QD525nm的荧光信号强度变化.结果 激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白均有明显表达,分别表现为红色和绿色荧光,两种蛋白重叠处呈黄色荧光,在激光连续照射中,两种荧光有所衰减,其中QD655nm的荧光强度值下降相对较快、幅度相对较大.结论 量子点荧光标记技术能同时对人舌鳞癌细胞中HSP90蛋白和HSP70蛋白进行双重标记,而且QD655nm与QD525nm都具有较强的光稳定性,均可用于蛋白的长时间动态监测,其中QD525nm的稳定性更好.     

体外RNA干扰RhoA基因对舌癌细胞侵袭的影响

目的 应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113和SCC-4中RhoA基因的表达,探讨RhoA基因表达下调对舌癌细胞侵袭的影响。方法登录Genbank数据库确定人RhoA基因序列,针对RhoA的基因序列设计短链RNA,利用Lipofectamine2000介导法将RhoA-siRNA转染至舌癌Tca8113和SCC-4细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测转染后的舌癌细胞中RhoA mRNA的表达,蛋白质印迹法检测RhoA、半乳糖凝集素-3（galectin-3）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果舌癌细胞转染RhoA-siRNA后,RhoA的基因和蛋白表达下降,galectin-3和MMP-9蛋白表达下降,细胞体外侵袭能力降低。结论RhoA-siRNA可以有效地抑制舌癌Tca8113和SCC-4细胞中RhoA的表达,通过降低galectin-3和MMP-9的表达从而降低细胞的侵袭能力。RhoA在舌癌的侵袭和转移中可能发挥重要的作用。     

CD133在口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的探究肿瘤干细胞标记物CD133在口腔正常黏膜、口腔扁平苔藓（OLP）及口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的表达情况及临床意义,评估其作为OLP恶性转化的早期诊断指标、OSCC治疗干预靶标的临床价值,为进一步研究口腔黏膜癌变机制提供基础。 方法回顾性分析10例正常口腔黏膜、60例OLP、60例OSCC患者的临床资料,运用免疫组织化学技术检测各组病理组织中CD133表达情况,采用Mann-Whiney秩和检验比较各组间CD133表达差异,卡方检验统计分析CD133与各临床因素的关系。采用免疫组织化学技术和免疫印迹技术检测人口腔癌前病变细胞株（DOK）和人OSCC细胞株（CAL-27）中CD133的表达情况,t检验比较CD133在DOK与CAL-27细胞株中含量差异。 结果口腔正常黏膜、OLP、OSCC三组中,CD133的阳性率为0（0/10）、31.67%（19/60）、63.33%（38/60）,表达逐渐增强。CD133在口腔正常黏膜与OLP表达强度差异有统计学意义（Z=-2.046,P= 0.041）。CD133在OLP与OSCC表达强度差异具有统计学意义（Z=-3.777,P<0.001）。CD133在DOK中弱阳性表达,在CAL-27中阳性表达,DOK与CAL-27中CD133含量差异有统计学意义（t=-5.029,P= 0.001）CD133与OSCC的临床分期和淋巴结转移有关。 结论CD133作为评估OLP恶性转化潜能的指标及OSCC早期治疗干预靶标可能具有重要临床价值。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对舌癌细胞株SCC-4细胞RECK基因甲基化水平及侵袭的影响

目的 探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷5-aza-2-deoxycytidine (5-aza-Dc) 对舌癌细胞株SCC-4中抑癌基因RECK基因甲基化水平及侵袭能力的影响。方法 用不同浓度的5-aza-Dc处理舌癌细胞株SCC-4,72 h后,以甲基化特异性PCR（MSP）检测SCC-4细胞RECK基因的甲基化状态,实时定量 PCR技术检测SCC-4细胞RECK基因mRNA的表达,Western 印迹检测蛋白质表达,Transwell体外侵袭实验检测侵袭能力。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果 MSP检测未处理组细胞RECK基因呈高甲基化状态,经5-aza-dC处理后甲基化得到逆转。实时定量 PCR检测显示,不同浓度5-aza-dC处理SCC-4细胞72 h后, 相对mRNA表达随着药物浓度增加而增加(P<0.05)。Western 印记分析结果显示,不同浓度5-aza-dC组的RECK蛋白表达相对水平随药物浓度增加而增加,SCC-4细胞的侵袭力随药物浓度增加而降低。结论 5-aza-dC可逆转舌癌SCC-4细胞中RECK基因的高甲基化状态,并恢复RECK基因mRNA及蛋白的表达,降低其体外侵袭能力。     

