hERα-LBD原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定

目的 构建人雌激素受体α 亚型配体结合区（hERα-LBD）的原核表达载体,并进行表达蛋白的活性鉴定。方法 以hERα -LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα -LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体（pGEM-T-easy）连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性菌落经酶切和测序鉴定,和pET-28a（+）质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD ,转化到大肠杆菌JM109和BL21感受态细胞中。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白;将雌二醇-牛血清白蛋白（BSA）偶联抗原(E2-BSA) 与融合蛋白混合,通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性。结果 PCR扩增的hERα -LBD基因片段约为1.9 kb,与预期目的片段大小一致。与T载体连接,形成pGM-T-hERα -LBD重组质粒,转化到感受态细胞,阳性菌落酶切和测序鉴定正确,与pET-28a（+）质粒酶切后连接,成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD;在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERα-LBD蛋白。经亲和色谱法纯化后,hERα-LBD蛋白的表达量可达250 mg/L。电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性。结论 成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD,hERα-LBD具有雌激素结合活性。     

人脑胶质瘤特异抗原肽白介素-13 α 2受体重组表达质粒的构建

目的：构建白介素-13α2受体（IL-13Rα2）重组表达质粒,为检测IL-13Rα2抗原肽的表达奠定实验基础。方法：利用RT-PCR法从U251胶质瘤细胞株中获得IL-13Rα2目的基因,并与克隆质粒pMD19SimpleT载体连接转入DH5α菌克隆,用XhoI和HindIII将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒pET-28a连接,转入BL21（DE3）菌,提取重组质粒进行酶切及测序鉴定。结果：目的基因IL-13Rα2与表达质粒pET-28a连接,成功构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒。结论：IL-13Rα2目的基因能经RT-PCR法获得,并能成功与表达质粒连接,构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒,为今后检测IL-13Rα2抗原肽的表达以及利用其来免疫治疗胶质瘤提供了良好的实验基础及理论依据。     

HBx基因缺失型突变体HBx-d382与HBx-d431原核表达载体的构建和鉴定

目的为探讨HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431在临床上应用的价值,构建HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431原核表达载体。方法以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的HBx基因片段。HBx基因PCR扩增产物与载体pET-28a(+)经双酶切、连接,形成重组DNA后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经卡那霉素筛选、酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组HBx基因缺失型突变体原核表达载体。结果成功构建了重组pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)HBx-d431原核表达载体,重组前后HBx基因片段序列一致。结论pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)/HBx-d431原核表达载体构建成功,为HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431蛋白的免疫原性和临床应用的研究奠定了基础。     

靶向克隆法构建NY-ESO-1基因的原核表达载体

目的:利用PCR产物靶向克隆法构建人癌-睾丸抗原NY-ESO-1的原核表达载体。方法:从人新鲜的食管癌组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增NY-ES0-1基因3′端的340bp片段,采用靶向克隆法将目的基因插入到原核表达载体pET-15b中,得到重组表达质粒pET-15b-NY-ESO-1,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物核苷酸序列分析等,鉴定所构建的原核表达载体。结果:扩增得到NY-ESO-1基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR,酶切鉴定获得了一个大小为340bp的特征性片段,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因NY-ESO-1。结论:靶向克隆法可快速、高效地构建人NY-ESO-1基因的原核表达载体,为制备pET-15b-NY-ESO-1融合蛋白奠定了基础。     

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的：克隆EBV－LMP1 cDNA，构建EBV－LMP1基因的原核表达重组质粒。方法：通过RT－PCR技术从B95－8细胞中扩增EBV－LMP1 cDNA，克隆至pGEM-T easy载体上并测序；利用引物上的BamH I与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a，转化JM109菌。提取质粒，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp，测序结果与已知序列吻合，重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论：成功克隆了EBV－LMP1 cDNA，并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体，为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌毒素蛋白 higB 的原核表达及分析

目的：克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a（＋）-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32 a（＋）质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达载体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。     

