HPV卵黄抗体抑制HPV18 E6基因表达诱导宫颈癌细胞凋亡的研究

目的:评估新型HPV卵黄抗体(HPV-IgY)能否对HPV感染引起的宫颈癌起到预防作用。方法:检测宫颈癌细胞系Hela、Caski中HPV18整合基因的表达情况;检测HPV-IgY对宫颈癌细胞系Caski HPV18 E6蛋白表达以及细胞增殖和凋亡的影响;Western blot法检测p53蛋白表达;通过RNAi技术检测干扰p53后HPV-IgY对Caski细胞增殖和凋亡的影响。结果:宫颈癌Hela、Caski细胞系中HPV18的E6 mRNA和蛋白表达明显高于正常宫颈上皮细胞系HcerEpic。HPV-IgY能明显抑制Caski细胞系的增殖、促进其凋亡,并降低细胞内E6 mRNA和蛋白的表达,促进p53表达。干扰Caski细胞p53后,HPV-IgY对Caski细胞抑制作用减弱。结论:HPV卵黄抗体(HPV-IgY)有明显的抑癌活性,有望成为抗HPV感染及预防宫颈癌的新型药物。     

干扰素α-2b对宫颈癌细胞HPV16 E6E7基因抑制作用的研究

目的研究干扰素α-2b对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用，从细胞生物学及分子生物学水平探讨干扰素α-2b对宫颈癌细胞SiHa的作用机制。应用RT-PCR半定量检测细胞内HPV16 E6E7 mRNA表达，观察干扰素α-2b对宫颈癌SiHa细胞中HPV16 E6E7 mRNA表达的影响。方法以不同浓度的人重组干扰素α-2b含药培养液作用于感染HPV16的人宫颈癌细胞系——SiHa细胞，并设立无药对照，通过MTT及流式细胞分析技术检测该药对细胞生长及增殖的影响；进行细胞凋亡检测并用RT—PCR法半定量检测对HPV16 E6E7基因表达的影响。结果经含有干扰素α-2b的培养液作用后，细胞数量减少，1000IU／ml的干扰素α-2b对细胞抑制作用最强；细胞周期各时相中，S期细胞所占比例明显减少；均可诱导细胞凋亡；均使细胞中HPV16 E6E7mRNA表达明显减少。结论干扰素α-2b不仅可直接抑制宫颈癌细胞的生长，并可能通过抑制HPV16 E6E7基因表达的分子机制，达到抑制肿瘤目的。     

外源性PUMA表达对人乳头瘤病毒阳性宫颈癌放疗敏感性的影响

目的 探讨外源性PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)基因对人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌放疗敏感性的影响.方法 以重组腺病毒为载体,将PUMA基因导入HPV阳性宫颈癌细胞HeLa和caSki.应用MTT法比较携带PUMA的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-PUMA)和携带野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-p53)对HeLa和Caski细胞增殖的影响,平板克隆方法检测Ad-PUMA与X射线联合应用后对细胞生长的影响,并通过DAPI染色、流式细胞检术检测细胞凋亡情况.Western Blot法检测x射线处理后HeLa细胞PUMA表达.结果 (1)Ad-PUMA能够明显抑制HeLa和CaSki细胞增殖,增加细胞凋亡,而Ad-p53对细胞生长无明显抑制作用.(2)X射线能够诱导HeLa细胞PUMA表达升高,具有时间和剂量效应.(3)Ad-PUMA与X射线联合应用后可显著增加细胞凋亡,减少平板克隆形成数,但Ad-PUMA对X射线引起的G2期阻滞无明显影响.结论 PUMA在放射线诱导肿瘤细胞凋亡的过程中发挥作用.Ad-PUMA抑制宫颈癌细胞增殖,诱导细胞凋亡.Ad-PUMA与X射线联合应用后显著提高宫颈癌细胞放疗敏感性.     

