Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的探讨Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响。方法将小鼠胚胎成纤维前脂肪细胞3T3-L1诱导分化为成熟脂肪细胞,随机分为对照组、Adropin组、自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组。对照组细胞不予特殊处理,Adropin组细胞加入Adropin (终浓度为1 000 nmol·L-1),自噬激动剂组加入西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),Adropin+自噬激动剂组细胞加入Adropin(终浓度为1 000 nmol·L-1)和西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),继续培养2 h;采用单丹磺酰尸胺染色检测各组细胞中自噬空泡情况,细胞免疫荧光染色法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)表达,采用Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62及PI3K/AKT通路蛋白PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)的表达。结果与对照组比较,Adropin组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。与对照组比较,自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。Adropin+自噬激动剂组与对照组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。与Adropin组比较,自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。与自噬激动剂组比较,Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。4组细胞中PI3K、AKT蛋白相对表达量两两比较差异均无统计学意义(P> 0. 05)。结论 Adropin可抑制脂肪细胞自噬,其机制可能是通过激活PI3K/AKT通路而实现。     

维生素B12对氧化应激损伤下神经细胞的保护机制

目的：探索维生素B12预处理对H2O2诱导下的神经细胞损伤的保护作用及自噬和凋亡蛋白表达的影响。方法：将大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞（PC12）分为对照组（Control组）RPMI 1640培养、损伤组（H2O2组）RPMI 1640培养并加入200 μmol/L的H2O2刺激,维生素B12保护组（H2O2+VitB12组）RPMI 1640培养加入200 μmol/L维生素B12预处理和200 μmol/L的H2O2刺激。24 h后检测细胞的活性,Western blot和免疫荧光检测凋亡及自噬相关蛋白表达水平。结果：与Control组比较,H2O2组的细胞存活率、细胞DNA复制水平降低,Bcl-2和P62蛋白的表达量下降,Bax、ATG-5和LC3蛋白的表达量明显上升,胞浆内LC3的激活数量上升（均P＜0.05)。与H2O2组比较,H2O2+VitB12组细胞存活率和细胞DNA复制水平上升,Bcl-2和P62蛋白的表达量上升,Bax、ATG-5和LC3蛋白的表达量显著下降,胞浆内LC3的激活数量下降（均P＜0.05)。结论：维生素B12能通过调控自噬抑制氧化应激诱导下的细胞凋亡。     

内质网应激反应蛋白在氧化应激诱导人宫颈癌Hela细胞自噬中的作用

目的：探讨内质网应激反应蛋白在氧化应激诱导人宫颈癌Hela细胞自噬过程中的作用,阐明内质网应激-自噬途径调控肿瘤细胞生存的可能机制。方法：人宫颈癌Hela细胞分为对照组、VK3 (30   μmol•L^-1)组、内质网应激抑制剂牛磺熊去氧酸钠（TUDC ）(500  μmol•L^-1)组和VK3 (30   μmol•L^-1)与TUDC(500  μmol•L^-1)联合作用组。透射电镜观察Hela细胞内质网形态学变化。MTT 法检测细胞生存率。Western blotting法检测内质网应激特征性分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ）的表达水平。结果：对照组细胞形态正常,VK3组细胞浆内可见自噬泡及扩张的内质网。与VK3组比较,VK3与TUDC联合作用组Hela细胞生存率降低（P<0.05）。与对照组比较,VK3组GRP78和LC3-Ⅱ蛋白表达水平均增加（P<0.05）;与VK3组比较,VK3与TUDC联合作用组 GRP78和LC3-Ⅱ蛋白表达水平均降低（P<0.05）。结论：在氧化应激诱导Hela细胞损伤过程中,内质网应激反应蛋白可介导Hela细胞发生自噬。     

远隔缺血预处理分离液对人肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用

目的:研究远隔缺血预处理(RIPC)分离液对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及机制。方法:将HK-2细胞分为时间对照组、H/R、RIPC处理组、自噬干预组。时间对照组细胞在正常条件下培养,RIPC组细胞使用RIPC分离液预处理,自噬干预组细胞在RIPC处理基础上,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3MA),后三组细胞使用三气培养箱进行H/R构建损伤模型。模型成功后使用光学显微镜观察各组细胞状态,应用Western blot观察LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin1蛋白的表达水平。结果:镜下示RIPC分离液可明显减轻H/R对HK-2细胞的损伤,加入自噬抑制剂,RIPC分离液对HK-2细胞H/R损伤的保护作用被阻断。Western blot结果显示,RIPC分离液可使HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达水平增高。Real-time PCR结果显示,与H/R组比,RIPC组LC3及Beclin1的mRNA表达量明显升高;加入自噬抑制剂,HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达降低,L...     