低氧诱导下舌鳞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF的表达及TSA对其表达的抑制

目的:观察低氧与人舌鳞状细胞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF表达的相关性,曲古抑菌素A(TSA)对其表达的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:体外培养的舌鳞状细胞癌SCC-6细胞,经不同作用时间去铁胺处理,模拟低氧条件培养后,RT-PCR检测HIF-1α、VEGF的mRNA表达,Western Blot检测其蛋白表达;模拟低氧条件下,不同浓度、时间梯度TSA处理SCC-6细胞后,分别检测HIF-1α、VEGF的mRNA及蛋白表达。结果:①低氧下SCC-6细胞HIF-1α蛋白表达增加,但其mRNA的表达不受影响;作为HIF-1α下游基因的VEGF的mRNA和蛋白表达,随HIF-1α蛋白表达增加而增加;②低氧下,TSA可抑制HIF-1α的蛋白表达及VEGF的mRNA和蛋白表达,并呈量效和时效关系,但HIF-1α的mRNA表达不受影响;③HIF-1α的调节在蛋白水平。结论:体外条件下,模拟低氧可诱导舌鳞状细胞癌SCC-6细胞中HIF-1α蛋白、其下游基因VEGF的mRNA和蛋白的表达增加。TSA可抑制HIF-1α的蛋白表达,进而抑制其下游基因VEGF的表达,从而发挥抗肿瘤血管生成的作用,并且呈量效和时效关系。     

热休克蛋白在白细胞介素-1β诱导人牙龈成纤维细胞损伤中的表达

目的：观察热休克蛋白（HSP）27、70和90在白细胞介素（IL）-1β诱导的人牙龈成纤维细胞（HGF）损伤过程中的表达。方法???原代培养人HGF，以蛋白质印迹技术检测不同质量浓度的IL-1β诱导后HSP27、HSP70、HSP90在HGF中的表达，运用细胞划痕实验观察HGF的体外迁移能力变化。结果???经IL-1β诱导后，HGF中HSP70和HSP90的表达量无明显变化，HSP27的表达量明显上调并随IL-1β诱导质量浓度的增加而增加。同时细胞划痕实验显示，随着HSP27表达量的增加，HGF的迁移能力明显降低。结论HSP在经IL-1β诱导的人HGF损伤过程中的表达情况各不相同，其中HSP27在IL-1β诱导的HGF炎症损伤中的表达升高，其表达量与HGF体外愈合能力呈负相关关系。HSP27在上皮炎症损伤中起着关键性的作用，但具体作用机制还有待进一步的研究。     

Notch信号通路分子在舌鳞癌中的表达及意义

目的 明确Notch信号通路受体Notch1、Notch3及其配体Jagged1、Jagged2在舌鳞癌中的表达及其意义。方法 通过逆转录聚合酶链反应、免疫组织化学和Western blot检测74例舌癌患者的组织标本（舌癌及癌旁组织）和人舌癌Cal-27细胞株中Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2 mRNA与蛋白质的表达水平,分析其与细胞增殖及临床病理的关系。结果 舌癌、癌旁组织及Cal-27细胞株中均检测到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA和蛋白质的表达。Notch1和Notch3蛋白在舌癌中的表达率高于癌旁组织,而Jagged1和Jagged2蛋白在舌癌和癌旁组织中的表达率无明显差异。Notch1和Notch3蛋白的表达和舌癌的临床分期具有相关性。4种信号蛋白的表达与患者的年龄、性别和临床病理分级无相关性。Notch3和Jagged2的表达具有相关性。Notch1蛋白在淋巴结转移阳性病例中的表达率高于转移阴性的病例,Jagged1在转移阳性病例的表达分级高于阴性病例。结论 Notch信号通路分子在舌鳞癌中表达活跃,与舌癌的发生发展有重要的相关性。     