HPV16 E6小干扰RNA与宫颈癌细胞中E6 p53 p21关系的研究

目的 探讨HPV16E6小干扰RNA（siRNA）与宫颈癌CaSki细胞中E6、p53、p21之间的关系。方法 2004年9月至2005年3月于四川大学华西第二医院,应用化学合成针对HPV16E6的siRNA借脂质体转染CaSki细胞,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术检测E6siRNA转染前后细胞中HPV16E6、p53、p21mRNA及其蛋白表达的变化。结果 转染24h,E6mRNA的表达显著低于空白组（P〈0.05）。各时间点p53、p21mRNA的表达差异无显著性意义（P〉0.05）。转染48h,E6蛋白表达明显下调,p53、p21蛋白表达相应升高。结论 HPV16E6siRNA能特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复p53蛋白的功能活性。RNA干扰（RNAi）技术可为HPV感染相关性疾病提供一种新的特异性基因治疗方法。     

siRNA对宫颈癌细胞系 HPV16 E6基因的作用

目的 构建并筛选出最有效的HIV16 E6基因特异的小干扰RNA(amall interfering RNA，siRNA)表达载体，观察其对宫颈癌细胞中HIV16 E6基因表达的长期影响，探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制，为临床HIV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法 构建Hairpin siRNA质粒，稳定转染宫颈癌SiHa细胞，鉴定转染细胞中的质粒DNA，通过Real-Time RT-PCR检测细胞中HPV16 E6mRNA表达，采用Westem-blot检测p53、p21等蛋白的变化。MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测SiHa细胞转染siRNA后细胞增殖曲线。结果 HIV16 E6A hairpin siRNA表达载体转染人宫颈癌SiHa细胞，可以在细胞内长期表达siRNA，有效抑制细胞内HIV16 E6基因的表达。E6A siRNA能抑制细胞生长，作用持续达4个月以上。结论 利用siRNA表达载体抑制整合在细胞中的外源HIV E6病毒癌基因可能是治疗HIV感染和宫颈癌的一种新的理想方法。     

HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响

目的:通过载体介导的RNA干扰技术干扰E7癌基因的表达,探讨HPV16E7小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响,以及成为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。方法:利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体、空载体转染CaSki细胞,分别命名为CaSki-S、CaSki-P。通过荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测CaSki、CaSki-S、CaSki-P3种细胞E7mRNA和蛋白的变化,通过流式细胞仪及MTT法检测3种细胞的细胞周期及生长曲线变化,并检测3种细胞在裸鼠体内成瘤性及生长活性的差异。结果:荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测显示,CaSki-S细胞E7基因mRNA和蛋白的表达明显低于CaSki细胞,抑制率分别为92.86%、84.21%。MTT法检测显示,CaSki-S细胞生长明显慢于CaSki细胞。流式细胞仪检测细胞周期显示,CaSki-S细胞与未转染组CaSki细胞比较,G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。裸鼠体内成瘤性及生长活性显示CaSki-S细胞显著低于CaSki细胞。而CaSki-P细胞无论是在E7mRNA和蛋白的表达,还是在肿瘤细胞生长、细胞周期的改变及成瘤性方面都与CaSki细胞无明显差异。结论:HPV16E7siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达,部分逆转其恶性表型。因此它有望成为宫颈癌基因治疗的新策略之一。     

反义HPV16 E6/E7-EGFP重组质粒的构建及其对宫颈癌SiHa细胞的促凋亡作用

目的:构建HPV16早期基因E6/E7的反义重组质粒,探讨其对SiHa细胞的促凋亡作用。方法:将HPV16E6/E7基因片段反向克隆于真核表达载体pEGFP-C1并转染SiHa细胞,用RT-PCR方法检测转染后SiHa细胞E6、E7基因mRNA的表达,West-ernblot方法检测转染后E6/E7蛋白的表达,流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率。结果:成功构建携带HPV16E6/E7基因反义片段的真核表达载体,转染该质粒后,SiHa细胞E6、E7基因的mRNA和蛋白均明显下调;转染后细胞凋亡率为(59.3±11.3)%,明显高于转染空载体组[(9.4±1.8)%]和未转染组[(2.1±0.4)%](P<0.05)。结论:反义HPV16E6/E7基因可下调宫颈癌细胞中E6/E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了实验依据。     