自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤的影响研究

目的 研究自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤(H/RI)的影响,探讨自噬对小鼠睾丸组织缺血再灌注损伤(IRI)的影响。方法 以小鼠精原细胞系GC1 spg为研究对象构建H/RI模型,雷帕霉素(RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别作为自噬激动剂和抑制剂,设置对照组、模型组(H/RI)、自噬激动剂干预组(H/RI+自噬激动剂)、自噬抑制剂干预组(H/RI+自噬抑制剂)。用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞活性氧(ROS)释放水平和凋亡水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞自噬相关基因Beclin1和凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、p62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达水平。结果 与对照组比较,模型组增殖能力、Beclin1和Bcl-2 mRNA表达水平明显下降(P<0.01),p62和Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.01),ROS水平、细胞凋亡率、Bax mRNA相对表达水平明显上升(P<...     

丹参多糖促进自噬抑制脂多糖诱导的心肌细胞凋亡的实验研究

目的 探究丹参多糖(SMP)调控脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞凋亡的机制。方法 不同浓度(0.0.5、1、2mg/mL)SMP预处理乳鼠心肌细胞12h后,1μg/mL LPS刺激乳鼠心肌细胞24h,以LPS单独处理构建心肌细胞损伤模型,对照组加入等量生理盐水,四唑盐比色法(MTT)观察细胞存活率改变,流式细胞仪检测细胞凋亡比率改变,免疫印迹(Western blot)检测各组细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin1及凋亡相关蛋白Bax、Caspase3变化;SMP联合自噬抑制剂氯喹(CQ)或自噬激活剂雷帕霉素靶蛋白抑制剂(Torin1)处理LPS处理的心肌细胞,MTT观察细胞存活率改变,流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡比率改变,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin1及凋亡相关蛋白Bax、Caspase3变化。结果 相比于对照组,LPS 处理乳鼠心肌细胞24h,细胞活力显著下降,凋亡细胞比例升高,凋亡相关蛋白Bax、cleaved-Caspase3表达增多,自噬相关蛋白Beclin1和LC3II表达增多。相比于LPS组,丹参多糖处理组细胞活力升高,凋亡细胞比例下降,Bax、cleaved-Caspase3蛋白表达减少, LC3-II 、Beclin1蛋白表达增多;相比于丹参多糖处理组,CQ抑制细胞活力,增加细胞凋亡数,促进Bax、cleaved-Caspase3和LC3II蛋白表达,抑制Beclin1蛋白表达,Torin1上调细胞活力,减少细胞凋亡数,促进LC3-II 、Beclin1蛋白表达,抑制Bax、cleaved-Caspase3蛋白表达。结论 SMP促进自噬抑制LPS诱导的心肌细胞自噬凋亡。     

Tob1通过诱导自噬抑制肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖促进细胞凋亡的机制研究

目的：探讨Tob1对肾上腺皮质癌细胞自噬的作用及其影响。方法：将体外培养的SW-13细胞分为对照组、空载质粒转染组以及pcDNA3.1-Tob1质粒转染组。实时荧光定量PCR检测各组细胞中Tob1的mRNA表达。Western blot检测Tob1以及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin 1的表达。LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。随后在转染pcDNA3.1-Tob1质粒的SW-13细胞中加入自噬抑制剂3-MA处理,CCK-8检测细胞增殖,Tunel检测细胞凋亡。结果：pcDNA3.1-Tob1质粒转染显著上调SW-13细胞中Tob1的mRNA和蛋白表达,提升LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1水平,降低p62蛋白表达,并显著提升细胞自噬水平(P<0.05)。与对照组相比,pcDNA3.1-Tob1组SW-13细胞增殖降低,细胞凋亡增加;与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞增殖提升,细胞凋亡降低(P<0.05)。结论：Tob1能够通过激活细胞自噬降低人皮质癌细胞SW-13增殖并促进其凋亡。     

氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠大脑皮层星形胶质细胞自噬的影响

目的观察氯胺酮对谷氨酸诱导的大鼠大脑皮层星形胶质细胞自噬的影响。方法取新生大鼠大脑皮层,原代混合培养、分离、纯化获得星形胶质细胞。实验分3个组：对照组（C组,加入D-Hank＇s液）;谷氨酸组（G组,加入谷氨酸至终浓度125μmol/L）;谷氨酸和氯胺酮组（GK组,先加入谷氨酸至终浓度125μmol/L,30 min后加入氯胺酮至终浓度1 mmol/L）。用相差显微镜观察细胞形态变化,免疫荧光染色鉴定细胞种类及LC3蛋白在细胞内的表达,通过Western blot法检测beclin-1、bcl-2、LC3蛋白的表达变化。结果 G组细胞内beclin-1、beclin-1/bcl-2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达较C组上升,bcl-2蛋白表达较C组下降（均P〈0.05）。GK组细胞内beclin-1、beclin-l/bcl-2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达较G组下降,bcl-2蛋白表达较G组上升（均P〈0.05）。结论 125μmol/L谷氨酸能促进星形胶质细胞发生自噬和凋亡,1 mmol/L氯胺酮可抑制谷氨酸诱导星形胶质细胞发生的自噬和凋亡。     

