仪器法与稀释法检测细菌对复方磺胺甲唑敏感性的比较

目的:验证Vitek药敏试卡检测复方磺胺甲唑(SMZ-TMP)的可靠性.方法:有目的地选择五类178株细菌,用Vitek药敏试卡和琼脂稀释法进行SMZ-TMP的药敏试验.结果:对大肠埃希菌、克雷伯菌属和肠杆菌属,两法检测SMZ-TMP的结果无差异;对葡萄球菌和嗜麦芽窄食单胞菌,两法检测结果有非常显著差异.结论:仪器法不宜用于葡萄球菌和嗜麦芽窄食单胞菌对SMZ-TMP敏感性的检测.     

4种感染性腹泻病原菌免疫磁珠-多重PCR快速检测体系的建立

目的基于免疫磁珠分离及多重PCR技术建立出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的快速检测体系。方法根据出血性大肠埃希菌uidA、福氏志贺菌ipaH、空肠弯曲菌hipo及副溶血弧菌tlh的基因序列设计特异性引物,优化免疫磁珠分离过程及多重PCR扩增中的各个环节,建立上述4种病原菌同步快速扩增体系,并鉴定该体系特异性、敏感性。结果发现Mg2+浓度对该体系影响最大,在Mg2+浓度为4 mmol/L时扩增效率最高;该体系对4种病原菌的敏感性分别为:出血性大肠埃希菌2.7×10 cfu/ml、福氏志贺菌6.4×10 cfu/ml、空肠弯曲菌7.6×10 cfu/ml、副溶血弧菌3.6×10 cfu/ml。结论建立了出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的免疫磁珠-多重PCR快速检测体系,该体系特异性及敏感性高,检测过程简单,结果稳定,可应用于临床诊断及食品卫生监管中致病菌的快速检测。     

203株产超广谱β-内酰胺酶菌的检测及耐药性

目的 :了解革兰氏阴性杆菌产超广谱β 内酰胺酶 (ESBLs)的情况及耐药性 ,以利于对产ESBLs菌株的治疗。方法 :采用NCCLS推荐的确认法。结果 :72 7株革兰阴杆性菌中 ,共检出产ESBLs菌 2 0 3株 ,检出率为 2 7.9% ,其中大肠埃希菌 87株、克雷伯杆菌 72株、嗜麦芽窄食单胞菌 17株、费劳地枸橼酸菌 11株、阴沟肠杆菌 5株、鼠伤寒沙门菌 4株、产气肠杆菌 2株、铜绿假单胞菌 2株、亲水气单胞菌 2株、聚团肠杆菌 1株 ;亚胺培南除对 1株产ESBLs大肠埃希菌和 17株产ESBLs嗜麦芽窄食菌耐药外 ,对其他产ESBLs菌均表现出最强的抗菌作用 ;头孢哌酮 /舒巴坦对产ES BLs嗜麦芽窄食菌、大肠埃希菌及费劳地拘橼酸菌有较好的抗菌作用 ;丁胺卡那霉素对产ESBLs大肠埃希菌呈现较好的抗菌作用。结论 :我院革兰阴性菌产ESBLs情况严重 ,而且已经分离出对亚胺培南耐药的ESBLs大肠埃希菌 ,临床医生应尽量在确立了病原学诊断后参考细菌药敏报告用药 ,以减少耐药菌株的产生。     

重症监护病房下呼吸道感染革兰阴性菌耐药性分析

目的:了解重症监护病房(ICU)下呼吸道感染革兰阴性菌的耐药情况。方法:对78例ICU下呼吸道感染患者痰培养分离革兰阴性菌行耐药性分析。结果:128株革兰阴性菌中,铜绿假单胞菌居首位(37.5%),其次为鲍氏不动杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷白菌、嗜麦芽窄食单胞菌等。铜绿假单胞菌对亚胺培南、阿米卡星、头孢他定、哌拉西林/三唑巴坦耐药率较低;鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌对抗菌药物多重耐药率高;大肠埃希菌和肺炎克雷白菌产超广谱β-内酰胺酶分别为31.6%和22.2%;嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明、头孢他定耐药率为14.3%;除嗜麦芽窄食单胞菌外,亚胺培南耐药率<4.5%。结论:ICU下呼吸道感染革兰阴性菌部分出现多重耐药。     

中药对常见革兰阴性杆菌耐药菌株体外抑菌试验观察

目的探讨中药对常见多重耐药革兰阴性杆菌治疗的可行途径。方法用自制中药液对多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼复合醋酸钙不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌采取试管内药液稀释法和纸片法进行药物敏感试验。结果中药液对全铜绿假单胞菌以及多重耐药的嗜麦芽窄食单胞菌作用较大,对多重耐药菌鲍曼复合醋酸钙不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌作用较弱。结论由于中草药的多作用机制,一般在临床不易形成耐药,但中草药目前的炮制和使用情况下难以达到如此高的体内浓度,难以替代抗生素,应在中草药和抗生素联合使用上进一步研究,以减少耐药性和抗生素残留。     