NS-398对宫颈癌细胞系的增殖抑制作用及对survivin基因表达的影响

目的:研究选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对宫颈癌HeLa,SiHa细胞系的增殖、凋亡作用及其对凋亡抑制基因survivin表达的影响。方法:体外培养宫颈癌HeLa,SiHa细胞系,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析不同浓度的NS-398分别作用于HeLa,SiHa细胞系24h、48h后对细胞增殖的作用;流式细胞仪(FCM)检测对细胞凋亡的作用;RT-PCR分析对凋亡抑制基因survivin表达的影响。结果:MTT检测显示,NS-398可抑制宫颈癌HeLa,SiHa细胞系增殖,并有浓度时间依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测提示,NS-398可诱导HeLa,SiHa细胞系凋亡,有浓度依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR分析表明,NS-398可抑制HeLa,SiHa细胞系凋亡抑制基因survivinmRNA表达,与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:NS-398可抑制宫颈癌HeLa,SiHa细胞增殖,诱导凋亡,其机制与抑制凋亡抑制基因survivin mRNA表达有关,为宫颈癌治疗提供了新的靶点和理论依据。     

小檗碱对人宫颈癌细胞生物学行为及裸鼠成瘤的影响

目的:研究小檗碱对人宫颈癌细胞生物学行为及裸鼠成瘤的影响。方法:将不同浓度小檗碱(5、20、40mg/L)作用于HeLa及CaSki细胞,MTT法检测HeLa及CaSki细胞的增殖能力;光学显微镜观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;侵袭及迁移实验研究细胞侵袭和迁移能力;Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax及MMP-9表达。显微镜下观察HeLa及CaSki细胞中NF-κB p65蛋白阳性表达情况并计算阳性表达率。建立宫颈癌裸鼠模型,腹腔给予不同浓度小檗碱(10、30、50mg/L),观察裸鼠肿瘤体积变化及肿瘤组织中Bcl-2、Bax、MMP-9、NF-κB p65阳性表达情况。结果:小檗碱对HeLa及CaSki细胞增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性,细胞抑制率随着作用时间及作用剂量的增加而升高。小檗碱促进HeLa及CaSki细胞凋亡、降低细胞侵袭迁移能力。随着小檗碱浓度增加,HeLa及CaSki细胞内Bax蛋白表达量增加,而Bcl-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白表达量显著降低。小檗碱能明显降低肿瘤体积,且呈剂量依赖性降低Bcl-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白表达,提高Bax蛋白表达。结论:小檗碱能有效抑制宫颈癌增殖及侵袭转移并诱导其发生凋亡,其作用机制可能与降低Bcl-2、MMP-9、NF-κB p65表达及提高Bax表达有关。     

外源性人乳头状瘤病毒16型E7基因对子宫颈癌细胞周期的影响

目的了解外源性人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7基因对子宫颈癌细胞周期的影响。方法从宫颈癌标本中经 PCR 扩增回收 HPV16 E7基因片段,将正确的 E7基因片段插入到穿梭质粒 pAdrTrack-CMV 中,与骨架质粒 pAdEasy-1在大肠埃希菌 Bj5183中同源重组,重组腺病毒质粒转染人胚肾细胞株 HEK-293细胞,包装表达 E7基因的腺病毒,然后转染 HPV18阳性的宫颈癌细胞株HeLa 细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染后 HeLa 细胞的增殖情况,以吸光度(A)值表示;流式细胞仪检测转染前后 HeLa 细胞的细胞周期和细胞周期蛋白 D1表达的变化。结果在 HEK-293细胞中,可以收获高转染效率的腺病毒。在荧光显微镜下,可以观察到 HEK-293细胞和 HeLa 细胞中均有绿色荧光蛋白的表达。提取 HEK-293细胞 RNA,RT-PCR 技术可以检测到 E7基因的表达。MTT 比色法检测结果显示,转染后 HeLa 细胞的 A 值最低为0.38±0.02,最高为0.96±0.01,分别与转染前的0.27±0.03比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,转染12h后,S 期细胞占(36.0±2.0)%,转染24h 后为(49.9±4.2)%,分别与转染前的(26.0±0.4)%比较,差异均有统计学意义(P<0.05);转染前、后细胞周期蛋白 D1阳性表达率分别为22.4%、55.2%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论携带 HPV16 E7基因的腺病毒可转染子宫颈癌 HeLa细胞,并在 HeLa 细胞内表达,HPV16 E7基因的表达进一步影响 HeLa 细胞的细胞周期蛋白的表达,促进 HeLa 细胞增殖,可望用于治疗宫颈癌。     