晚期氧化蛋白产物调节人肾小管上皮细胞自噬的研究

目的 探讨晚期氧化蛋白产物(AOPPs)对人肾小管上皮细胞(HK-2)自噬的影响.方法 AOPPs刺激HK-2细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和p62的表达;Western blot检测p38 MAPK通路的激活;加入p38 MAPK抑制剂(SB203580)与AOPPs共处理,观察自噬的改变,加入自噬诱导剂雷帕霉素与AOPPs共处理,并用RT-qPCR和Western blot检测细胞周期抑制蛋白p27的表达,用BCA法检测细胞总蛋白,观察细胞肥大的改变.结果 AOPPs下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1,上调p62的表达,并激活p38 MAPK通路;与AOPPs单独处理组相比,SB203580与AOPPs共处理组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin升高而p62降低;雷帕霉素与AOPPs共处理组p27的表达和细胞总蛋白下调.结论 AOPPs通过激活p38 MAPK通路抑制HK-2细胞自噬,自噬抑制参与HK-2细胞肥大.     

鹦鹉热衣原体Ⅲ型分泌蛋白SINC通过激活MAPK/ERK信号通路促进宿主细胞自噬

目的 探讨鹦鹉热衣原体（Cps）SINC蛋白对宿主细胞自噬的影响,及MAPK/ERK信号通路在其中的调控作用。方法 用重组的SINC蛋白刺激小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7）,Western blot检测LC3-Ⅱ和Beclin-1的水平及ERK1/2的磷酸化程度,并用间接免疫荧光法检测SINC蛋白刺激后细胞LC3的水平,透射电镜检测自噬特殊结构。用50μmol MEK1/2抑制剂U0126预处理RAW 264.7细胞后1 h,再用不同浓度SINC蛋白刺激不同时间,用间接免疫荧光检测LC3的水平,并用Western blot检测LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平。结果 Western blot检测结果显示,以2μg/mL SINC蛋白刺激RAW 264.7细胞12 h时,LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平显著上调,并达到峰值;间接免疫荧光检测发现SINC刺激后可使细胞内LC3荧光斑点数明显增多,透射电镜下可见更多的自噬小体和自噬溶酶体。2μg/mL SINC蛋白刺激RAW 264.7细胞15 min时p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调;加入抑制剂U0126后,LC3...     

大黄素对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞自噬的影响

目的 基于cGAS/STING信号通路研究大黄素对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)自噬的潜在作用。方法 采用CCK-8法检测MH7A细胞增殖的结果,并根据细胞存活率筛选出药物的浓度,并加入自噬抑制剂3-MA进一步验证大黄素对自噬的影响;采用MDC法检测MH7A细胞自噬情况;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测cGAS、STING、p-STING、LC3-I、LC3-II、P62和Beclin-1的蛋白表达水平。结果 MDC染色结果提示,大黄素能够增强MH7A细胞自噬;Western blot结果提示,大黄素可降低MH7A细胞自噬相关蛋白cGAS、STING、p-STING和P62的表达,增加LC3-II和Beclin-1的表达。加入自噬抑制剂3-MA后,MH7A细胞P62蛋白表达升高,LC3-II和Beclin-1蛋白表达降低。结论 大黄素可能通过下调cGAS/STING信号通路加速自噬,抑制MH7A细胞增殖。     

苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬的作用与机制

目的探讨苦参碱对肝癌HepG2细胞自噬的作用,进一步研究苦参碱诱导HepG2细胞自噬的机制。方法将0.0（对照组）、0.4、0.8、1.6g·L-1苦参碱及0.4g·L-1苦参碱+10mmol·L-1自噬特异抑制剂（3-MA）分别作用于肝癌HepG2细胞,构建体外模型。采用免疫印迹法（Western blotting）检测自噬基因LC3-Ⅱ的表达,实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）检测自噬基因WIPI1的表达,Annexin V FITC-PI流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率,电镜观察HepG2细胞自噬体变化与凋亡情况。结果 0.4、0.8、1.6g·L-1苦参碱作用的HepG2细胞LC3-Ⅱ表达相比对照组均显著增加（P<0.05）,其中0.4g·L-1苦参碱作用的HepG2细胞LC3-Ⅱ表达水平最高;0.4g·L-1苦参碱作用的HepG2细胞自噬体、WIPI1mRNA表达水平较对照组明显增加（P<0.05）。0.4g·L-1苦参碱联合3-MA作用的HepG2细胞凋亡率较单纯0.4g·L-1苦参碱作用的凋亡率显著增加（P<0.05）。结论苦参碱诱导HepG2自噬且减少细胞凋亡,与WIPI1的表达相关。自噬抑制剂可抑制苦参碱诱导的自噬,促进肝癌细胞凋亡,二者联合可成为临床治疗肝癌的新措施。     

芹菜素通过AMPK/mTOR通路调控肺癌A549细胞自噬

目的 探讨芹菜素（APG）对肺癌A549细胞增殖及自噬的影响及其与AMPK/mTOR通路的关系。方法 体外培养肺癌A549细胞,采用CCK-8法检测不同浓度芹菜素处理A549细胞不同时间后对细胞增殖的影响。后续实验分为空白对照组(0 μmol/L APG),低、中、高浓度实验组和抑制剂组5组,采用MDC染色法检测各组对细胞自噬的影响,免疫印迹法检测自噬相关蛋白以及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达情况。结果 芹菜素可显著抑制A549细胞增殖,且呈浓度依赖性（P<0.05）;20、40、80 μmol/L芹菜素组随作用时间延长,对A549细胞的增殖抑制率逐渐增加,呈时间依赖关系（P<0.05）。与空白对照组比较,实验组A549细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡数量及IOD值逐渐增加（P<0.05）,芹菜素可浓度依赖性上调LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值（P<0.05）,下调p-mTOR、p62蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值（P<0.05）。与高浓度实验组比较,抑制剂组细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡减少,IOD值下降,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值降低,而P62、p-mTOR蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值升高（P<0.05）。结论 芹菜素能抑制肺癌A549细胞增殖,诱导其自噬,作用机制可能与AMPK/mTOR通路有关     

丹参酮ⅡA在体外对海马神经元细胞放射性损伤的保护作用

目的探讨丹参酮ⅡA在体外对海马神经元细胞放射性损伤的影响,以及其在放射性损伤保护过程中的相关机制。方法体外培养海马神经元细胞株HT-22,实验分为对照组(Control)、照射组(RT)、照射+丹参酮ⅡA处理组(RT+Tan)、照射+丹参酮ⅡA+自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)处理组(RT+Tan+3-MA)。采用MTT法检测各组细胞的存活分数,流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot检测自噬相关蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ的表达水平。结果照射后海马神经元细胞存活分数下降,而丹参酮ⅡA能提高放射线照射后海马神经元细胞的存活分数,并减少细胞凋亡。相对于单纯照射组,RT+Tan组的海马神经元细胞HT-22的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达上升。而加入自噬抑制剂3-MA后,放射处理后的海马神经元细胞LC3蛋白表达下降,且存活分数明显下降。结论丹参酮ⅡA能明显减轻放射线在体外对海马神经元细胞的放射损伤作用,其保护机制可能与调节放疗过程中自噬相关。     

阿伐他汀通过PI3K/Akt/mTOR途径调节白血病细胞自噬的作用及机制

目的:研究阿伐他汀对白血病细胞K562自噬的影响及相关信号机制。方法:取对数生长期的K562细胞,分为阴性对照组、阿伐他汀组、阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组、阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组。共培养24h后,采用吖啶橙染色观察细胞自噬体的变化,Western Blot检测Ⅱ型自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅱ)和自噬血管基因Beclin-1的表达,RT-PCR和Western Blot检测磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达。结果:与阴性对照组相比,阿伐他汀抑制白血病细胞K562自噬体的形成(P<0.05),下调LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达(P<0.05)。与阿伐他汀组相比,阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达增加(P<0.05);阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达增加(P<0.05)。与阿伐他汀组相比,阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组p-Akt和p-mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05);阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组p-Akt和p-mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论:阿伐他汀可以抑制白血病细胞K562自噬,推测其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