阴道毛滴虫RRas基因的cDNA克隆和原核表达

目的克隆和表达阴道毛滴虫RRas(TvRRas)基因,以便进一步探讨其组织定位及功能。方法应用PCR方法从构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增TvRRas基因片段,克隆至pGEM-T载体,经PCR、酶切和测序鉴定后亚克隆至原核表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍-硝基三乙酸(Ni-NTA)柱纯化表达产物后用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定。结果从阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增的TvRRas基因片段长522bp,酶切及DNA测序证实pET-41a/TvRRas重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为45000u。结论成功构建重组原核表达质粒pET-41a/TvRRas,并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期一致。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

含产气荚膜梭菌肠毒素基因重组质粒pET-28a-CPE的构建和表达

目的 构建含全长产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)基因的重组表达质粒pET-28a-CPE并进行原核表达.方法 培养并提取表达肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615的基因组DNA,PCR扩增出全长CPE基因片段并连接入pET-28a载体质粒中,构建重组原核表达质粒pET-28a-CPE,进行酶切及测序鉴定,并转化入感受态大肠杆菌(E.coli)BL21中,用IPTG诱导CPE表达.结果 复苏、培养成功产肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615,成功构建了表达质粒pET-28a-CPE,经酶切及测序鉴定结果 与设计的完全相符,成功用E.coil BL21进行了原核表达,目的 蛋白CPE占总表达蛋白45.37%.结论 本实验成功构建并表达了含CPE的重组质粒pET-28a-CPE,为进一步观察CPE时前列腺肿瘤等的生物学作用奠定了基础.     

重组大鼠溶菌酶C端多肽的原核表达与纯化

目的 应用基因重组技术,构建pET30a(+)与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a(+)载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta (DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni+-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a(+)与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.     

嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

目的克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip基因,构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR),从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a( ),构建原核表达重组质粒pET-ip,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了792 bp完整的ip基因,构建的原核表达重组质粒pET-ip表达出49 kDa Trx-IP的融合蛋白质,Western-blot证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论成功构建了军团菌ip基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法：根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果：酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论：成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。     

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

卵巢上皮性癌SEREX抗原基因FXR1、OV-189原核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建卵巢上皮性癌SEREX抗原基因FXRl、OV-189的原核表达载体.方法:用PCR从含SEREX抗原基因序列的重组pBK-CMV质粒中扩增FXRl、OV-189的CDS,双酶切后插入原核表达质粒pET-30b( ),经酶切及测序鉴定,阳性质粒转化表达菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:成功扩增了FXRl、OV-189的CDS,并构建了原核表达质粒pET-30b( )/FXRl、pET-30b( )/189,经测序,与Genbank中的相应序列一致,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达目的蛋白.结论:成功构建了原核表达质粒pET-30b( )/FXRl、pET-30b( )/189,并在大肠杆菌中表达了重组融合目的蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

人巨噬细胞金属弹力酶催化域基因的克隆及表达

目的克隆人巨噬细胞金属弹力酶催化域（HMEcd）基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌中表达HMEcd基因融合蛋白。方法用RT-PCR方法提取人胃癌组织总RNA并扩增出HMEcd cDNA,克隆入pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-HM Ecd,双酶切鉴定及DNA测序正确后再将HMEcd cDNA亚克隆至pET-28a（＋）载体,构建原核表达载体pET-28a（＋）-HM Ecd,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果RT-PCR获得预期的HMEcd cDNA,双酶切鉴定及DNA测序证实将HM Ecd基因分别正确插入克隆载体和原核表达载体中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定证实表达出HMEcd融合蛋白。结论成功表达出HMEcd基因融合蛋白,为进一步功能实验研究奠定基础。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究莫定了基础。     

伪狂犬病病毒Min-A株gE主要抗原表位基因的克隆与鉴定

目的：获得PRV gE主要抗原表位基因，构建PRV gE重组表达载体。方法：根据伪狂犬病病毒Min—A株gE基因序列，设计一对引物，采用PCR方法扩增PRV gE基因主要抗原表位区约642bp的片段，将产物克隆到PGEM-7Z载体中，测序正确后再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中，提取质粒作限制性内切酶分析和序列测定。结果：限制性核酸内切酶酶切鉴定表明，扩增出了PRV gE主要抗原表位基因，测序结果经BLAST分析与GenBank中注册的序列完全一致。结论：成功克隆了PRV gE主要抗原表位基因的原核表达载体。