HPV16 E5蛋白在宫颈癌发生中的作用

人乳头瘤病毒16型（HPV16）与宫颈癌密切相关,编码E5蛋白。HPV16 E5蛋白是一种细胞膜整合蛋白,主要分布于高尔基体和内质网。大量研究证明,HPV16 E5蛋白通过影响表皮生长因子受体信号转导途径及环氧化酶2（COX-2）途径的活性,增加宿主细胞的免疫逃避,调节细胞周期,促进细胞转化、增殖,减少细胞凋亡,促进肿瘤中新生血管的形成等机制影响宫颈癌的发生与发展。就HPV16 E5蛋白的分子生物学特点及与宫颈癌细胞增殖侵袭凋亡关系的研究进展进行综述。     

γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系作用的研究

目的:研究γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系以及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的作用,探讨DAPT临床治疗宫颈癌的可行性。方法:体外培养宫颈癌Siha、HeLa细胞系和HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系(CRL2614)。加入不同浓度的γ-分泌酶抑制剂DAPT,不同时间点终止细胞生长,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色方法检测细胞生长情况;使用流式细胞计数仪检测细胞增殖周期中增殖指数(PI)、S期细胞比例(SPF)和凋亡细胞百分比。结果:应用MTT法检测细胞生长情况,5μmol/L及10μmol/LDAPT作用宫颈癌细胞系72h,可显著抑制其生长(P均0.05)。10μmol/LDAPT对CRL2614细胞系作用72h无抑制作用(P0.05)。流式细胞计数仪检测细胞增殖周期及细胞凋亡百分比。用5μmol/L及10μmol/LDAPT作用宫颈癌细胞系24,48,72h均可见SPF、PI明显降低,凋亡细胞百分比明显增加(P均0.05)。10μmol/LDAPT作用CRL2614细胞系72h对SPF、PI及凋亡细胞百分比无影响(P0.05)。结论:DAPT能抑制宫颈癌HeLa、Siha细胞系增殖,促进肿瘤细胞凋亡,对HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的增殖和凋亡没有明显影响。DAPT可能为药物治疗宫颈癌提供新思路。     

高危型HPV16 E6蛋白表达抑制宫颈癌细胞株p63α表达的研究

目的:探讨高危型HPV16 E6蛋白的表达对宫颈癌细胞株中p63α表达的影响。方法:用RT-PCR法从SiHa中扩增出带酶切位点的HPV16 E6的片段,将HPV16 E6基因片段克隆到p3×flag-CMV-Myc-24真核表达载体上,通过脂质体转染入宫颈癌细胞株后,W estern blot检测p63α的表达。结果:成功构建HPV16 E6真核表达载体,转染至宫颈癌SiHa和Caski细胞株中,p63α均低于对照组。结论:高危型HPV E6能够抑制p63α的表达,提示p63α与HPV E6的相互作用在子宫颈癌发病中发挥重要作用。     

RhoC siRNA对宫颈癌SiHa细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:探讨Ras相似物C(RashomologueC,RhoC)GTP酶对宫颈癌SiHa细胞增殖和转移的影响。方法:以人宫颈癌细胞株SiHa为研究对象,利用RhoC小干扰RNA对RhoC基因进行沉默,RT-PCR和WesternBlot检测转染前后RhoC的表达变化,MTT法比较细胞增殖能力的改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率的改变。基质胶粘附实验比较细胞粘附率的变化,transwell体外侵袭实验比较细胞侵袭能力变化,体外迁移实验比较细胞运动能力的改变。结果:RhoCsiRNA明显下调RhoC基因的表达。RhoC表达下调后,SiHa细胞的增殖能力和凋亡率没有明显变化(P>0.05),SiHa细胞对基质胶的粘附率明显降低(P<0.01),SiHa细胞的体外侵袭能力明显降低(P<0.01),体外迁移能力显著降低(P<0.01)。结论:RhoC明显地促进了宫颈癌SiHa细胞株的体外粘附、侵袭和迁移,但对其增殖和凋亡没有显著作用。提示RhoC在宫颈癌的恶性进展中起重要作用。     