Naa10基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对口腔鳞癌细胞生长的影响

目的:构建人N-α-乙酰基转移酶10(N-α-acetyltransferase 10, Naa10)基因有效的慢病毒RNAi载体并转染人口腔鳞癌细胞SCC-15,研究其对口腔鳞癌细胞生长的影响。方法:根据人Naa10基因mRNA序列设计合成3个siRNA片段,转染人口腔鳞癌SCC-15细胞株并进行验证,将最有效的干扰序列克隆至pLV-shRNA载体上,测序正确后进行包装,测定病毒颗粒滴度后,将慢病毒感染SCC-15细胞以测定Naa10的表达情况,并通过生长曲线研究干扰Naa10对SCC-15细胞生长的影响。结果:3个靶点的siNaa10 均能有效抑制Naa10基因的表达,其中2号靶点最为有效(P<0.005);重组RNAi质粒pLV-shNaa10经测序证实构建成功, pLV-shNaa10可在293T细胞中成功包装;测定病毒颗粒LV-shNaa10、LV-NC滴度分别为1.2×10⁹ TU/mL和1.0×10⁹ TU/mL;SCC-15细胞感染LV-shNaa10后,Naa10蛋白表达明显降低(P<0.005);干扰Naa10可促进人口腔鳞癌细胞SCC-15的生长。结论:成功构建了Naa10 shRNA慢病毒表达载体,感染人口腔鳞癌细胞SCC-15后,有效抑制了内源性Naa10基因的表达,干扰Naa10可促进SCC-15细胞的生长。     

Semaphorin 3A及其受体在舌鳞癌中的表达及作用

目的：检测Semaphorin（Sema）3A及其受体Neuropilin1（NRP1）在舌癌组织和舌鳞状细胞癌SCC9细胞株中的表达情况,同时观察外源性Sema 3A蛋白对舌鳞状细胞癌SCC9细胞株的影响。方法：通过细胞免疫化学、RT-PCR和Western blot-ting方法检测Sema 3A、NRP1在舌癌组织和SCC9细胞株中的表达情况;通过MTT实验检测外源性Sema 3A蛋白对SCC9细胞株增殖的影响;通过Transwell检测外源性Sema 3A蛋白对SCC9细胞株迁移、侵袭的影响。结果：Sema 3A在舌癌组织和SCC9细胞株中阴性表达,NRP1在舌癌组织和SCC9细胞株中阳性表达;100 ng/ml外源性Sema 3A蛋白明显抑制SCC9细胞株的增殖（P〈0.05）,对其迁移、侵袭能力影响未见统计学差异（P〉0.05）。结论：舌癌组织和舌鳞状细胞癌SCC9细胞株中Sema 3A的阴性表达、NRP1的阳性表达可能与舌癌的发生发展有关。     

瞬时受体电位M2离子通道在舌鳞癌中的表达及作用研究

目的　观察瞬时受体电位M2(transient receptor potential melastatin type 2,TRPM2)在舌癌组织及舌鳞状细胞癌SCC9细胞株中的表达,同时观察不同浓度H2O2激活TRPM2通道后对舌鳞状细胞癌SCC9细胞株的影响。方法　通过细胞免疫化学、Western-Blot和RT-PCR方法检测TRPM2在舌癌组织、SCC9细胞株及正常舌体组织中的表达情况;通过MTT、台盼蓝染色方法检测不同浓度的H2O2对SCC9细胞株增殖、存活率的影响。结果　TRPM2在舌鳞状细胞癌SCC9细胞株和舌癌组织中呈阳性表达,在正常舌组织中阴性表达;不同浓度的H2O2明显抑制SCC9细胞株的增殖（P＜0.05）,降低了SCC9细胞株的存活率（P＜0.05）,并呈剂量依赖关系。结论　TRPM2在舌鳞状细胞癌SCC9细胞株及舌癌组织中的高表达提示离子通道蛋白可能参与调节肿瘤的发生发展。     

