人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗精子蛋白17(Sp17)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:克隆人Sp17cDNA,表达带有6His标记的重组Sp17,用纯化的重组Sp17免疫BALB/c小鼠制备mAb。用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆。用免疫组化染色法及阻断试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系3C12和3D6,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。用人和大鼠睾丸组织以及人精液精子免疫组化染色及阻断试验证明,抗Sp17mAb具有良好的特异性。抗Sp17mAb也可识别卵巢癌组织中异常表达的Sp17。结论:成功地制备特异性的抗Sp17mAb,为研究该蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。     

抗人F蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

Ｆ蛋白是存在于哺乳动物肝细胞质中的一种水溶性不稳定的单链蛋白质,相对分子质量（Ｍｒ）为４４０００。正常人肝组织中大约含Ｆ蛋白２７４ｍｇ／ｇ〔１，２〕,而血清中仅含０．２ｍｇ／Ｌ,提示血清Ｆ蛋白作为判断肝损伤程度的可能性。为对Ｆ蛋白进行深入研究,并提高对其检测的灵敏度,１９９５年以来,我们先后制备了３株抗人Ｆ蛋白的单克隆抗体（ｍＡｂ）,并进行了初步鉴定。１材料和方法１．１材料人Ｆ蛋白抗原的制备〔３〕：取肝外伤手术切除的新鲜肝组织５０ｇ,剪成约５ｍｍ３的组织碎块后,置于含有１ｇ／ＬＩＶ型胶原酶（Ｓｉｇｍａ）…     

抗人肝癌单克隆抗体HL2的制备及鉴定

用肝癌细胞株QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721以贯序法免疫BALB/c小鼠,获得一株分泌肝癌单抗的杂交窟株HL_2,其染色体数目为97—105。单抗HL_2系IgG_2b亚类。吸收实验及阻断实验证明HL_2抗原与CEA、AFP、HBsAg、HBcAg及HBeAg无免疫同源性。ABC法和ELISA法说明单抗HL_2与四株肝癌细胞、六例肝癌组织均呈明确阳性反应,除与SGC-7901、H_(128)、K_(562)、Hela细胞株及部分胚胎肝脏,胚胎结肠有较弱性反应外,与肝癌旁组织、正常肝脏、其它肿瘤组织和细胞株、二种正常人细胞及其它胚胎组织无反应。显示了单抗HL_2的特异性较好、阳性率较高,是一个有应用前景的单抗。     

抗人肝癌单克隆抗体HL2的制备及鉴定

本文以贯序免疫法依次用人肝癌细胞株QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721免疫BACB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,经检测细胞抗原的EL-ISA方法筛选,连续克隆4次后,获得了1株能稳定分泌肝癌单抗的杂交瘤株HL_2。其     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

pICln蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备特异性的抗plCln蛋白的单克隆抗体(McAb),为plCln的纯化及检测等提供必要的工具.方法:以pICln的合成肽为免疫原,对BALB/c小鼠注射免疫,将免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1进行细胞融合,用显微镜下挑选单个克隆的克隆化方法克隆化,用间接ELISA检测法进行筛选.单抗的效价、亚型及特异性用ELISA、免疫双向扩散实验和Western blot等检测.结果:获得了稳定的分泌型杂交瘤细胞株大2B7和4A3,2B7培养上清液单抗效价为1:64,属IgGl亚型,其腹水抗体效价及纯化抗体的效价分别为1:1.28×104、1:6.4×103,Westem blot及免疫耗竭实验呈现一条约40 kD)的特异性带,免疫组织化学染色显示在细胞核和细胞质中呈现阳性反应.结论:本次制备的单抗具有特异性、高效价,可应用于plCln蛋白的纯化及检测等研究.     

人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.     