2O3株产超广谱β-内酰胺酶菌的检测及耐药性

目的:了解革兰氏阴性杆菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的情况及耐药性,以利于对产ESBLs菌株的治疗.方法:采用NCCLS推荐的确认法.结果:727株革兰阴杆性菌中,共检出产ESBLs菌203株,检出率为27.9%,其中大肠埃希菌87株、克雷伯杆菌72株、嗜麦芽窄食单胞菌17株、费劳地枸橼酸菌11株、阴沟肠杆菌5株、鼠伤寒沙门菌4株、产气肠杆菌2株、铜绿假单胞菌2株、亲水气单胞菌2株、聚团肠杆菌1株;亚胺培南除对1株产ESBLs大肠埃希菌和17株产ESBLs嗜麦芽窄食菌耐药外,对其他产ESBLs菌均表现出最强的抗菌作用;头孢哌酮/舒巴坦对产ESBLs嗜麦芽窄食菌、大肠埃希菌及费劳地拘橼酸菌有较好的抗菌作用;丁胺卡那霉素对产ESBLs大肠埃希菌呈现较好的抗菌作用.结论:我院革兰阴性菌产ESBLs情况严重,而且已经分离出对亚胺培南耐药的ESBLs大肠埃希菌,临床医生应尽量在确立了病原学诊断后参考细菌药敏报告用药,以减少耐药菌株的产生.     

ICU病原菌分布及常见革兰阴性杆菌的耐药性分析

目的了解重症监护病房(ICU)患者感染病原菌的种类及常见革兰阴性杆菌的耐药情况,为临床合理用药提供依据。方法对ICU患者标本中分离出的病原菌进行分析。结果共分离出病原菌436株,革兰阴性杆菌占87.8%,革兰阳性球菌占10.4%,真菌占1.8%。主要病原菌依次为鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌。鲍曼不动杆菌对亚胺培南、庆大霉素的耐药率2.0%;铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大霉素的耐药率10.0%;嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明、米诺环素、左氧氟沙星的耐药率12.0%。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性率分别为52.9%、37.7%。结论常见革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药率存在差异,临床医师应根据药敏结果选择敏感性抗菌药物进行治疗。     

银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌作用

目的：探讨银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌活性,为研制开发治疗牙周病的新型纯中药抗菌药物提供药理学依据。方法：本实验分为阴性对照组、亚胺培南对照组和不同浓度及剂型的银杏叶提取物组。采用溶剂提取法制取银杏叶提取物,采用打孔法和试管法在厌氧环境下检测银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌活性,并与金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌对比。通过观察抑菌环直径和测定最小抑菌浓度（MIC）衡量银杏叶提取物的体外抑菌作用。结果：在抑菌环实验中,银杏叶提取物、银杏叶片和银杏叶软胶囊的原液和1∶4的稀释液作用于牙龈卟啉单胞菌,抑菌环直径随着浓度的降低而减小,银杏叶提取物的最大抑菌直径为16.5 mm,银杏叶片和软胶囊最大抑菌直径分别为15.3和14.5 mm,银杏叶提取物抑菌直径明显大于银杏叶片和银杏叶软胶囊（P <0.05）,银杏叶片与银杏叶软胶囊抑菌直径比较差异无统计学意义（P>0.05）;大肠埃希菌组和金黄色葡萄球菌组得到同样的结果。MIC测定,银杏叶提取物组内比较,银杏叶提取物浓度高于1.95 mg/L时,试管内均无牙龈卟啉单胞菌生长,而大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌仍可以生长,浓度高于6.25和12.5 mg/L时大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌不生长,银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用优于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌。结论：银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌具有抑菌作用。     

ICU病房革兰氏阴性杆菌耐药性分析

目的:了解我院重症监护病房革兰氏阴性杆菌的分布和耐药性情况. 方法: 使用纸片扩散法对276株临床分离菌进行抗菌药物敏感试验. 结果:分离出最常见的5种菌依次为:不动杆菌属、大肠埃希氏菌、克雷伯菌属、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌.ESBLs在大肠埃希氏菌和克雷伯菌属中的检出率分别为41.1%和52.2%.非发酵菌对大多数抗菌药物高度耐药.结论:加强耐药性监测,合理使用抗菌素十分重要.     