Expression of heat shock proteins in squamous cell carcinoma of the tongue: an immunohistochemical study

Ito T, Kawabe R, Kurasono Y, Hara M, Kitamura H, Fujita K, Kanisawa M: Expression of heat shock proteins in squamous cell carcinoma of the tongue: an immunohistochemical study. J Oral Pathol Med 1998; 27: 18–22. © Munksgaard, 1998.
Twenty-four specimens of squamous cell carcinoma of the tongue were immuno-stained for heat shock proteins (HSPs) to reveal differences in stainability among normal epithelium, dysplasia and carcinoma and to clarify the prognostic significance of HSPs in comparison with survival period, clinical stage, lymph node metastasis, histological grade, and p53 immunostaining. Normal epithelium was positively stained in the suprabasal layer for HSP60 and HSP70, but was negative for HSP27 and HSP90. Dysplastic lesions were positive for HSP27, HSP70 and HSP90, but stained variously for HSP60. In squamous cell carcinoma, the cytoplasm of suprabasal tumor cells was often positive for HSP27 and HSP90 (18/24, 17/24, respectively). Although HSP immunohistochemistry has revealed changes in HSP expression during tumorigenesis of squamous epithelium of the tongue, there was no correlation between HSP staining and survival period, stage, lymph node metastasis, histological grade or p53 immunostaining.     

MTUS1／ATIP1对舌鳞癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨过表达MTUS1/ATIP1对舌鳞癌细胞增殖及凋亡的影响。方法检测人舌鳞癌系UM1、SCC鄄9、SCC鄄15、Tca8113细胞株中MTUS1的表达水平。应用含ATIP1片段的质粒转染舌鳞癌细胞,48 h后MTT检测舌鳞癌细胞的增殖能力;应用流式细胞仪技术和细胞免疫荧光技术检测细胞周期和细胞凋亡率;Western blot检测舌鳞癌细胞中MTUS1、p53、ERK1/2的表达情况。结果转染MTUS1/ATIP1后细胞的增殖明显受到抑制,其抑制率约为40％（t=0.023,P＜0.05）;高表达MTUS1/ATIP1可导致舌鳞癌细胞株G1期阻滞（G1期：t=0.032,G2期：t=0.036,S期：t=0.027,P＜0.05）并诱导细胞凋亡率的明显升高,差异具有统计学意义（t=0.005,P＜0.05）。 Western blot检测显示,转染MTUS1/ATIP1后ERK的表达升高,磷酸化的ERK表达下降,p53的表达升高。结论 MTUS1可抑制舌鳞癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡。     

应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株差异性炎症因子的初步研究

目的研究应用蛋白质芯片(抗体芯片)技术筛选、分析人舌鳞状细胞癌细胞株中差异性炎症因子的效果,为进一步探讨口腔癌与炎症的关系奠定基础。方法体外培养人舌鳞癌细胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113和人正常口腔黏膜上皮细胞,消化后分别提取胞内、胞外蛋白,上芯片孵育,封闭,清洗。采用激光扫描仪扫描芯片,Axon GenePix Pro6.0软件提取芯片数据,对获得的80种炎症因子表达数据采用AAH-CYT-G5软件分析,上调因子信号值以大于200、比值大于2.0为纳入标准;下调因子信号值以大于200、比值小于0.66为纳入标准,分别对3种人舌鳞癌细胞株(UM-1、CAL-27、Tca-8113)与人正常口腔黏膜上皮细胞,以及高侵袭性细胞株(UM-1、CAL-27)与低侵袭性细胞株(Tca-8113)进行两两比较,筛选出差异性炎症因子。挑选3种显著差异性炎症因子,用酶联免疫吸附法再次检测其蛋白表达,所得结果用单因素方差分析进行统计学分析,进一步验证芯片法所获得的结果。结果根据纳入标准,从检测的80种因子中筛选出有表达的炎症因子9个,包括干扰素诱导蛋白10(inter-feron inducible protein10,IP-10)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(macrophage inflammatory protein1β,MIP-1β)、巨噬细胞炎症蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α,MIP-3α)、骨保护素蛋白(osteoprotegerin,OPG)、调节活化蛋白(regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted,RANTES)、白细胞介素1β(interleukin1β,IL-1β)6种舌鳞癌细胞株中高表达的细胞因子,及单核细胞趋化因子4(monocyte chemoattractant protein4,MCP-4)、胰岛素样生长因子结合蛋白4(insulin-like growth factor binding protein-4,IGFBP-4)、转化生长因子-β3(transforminggrowth factor-β3,TGF-β3)3种舌鳞癌细胞株中低表达的细胞因子。鳞状细胞癌细胞和正常口腔鳞状上皮细胞之间比较,胞内IL-1β呈高表达,MCP-4呈低表达,胞外OPG呈高表达;高、低侵袭性细胞株之间比较,胞内RANTES呈高表达,IGFBP-4、TGF-β3呈低表达,胞外IP-10、MIP-1β、MIP-3α呈高表达。酶联免疫吸附法检测发现UM-1和CAL-27胞外IP-10、MIP-1β、MIP-3α的表达量和Tca-8113相比呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。其结果与芯片筛选结果一致。结论蛋白质芯片技术能够较为准确地筛选出不同舌鳞癌细胞株之间差异性炎症因子,这些差异性炎症因子可能与肿瘤细胞的生物学行为有一定的联系。     