抗人脑髓鞘碱性蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

人脑髓鞘碱性蛋白 (ｈｕｍａｎｂｒａｉｎｍｙｅｌｉｎｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｎ ,ＭＢＰ)是组成中枢神经系统 (ＣＮＳ)神经纤维的重要蛋白质 ,由ＣＮＳ少突细胞合成 ,占髓鞘蛋白质总量的 30 % ,在神经纤维的绝缘和快速传递过程中起重要作用[1] 。ＭＢＰ能诱发实验性变应性脑脊髓炎 (ＥＡＥ) ,并作为人脱髓鞘疾病多发性硬化(ＭＳ)的动物模型 ,其在ＭＳ发病机制中的作用也倍受关注[2 ] 。我室曾报道抗人脑ＭＢＰ多克隆抗体的制备[3 ] ,为研究人ＭＢＰ分子各特异性表位的结构和功能 ,本室研制了抗ＭＢＰ单克隆抗体 (ｍＡｂ)。1　材料和方法1.1　…     

抗人乳腺癌候选抑制蛋白1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人乳腺癌候选抑制蛋白1(BCSC-1)蛋白单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:构建原核表达载体pET-30a-BCSC-1,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组人BCSC-1蛋白。超声洗涤纯化重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌小鼠抗人BCSC-1蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性。将真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1转染入乳腺癌MCF-7细胞,通过免疫组化确定了人BCSC-1蛋白的表达。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-BCSC-1,经IPTG诱导表达出了重组人BCSC-1蛋白,主要以包涵体的形式存在沉淀中。用纯化的重组BCSC-1蛋白免疫小鼠后经融合筛选得到1株稳定分泌抗BCSC-1的mAb杂交瘤细胞株。通过ELISA、Western blot、免疫组化等方法鉴定,抗BC-SC-1的mAb能与BCSC-1蛋白特异性结合。结论:成功制备了小鼠抗人BCSC-1的mAb。     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白（hLN）的单克隆抗体（McAb）。方法用纯化的人层粘连蛋白（hLN）作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株（2A1、3B5、2C4、4D1）,培养上清的ELISA效价分别为：1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为：1×10^6、1×10^7、1×10^6、1×10^5;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用细胞融合技术建立了５株分泌抗人甲胎蛋白（ＡＦＰ）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株，快速酶联免疫分析法测得其亲和常数为５×１０７～２×１０９Ｍ－１之间；单抗的Ｉｇ亚类１Ｄ６和１Ｅ６为鼠ＩｇＧ２ａ（κ），３Ａ８、５Ａ７和７Ｈ１１为ＩｇＧ１（κ）。免疫组化中５株单抗均在肝癌细胞的胞浆显色，３Ａ８和１Ｄ６还能结合在肝癌细胞膜上。应用方阵配对实验初步证实，５株单抗至少针对ＡＦＰ分子上３个不同表位，并分析了单抗在ＥＬＩＳＡ反应中的特性。     

人促甲状腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备特异性强、灵敏度高的人促甲状腺激素（hTSH）单克隆抗体,为建立高灵敏性和高特异性的hTSH检测方法奠定基础。方法：人工合成人促甲状腺激素（hTSH）上的28个氨基酸,采用戊二醛交联法与牛血清白蛋白（BSA）构建完全抗原。用人工免疫原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术建立分泌抗hTSH单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对得到的单抗进行鉴定。结果：建立了一株杂交瘤细胞4E5,制备了腹水单抗,经鉴定,抗体重链属于IgG1类型,轻链属于K型,McAb腹水ELISA效价达1：1．6×10^5,与促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）无明显交叉反应,细胞株冻存复苏后抗体分泌稳定。结论：本实验建立的细胞株显示稳定性好,特异性高,McAb腹水效价高,为进一步提高hTSH检测的灵敏性和简便性提供依据。     

抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人骨桥蛋白(hOPN)的单克隆抗体(mAb),用于其功能研究.方法:构建OPN的原核表达载体pTriEx-1-hONP载体,转化Tuner(DE3)placI感受态大肠杆菌,用IPTG进行诱导表达.利用镍柱亲和层析纯化OPN蛋白,纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为免疫原.以重组纯化的OPN蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/O进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性,并用免疫组化方法检测了正常月经周期子宫内膜OPN的表达.结果:pTriEx-1-hONP表达的OPN蛋白主要为可溶性形式,经镍柱纯化后,蛋白纯度可达85%以上.纯化的OPN重组蛋白免疫小鼠后经融合筛选,得到2株稳定分泌抗人OPN的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和587,两株mAb的免疫球蛋白亚类分别IgG1和IgG2a.通过ELISA和Western blot等方法鉴定,抗OPN的mAb能与OPN蛋白特异性结合.通过免疫组织化学方法对不同时期的正常子宫内膜的OPN的检测表明,子宫内膜腺上皮在增生期、分泌早期,OPN呈弱阳性表达;分泌中、晚期OPN呈强阳性表达.结论:以纯化的重组hOPN为免疫原成功制备了鼠抗hOPN的mAb,并初步进行了应用,为研究hOPN的功能打下了良好基础.     