环介导等温扩增法直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌

目的：应用环介导等温扩增技术（LAMP）建立一种快速敏感的直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌的方法。方法根据美国国立卫生研究院基因序列数据库（GenBank）上大肠埃希菌的lacZ（登录号：M74750）基因序列,设计4条特异引物（2条内引物、2条外引物）,对lacZ基因进行扩增,对扩增反应进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性,并与传统培养法进行比较。结果在300份阳性血培养瓶中,采用LAMP法检测到68株大肠埃希菌,所设计引物对大肠埃希菌扩增的特异性及敏感性均较好,与传统培养法比较,灵敏度和特异性均达100％,但传统培养法的检出时间为3d,而LAMP法的检出时间只需1h。结论LAMP检测大肠埃希菌是快速、低成本、特异性强、灵敏度高的方法,适合临床开展。     

CHIKV Real-time PCR检测方法的建立及试剂盒研发

目的建立快速特异检测基孔肯雅病毒的Real-time PCR方法及试剂盒。方法根据发表在Genbank上15株基孔肯雅病毒基因序列全长,应用ClustalW2.0和DNAMAN8软件筛选出位于其E1基因上的种内保守种间特异的目的片段,并据此设计出最优引物。人工合成该基因片段并构建重组质粒,对重组质粒梯度稀释后,再利用SYBR Green I Real-time PCR的方法检测该特异基因的浓度,建立标准品曲线,用于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,标准品的PCR扩增产物的电泳条带长度与目标条带一致,测序结果显示与目标条带序列一致,说明引物与阳性质粒性能良好。经优化确定CHIKV荧光定量PCR反应体系中最佳的引物浓度为350 nmol/L,最佳的反应条件为：50 ℃ 2 min;95 ℃预变性2 min;以95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min进行40个循环扩增,在72 ℃进行荧光采集。根据荧光定量PCR熔解曲线出现特异性单峰,并对黄病毒属成员登革病毒和寨卡病毒的检测为阴性,表明该检测方法特异性高;检测阈值达302 拷贝 ,显示敏感性好,重复试验的变异系数均小于0.1%,说明该实验设计稳定性良好。结论基于该方法的试剂盒具有特异性好、灵敏度高、重复性好、能够快速定量等优点,有利于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断,具有良好的应用前景。     

霍乱弧菌LAMP快速检测方法的建立及应用

目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌.方法 针对霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异引物,优化反应条件,建立霍乱弧菌的LAMP检测方法.通过对47株细菌及模拟污染现场,检测该方法的灵敏度、特异度和实用性.结果 活菌计数方法表明建立的LAMP方法检测霍乱弧菌的灵敏度为1.6×10~2 cfu/ml.在人工污染霍乱弧菌的粪便及海水标本中检测的敏感度为1.6×10~3 cfu/ml,在牛奶标本中敏感度为1.6×10~4 cfu/ml.检测21株霍乱弧菌均为阳性,26株非霍乱菌则全部阴性,特异度为100%.结论 建立的LAMP方法检测霍乱弧菌灵敏度、特异度高,可用于霍乱现场监测和流行病学调查.

Abstract：

Objective To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Method Based on the ompW nucleic sequence of Vibrio cholerae, a pair of primers was designed for LAMP. The reaction conditions were optimized, and the specificity, sensitivity, and practicability of LAMP were tested using 47 baterial strains and simulated contaminated sites. Results The results of viable bacterium count showed that LAMP was capable of detecting Vibrio cholerae at a level as low as 1.6×10~2 cfu/ml. The minimal detectable concentration was 1.6×10~3 cfu/ml for simulated contaminated samples such as feces and seawater, and 1.6×10~4 cfu/ml for contaminated milk. All the 21 strains of Vibrio cholerae yielded positive results in LAMP, and the 26 strains of other bacteria all showed negative results, with a detection specificity of 100%. Conclusion The established LAMP method has high specificity and sensitivity for detecting Vibrio cholerae and is applicable in field monitoring and epidemiological study of Vibrio cholerae.     

实时PCR检测HSV-2 DNA的方法学评价及应用

目的对本室利用TaqManMG技术建立的HSV-2实时定量PCR法进行方法学评价及临床应用。方法收集60名近期有流产史妇女的全血及血清标本,分别用FQ—PCR和ELISA法同时检测,并进行比较;另对FQ—PCR从重复性、灵敏度、线性范围、特异性几方面进行方法学评价。结果对60份临床标本检测,ELISA法的阳性率为16．7％,FQ—PCR法的刚性率为31．7％,明显高于前者（P〈0．05）。FQ—PCR法的重复性较好[批内CV（变异系数）值为2．29％,批间CV值为4．76％]、线性范围好（4．75×10^1-10^6copies／μl,r=0．998）、灵敏度达到47．5copies／μl、特异性较好（对HSV—1、Vero细胞、巨细胞病毒、弓形虫等尢特异性扩增）。结论实时PCR测定HSV-2方法比传统的ELISA法更快速灵敏,是较有发展前途的新技术。     

鹅源星状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法 .方法 分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性.结果 该方法 最低检测线限为1.50×102copies/μL,批内和批间检测变异系数分...     