外源性人乳头瘤病毒16型E7癌基因导入对HeLa细胞cdc25A表达的影响

目的:研究HPV16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期调节因子cdc25A mRNA表达的影响,探讨E7癌基因和cdc25A在宫颈癌发生发展中的作用。方法:用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染前后HeLa细胞cdc25A mRNA表达的差异。结果:感染后HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较感染前显著增加(感染前灰度值0.2306±0.0964,感染后0.8739±0.2188,P<0.01)。结论:HPV16E7癌基因促进细胞周期调节因子cdc25A的表达,可能是宫颈癌发病机制中的重要分子事件。     

EXOSC4对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制

目的:探讨EXOSC4在调节宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭方面的作用及机制。方法:通过GEPIA在线数据库分析EXOSC4在宫颈癌中的表达及预后情况,Western blot法检测人宫颈癌细胞株中EXOSC4的表达,设计合成靶向EXOSC4的特异性shRNA,构建稳定低表达EXOSC4的宫颈癌细胞株。Western blot和荧光定量PCR验证干扰效率;CCK-8和细胞克隆形成实验检测各组HeLa细胞的增殖能力;采用流式细胞仪检测细细胞周期;采用细胞划痕和Transwell实验检测HeLa细胞的迁移和侵袭能力,Western blot法检测EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)和Wnt/β-catenin通路相关蛋白(β-catenin、c-Myc、cyclin D1)的表达水平。结果:宫颈癌组织中EXOSC4表达明显高于正常组织,EXOSC4高表达提示预后不良。与HCC94和SiHa细胞系相比,EXOSC4在HeLa细胞中表达量最高。抑制EXOSC4表达可显著降低宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,细胞周期阻滞在G_0/G_1期,上调E-cadherin表达,下调N-cadherin、Vimentin、β-catenin、c-myc和Cyclin-D1表达(均P0.05)。结论:沉默EXOSC4可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭。     

可遗传性表达人乳头瘤病毒18型E6发夹状RNA干扰质粒对宫颈癌细胞生长特性的影响

目的:探讨稳定转染可遗传性表达HPV18E6shRNA质粒对HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞株生长特性的影响。方法:实验组为稳定转染表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2shRNA质粒的宫颈癌Hela细胞株,对照组为稳定转染pSUPER空质粒和未转染质粒的宫颈癌HeLa细胞株。MTS测各组细胞的生长曲线,流式细胞仪检测各组细胞周期的变化和增殖指数;软琼脂细胞培养分析各组细胞集落形成能力。结果:MTS显示pE6-1shRNA组较pE6-2shRNA、空质粒pSUPER组及未转染组的HeLa细胞增殖率低,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测,pE6-1shRNA组G0-G1期细胞数较pE6-2shRNA组增加了12.5%,较未转染的HeLa细胞组增加了13·3%(均P<0.05);pE6-1shRNA组进入S期的细胞数较pE6-2shRNA组减少了9·4%,较未转染的HeLa细胞组减少了8.5%(均P<0.05),G2-M期细胞数在各组差异无显著性(P>0.05)。转染pE6-1shRNA组细胞增殖指数23.7%;而pE6-2shRNA组细胞增殖指数36.1%,未转染组细胞增殖指数36.9%。细胞软琼脂培养2周,pE6-1shRNA组的HeLa细胞的克隆形成率4.2%,较未转染组的HeLa细胞克隆形成率7.2%低(P<0·05,χ2=5.56),也低于转染pE6-2shRNA和pSUPER组(P>0.05)。结论:稳定转染可遗传性表达HPV18E6shRNA质粒的宫颈癌HeLa细胞,其细胞增殖周期和细胞生长受到抑制。     