舌癌及舌癌脑转移细胞的凝集素受体和癌相关基因蛋白表达

目的：研究舌癌细胞系Ｔｃａ８１１３以及该细胞系在裸鼠体内脑转移细胞亚系（Ｔｂ）的凝集素受体和一些癌基因及抑癌基因蛋白的表达特点，探讨可能与Ｔｂ细胞转移有关的机理。方法：对Ｔｃａ８１１３细胞及Ｔｂ细胞亚系的细胞涂片进行常规ＡＢＣ法染色。结果：Ｐ５３、Ｐ１６和ＣＤＫ４蛋白在两种细胞中的表达情况不同，而Ｎｍ２３、Ｈ－ｒａｓ蛋白和各种凝集素在两种细胞中的表达情况无明显差别。结论：Ｐ５３和Ｐ１６蛋白可能与Ｔｂ细胞的转移能力有关     

微小RNA-21反义寡核苷酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用

目的探讨微小RNA-21（miR-21）反义寡核苷酸（miR-21ASO）对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用。方法通过转染miR-21ASO，采用实时荧光定量RT—PCR（qRT—PCR）检测舌鳞癌细胞株SCC-15和CAL27中miR．21的表达变化，荧光素酶活性检测实验分析miR-21ASO在舌鳞癌细胞中的调控功能．并运用多种细胞增殖和凋亡检测方法以观察miR-21ASO对舌鳞癌细胞调控产生的系列效应。结果miR-21在两株舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27中的表达显著高于在正常舌鳞状上皮细胞中的表达（P=0．037，0．015），转染miR-21ASO可显著抑制其表达（P=0．017，0．006），miR-21对荧光素酶活性的抑制率由50％显著减少到20％以下（P=0．002，0．003），SCC-15和CAL27细胞存活率比转染前明显降低（P=0．002，0．004），细胞克隆形成率比转染前明显降低（P=0．007，0．032）；流式细胞仪检测显示转染miR-21ASO后．SCC-15和CAL27细胞凋亡明显增加，激光共聚焦显微镜观察到线粒体细胞色素C释放较转染前增加。结论miR-21ASO对舌鳞癌细胞miR-21水平降低具有靶向特异性．转染miR-21ASO可有效抑制miR-21的促癌效应，利用反义核酸技术的高度特异性开展针对促癌microRNA分子的靶向治疗将可能为舌鳞癌的基因治疗开辟新的途径。     

亲环蛋白A在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨亲环蛋白A(CyPA)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中的表达,以及下调SCC-25细胞中CyPA基因对细胞增殖和侵袭的影响.方法 选取OSCC患者77例,检测OSCC及癌旁组织中CyPA蛋白表达,培养SCC-25细胞并分为CyPA干扰序列组、阴性对照组和空白组,分别采用实时荧光定量聚合酶链反应技术和West...