荧光定量PCR和环介导等温扩增方法检测隐球菌CAP10基因的比较研究

目的建立荧光定量PCR和环介导等温扩增技术(LAMP)检测隐球菌荚膜相关蛋白基因(CAP10)的方法,并比较和评价两种方法的优缺点。方法针对新型隐球菌CAP10基因序列,使用在线软件设计引物,并构建质粒标准品,优化反应条件后用荧光定量PCR和LAMP两种方法检测定量的质粒,分析其敏感性和特异性,并检测临床标本。结果荧光定量PCR检测CAP10质粒的敏感性为6.8×101拷贝,LAMP方法的敏感性为6.8×103拷贝,PCR检测阳性率比LAMP方法高。两种方法特异性好,对脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉和大肠埃希菌的检测结果均为阴性。结论成功建立了检测CAP10基因的荧光定量PCR方法敏感性和特异性高,但是需要特殊仪器;LAMP方法敏感性较低,但其操作简单,无需特殊仪器和设备,加入核酸染料即能观察结果。两者均适用于新型隐球菌感染的检测。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响

目的 建立SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测HBV-DNA方法,并检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响.方法 提取HepG2.2.15细胞DNA,PCR扩增后纯化,PCR纯化产物梯度稀释作为标准品,采用SYBR Green Ⅰ Real-time PCR 检测,建立标准曲线,并分析方法的特异性、灵敏度、重复性和稳定性.运用建立的SYBR Green Ⅰ 方法检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响,并与Taqman方法进行比较.结果 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法特异性、重复性及稳定性均较好,线性范围为107~102copies,检测灵敏度可达102copies.IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA具有抑制效果,且呈剂量依赖性.SYBR Green Ⅰ 方法与Taqman商业试剂盒检测结果差异无统计学意义.结论 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法简便快速、结果准确、价格低廉,可以满足HBV-DNA拷贝数检测的需要.     

LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较

目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测痢疾志贺菌,并对其特异性、灵敏度与传统PCR进行比较。方法以痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)为靶序列,设计6条特异性引物(内引物、外引物和环引物各2条),优化LAMP反应体系及反应条件,检测LAMP反应的灵敏度、特异性及模拟样品,同步与PCR进行比较。结果 LAMP法和PCR均能特异性地扩增出志贺菌靶DNA,而其他非志贺菌均未扩增出特有条带。检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×101cfu/ml、6.8×101cfu/ml,PCR法分别为5.3×102cfu/ml和6.8×102cfu/ml。结论利用LAMP技术,可快速、灵敏、简便地检测痢疾志贺菌,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望发展成为快速检测痢疾志贺菌的有效手段。     

高分辨率熔解曲线分析技术检测MASP-2基因点突变方法的建立及评价

建立高分辨率熔解曲线（HRM）分析技术检测人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2（ MASP-2）基因g.21370（G>T）位点单核苷酸多态性（SNP）的方法并进行评价。方法通过测序获得 MASP-2基因g.21370（G>T）位点3 种不同基因型对照品，并用其建立HRM 技术检测 MASP-2 基因点突变方法。利用60 份待测DNA 样品对建立的HRM 方法的准确性、重复性及稳定性进行评价。结果建立的 MASP-2 基因HRM 分析方法扩增反应正常，G/G、G/T、T/T 3种基因型区分明显，扩增产物Melt 曲线良好，无非特异性产物出现；与基因序列测定结果对比显示准确性良好；对野生型和突变型标本3 次重复检测结果显示，Tm 值变异系数为0.017 和0.023；χ2 检验结果表明，本研究选取的随机体检人群 MASP-2 基因g.21370（G>T）位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡。结论建立的 MASP-2 基因g.21370（G>T）位点HRM检测方法准确性高、重复性及稳定性良好，为下一步临床分析 MASP-2 基因SNP 提供一定的技术支持。     

肺炎链球菌的扩增片段长度多态性快速检测方法的建立和应用

目的建立扩增片段长度多态性(AFLP)快速检测肺炎链球菌。方法针对肺炎链球菌的管家基因16SrRNA基因设计特异引物,优化反应条件,建立肺炎链球菌的AFLP检测方法。通过对20株肺炎链球菌和15株非肺炎链球菌进行检测,检验该方法的灵敏度、特异度和实用性。结果活菌计数方法表明建立的AFLP方法检测肺炎链球菌的灵敏度为1.5×103CFU/ml。检测20株肺炎链球菌均为阳性,15株非肺炎链球菌则全部阴性,特异度为100%。结论建立的AFLP方法检测肺炎链球菌灵敏度、特异度高,可用于肺炎链球菌的检测和流行病学调查。