miR-617在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响

目的:探讨miR-617在宫颈癌组织中的表达及其过表达对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡、迁移等细胞生物学行为的影响。方法:采用实时定量PCR法检测宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织中miR-617表达。宫颈癌SiHa细胞中转染miR-617模拟物使其过表达,采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,平板克隆实验检测细胞克隆形成率,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot法检测靶基因C-末端结合蛋白1(Ct BP1)蛋白表达水平。结果:miR-617在宫颈鳞癌组织中表达下调,过表达miR-617可抑制宫颈癌SiHa细胞增殖,促进SiHa细胞凋亡,抑制SiHa细胞的克隆形成能力,抑制细胞的迁移,过表达miR-617可降低CtBP1蛋白表达。结论:miR-617在宫颈鳞癌中表达下调,可抑制SiHa细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制克隆形成和迁移,其作用机制可能与CtBP1蛋白下调有关。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidine对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用及机制研究

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidine对宫颈癌细胞的杀伤作用和机制。方法:用不同浓度的Apicidine作用于体外培养的宫颈癌细胞株HeLa和正常呼吸道上皮细胞REC;用MTT法检测细胞生长存活率;用流式细胞术(FCM)定量检测细胞凋亡及细胞周期的变化;用RT-PCR法和Western blot法分析Apicidine作用后宫颈癌细胞中p21WAF1和p53表达的变化。结果:Apicidine纳摩尔级浓度即能有效地抑制宫颈癌细胞增殖,对正常细胞无明显抑制效应。FCM结果表明,Apicidine能显著诱导宫颈癌细胞发生凋亡,对正常细胞无明显促凋亡作用;加入2μmol/L Apicidine作用24h和48h后宫颈癌细胞HeLa凋亡率分别为(10.11±0.63)%和(23.28±0.34)%,差异有显著性(P<0.05),正常呼吸道上皮细胞REC凋亡率分别为(5.81±0.92)%和(6.8±0.55)%,差异无显著性(P>0.05);FCM结果亦表明,Apicidine主要引起G0/G1期细胞周期阻滞,1μmol/L Apicidine处理24h后HeLa细胞G0/G1期细胞显著增多,由(46.8±3.2)%增至(69.5±6.1)%,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR和Western blot结果显示,Apici-dine能显著诱导p21WAF1RNA和蛋白水平表达,对p53表达无明显影响。上述结果都呈现明显的量-效与时-效关系。结论:Apicidine在体外能有效地抑制人宫颈癌细胞生长,对人正常细胞无明显影响,其抗肿瘤生长机制之一可能是通过上调p21WAF1蛋白水平和引起G0/G1期细胞周期阻滞实现的。     