抗人Fas单克隆抗体的制备及鉴定

Ｆａｓ／Ａｐｏ１／ＣＤ９５抗原的发现,始于对两株单克隆抗体（ｍＡｂ）的功能观察,即抗Ａｐｏ１ｍＡｂ和抗ＦａｓｍＡｂ〔１,２〕。由于二者都能识别细胞膜上ＣＤ９５蛋白抗原,且能诱导敏感细胞凋亡,才导致今天对Ｆａｓ抗原的生物医学研究。制备抗ＦａｓｍＡｂ对于Ｆａｓ抗原的深入研究,尤其是对Ｆａｓ抗原信号传导机制的阐明,以及生物医学应用都有重要的意义。本文利用Ｆａｓ＋的细胞作为免疫原,制备了１株鼠抗人ＦａｓｍＡｂ２Ａ１。１材料和方法１．１材料１．１．１细胞系Ｓｐ２／０小鼠骨髓瘤细胞、Ｊｕｒｋａｔ人Ｔ淋巴…     

抗人IgG单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高效价的抗人IgG单克隆抗体(mAb),并用于肾脏免疫性疾病的免疫荧光诊断。方法:以人IgG全长分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,经筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗IgGmAb的杂交瘤细胞株。用ELISA及Westernblot鉴定mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)。以纯化的mAb建立免疫荧光染色法,并用于肾小球肾炎的诊断。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人IgGmAb的细胞株,腹水效价为1×10-6,Ig亚类为IgG2a(κ),相对亲和力达到1×10-5,Westernblot显示在相对分子质量(Mr)为53×103处出现特异性的条带,说明mAb能与IgG的γ链特异性结合。免疫荧光染色的结果显示,IgG分子在肾小球肾炎的活检组织中表达。结论:获得1株能特异性识别人IgG的mAb,可用于肾脏免疫性疾病的病理诊断。     

抗人DAF单克隆抗体的制备及鉴定

以初步纯化的人红细胞膜ＤＡＦ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,成功地获得３株（ＤＧ３、ＤＧ９和ＤＡ１１）抗人ＤＡＦ单克隆抗体。经间接ＥＬＩＳＡ测定,３株杂交瘤细胞培养上清及腹水的抗体效价分别为１０－３～１０－４及１０－６～１０－７;３株单抗的重链为小鼠ＩｇＧ１亚类,轻链为κ型。结合还原条件下的免疫印迹实验及３株单抗对ＤＡＦ促衰变活性的抑制作用,推测ＤＧ９识别的抗原表位为ＳＣＲ１,而ＤＧ３和ＤＡ１１为ＳＣＲ２至ＳＣＲ４。     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的 表达纯化人博卡病毒( human Bocavirus,HBoV) VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoV VP2蛋白的单克隆抗体.方法 应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定.结果 表达并纯化获得了重组HBoV VP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1∶4×105.结论 利用HBoV VP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价.本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础.     

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

目的表达纯化人博卡病毒（human Bocavirus,HBoV）VP2蛋白,采用杂交瘤方法制备抗HBoVVP2蛋白的单克隆抗体。方法应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白,并用固定化金属亲和层析,纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定。结果表达并纯化获得了重组HBoVVP2蛋白,利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体,抗体效价达到1：4×10^5。结论利用HBoVVP2蛋白免疫制备了单克隆抗体,并具有较高的效价。本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础。     

抗人RKIP单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗人RKIP（hRKIP）的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：自行构建表达人RKIP重组蛋白（reRKIP）,纯化的reRKIP免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用免疫荧光和Western blot鉴定mAb的特异性。结果：成功构建RKIP原核表达载体,转化BL21后可高效表达reRKIP,成功地获得4株（EC1,ED2,ED5和8B3）分泌抗人reRKIP mAb的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞培养上清分泌的mAb在免疫荧光和Westernblot试验中均可与细胞中RKIP蛋白反应。结论：成功地制备了4株抗hRKIP mAb,为进一步研究RKIP生物学功能奠定了基础。