一氧化氮与HPV感染的关系及其对子宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨一氧化氮(NO)与HPV感染的关系及其对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响.方法 选择2009年12月1日至2010年8月5日在复旦大学附属妇产科医院宫颈疾病诊疗中心行阴道镜检查的患者115例,应用HPV分型检测试剂盒(可检测21种HPV亚型)进行HPV分型,同时应用Griss法间接检测官颈局部NO含量.在体外培养的宫颈腺癌细胞株HeLa细胞和宫颈鳞癌细胞株Caski细胞中,加入不同浓度(终浓度分别为0.125、0.25、0.5 、1.0及2.0 mmol/L)NO供体--硝普钠(SNP)后培养24 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并应用荧光定量逆转录PCR技术及蛋白印迹法检测SNP处理后细胞中HPVE6、E7 mRNA的表达及p53蛋白的表达.结果 (1)115例患者中,宫颈HPV感染93例,其中高危型50例,低危型43例;无HPV感染22例.115例患者的宫颈局部均检测到NO,其中高危型HPV感染患者的宫颈局部NO含量为(47.6±1.4)μmol/L,低危型HPV感染者为(24.1±1.2)μmol/L,无HPV感染者为(22.8±0.3)μmol/L,高危型HPV感染者高于低危型HPV感染者和无HPV感染者,差异有统计学意义(P＜0.05);而低危型HPV感染者与无HPV感染者比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(2)不同浓度(0.125、0.25、0.5 1.0及2.0 mmol/L)SNP处理HeLa、Caski细胞24 h后,能抑制细胞生长、促进细胞凋亡,当SNP浓度≥1.0 mmol/L时,与SNP处理前比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).1.0 mmol/L的SNP处理24h后,HeLa细胞中HPV18 F6、E7 mRNA的表达水平(分别为19.181±0.360、17.571±0.010)明显低于SNP处理前(分别为27.362±0.191、22.962±0.053;P＜0.05),p53蛋白的表达水平(1.17±0.03)明显高于SNP处理前(0.23±0.05;P＜0.05);但Caski细胞中HPV16E6、E7mRNA和P53蛋白的表达在SNP处理前、后无明显变化(P＞0.05).结论 宫颈局部微环境中NO含量增加与感染高危型HPV有一定的相关性;SNP能抑制宫颈癌细胞的生长,促进其凋亡,降低HPV18 E6、E7 mRNA的表达及活化p53蛋白,其机制可能是宫颈腺癌细胞株HeLa细胞对SNP更敏感.NO释放增加可能是官颈局部微环境清除HPV的免疫机制之一.

Abstract：

Objective To study the relationship between nitric oxide within cervical microenvironment and different HPV types as well as the effect of sodium nitroprusside( SNP), a nitric oxide donor, on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cell lines. Methods HPV typing test was assessed from 115 women by using high-risk HPV (HR-HPV) 21 typing test and the release of cervical nitric oxide(NO) was assessed as nitrate, nitrite in cervical fluid. Cervical NO was then compared between women showing different HPV types. Proliferation of Caski and HeLa cervical cells was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, cell apoptosis was detected by flow cytometry after 24 hours treated by different final concentration of SNP (0. 125,0. 25,0. 5,1.0 and 2. 0 mmol/L, respectively). The expressions of HPV E6,E7 gene mRNA and p53 protein were detected by SYBR Green Ⅰ quantitative real-time PCR and western blot. Results ( 1 ) The cervical NO release of women with HR-HPV was higher compared to that in HPV negative women [ (47. 6 ± 1.4) μmol/L vs ( 22. 8 ± 0. 3 ) μmol/L; P ＜ 0. 05 ]; but there was no statistical difference between low-risk HPV (LR-HPV) group [ (24. 1 ± 1.2 ) μmol/L] and control group (P ＞0. 05 ). (2)After 24 hours treated by different final concentration of SNP, the results shown that SNP could inhibited the proliferation and increased apoptosis rate in Caski and HeLa cells, in which the concentration of SNP ≥ 1.0 mmol/L , there were significantly different ( P ＜ 0. 05 ), while when SNP ≥2. 0mmol/L, the proliferation of cells inhibited seriously. Treated by SNP ( 1.0 mmol/L ) 24 hours, the expressions of HPV18 E6, E7 mRNA in HeLa cells were reduced from 27. 362 ±0. 191,22. 962 ±0. 053 to19. 181 ±0. 360, 17. 571 ±0. 010 and the protein expression of p53 increased from 1. 17 ±0. 03 to 0. 23 ±0. 05, there were statistically significant differences between adding SNP group and the control group ( P ＜0. 05); but there were no statistically significant differences in HPV16 E6, E7 mRNA and that of p53 in Caski cells( P ＞ 0. 05 ). Conclusions The presence of HR-HPV is associated with an increased release of NO in the human uterine cervix; NO could inhibit the growth and proliferation and enhance the apoptosis of cervical cancer cells, inhibit the expression of HPV18 E6, E7 mRNA in HeLa cells and activate the expression of p53 protein, the mechanism may be due to higher sensitivity of HeLa cells (cervical adenocarcinoma cell) to SNP. The increasing release of NO may play a role in regulating the elimination of HPV in cervical microenvironment, which is a part of mucous membrane immunity.