苦参碱对结肠癌耐药细胞化疗药物敏感性及自噬水平的影响

目的探讨苦参碱对结肠癌耐药细胞化疗药物敏感性及自噬水平的影响。方法分别采用浓度为0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml苦参碱作用于结肠癌细胞HCT-8/VCR,分别在24 h、48 h,采用CCK-8法检测苦参碱对结肠癌细胞HCT-8及其耐药细胞HCT-8/VCR的抑制作用,并计算出抑制率;运用Western Blotting检测自噬相关基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表达。采用流式细胞术检测苦参碱作用耐药细胞后的细胞凋亡率。结果在苦参碱作用24 h和48 h后,HCT-8细胞增殖的抑制作用随着苦参碱浓度的增加而增强,苦参碱对HCT-8细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.001)。对各组细胞的凋亡率检测发现,采用苦参碱的实验组的细胞凋亡率大大高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。在苦参碱应用24 h后,HCT-8/VCR细胞质中出现了自噬泡。Western Blotting检测显示随着苦参碱浓度的增加,P62、Beclin-1、LC3蛋白的表达水平也随之增强。结论苦参碱能够提高结肠癌耐药细胞的自噬水平,逆转结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR的多药耐药性,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

高糖条件下沉默LRP6通过Wnt/β-catenin途径抑制大鼠视网膜Müller细胞的自噬与凋亡

目的:探究在高糖作用下大鼠视网膜Müller细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达及其对高糖条件诱导的Müller细胞自噬与凋亡的作用和机制。方法:体外培养大鼠视网膜Müller细胞,采用RT-PCR与Western blotting检测高糖条件下Müller细胞中LRP6 mRNA和蛋白的表达水平;利用siRNA干扰技术沉默Müller细胞中的LRP6,并分别在葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^-1(NG)与35 mmol·L^-1的DMEM培养液(HG)中进行培养,按处理方式的不同将Müller细胞分为葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^-1的DMEM培养的正常葡萄糖组(NG组)、葡萄糖浓度为35 mmol·L^-1的DMEM培养的转染si-NC组(HG+si-NC组)和si-LRP6的Müller细胞组(HG+si-LRP6组);采用Western blotting检测各组Müller细胞中自噬相关蛋白P62的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ之值、Beclin1与Atg12-Atg5复合体的表达;共...     

雷公藤内酯醇抑制白血病干细胞自我更新的研究

目的:检测在雷公藤内酯醇作用下,白血病干细胞的NANOG、β-catenin和OCT-4蛋白表达的水平,从抑制白血病干细胞细胞自我更新方面探讨其机制。方法:首先使用免疫磁珠法进行分选白血病干细胞。实验共设4组,分为:对照组、雷公藤内酯醇3个浓度(低中高)组。4个组均加入K562/A02细胞悬液100μL,对照组加入RPMI1640培养液100μL,雷公藤内酯醇低中高浓度组终浓度分别为10、50、100ng/mL。进行各组细胞增殖率的检测、并采用蛋白印迹法检测各组细胞NANOG、β-catenin和OCT-4蛋白的表达水平。结果:对各组细胞增殖率检测结果显示,3个不同浓度雷公藤内酯醇组,处理24h后都可以观察到K562/A02干细胞增殖受抑,并呈浓度依赖性。与对照组比较,3个不同浓度雷公藤内酯醇度组的β-catenin蛋白表达水平降低,且与对照组间存在统计学差异(P0.05)。中剂量组中OCT-4蛋白表达水平较对照组有统计学差异,而NANOG蛋白的表达在这4个组中,没发现显著差异。结论:中剂量组的雷公藤内酯醇能够调控β-catenin/OCT-4蛋白表达水平,表明该浓度剂量对抑制白血病干细胞自我更新作用最强;而试验中发现的其具有抑制白血病干细胞增殖的浓度依赖性,表明白血病干细胞受到高浓度雷公藤内酯醇抑制可能存在其他机制。     

黄芪甲苷通过激活自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡

目的研究黄芪甲苷通过激活细胞自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导PC12细胞凋亡的作用。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为7组:正常对照组、模型组、溶媒组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组、自噬激活剂组。除正常对照组外,其余各组剥夺氧、糖3h后再复氧、复糖12 h,并于复氧、复糖的同时给予相应药物处理。用透射电镜观察自噬小体的变化,Western blot检测LC3-II、Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡。结果与正常对照组相比,模型组出现典型的自噬小体,LC3-II、Beclin1表达均增多(P0.05),同时Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数也升高(P0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷组、自噬激活剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均增多(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均下降(P0.05);而自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05);溶媒组与模型组之间无显著差异(P0.05)。与黄芪甲苷组相比,黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均升高(P0.05)。结论黄芪甲苷可通过激活细胞自噬而抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。     

脂多糖通过p38/MAPK通路对巨噬细胞自噬的调控作用

摘 要:【目的】 观察脂多糖(LPS)对巨噬细胞自噬的影响及p38/MAPK通路在其中的作用?【方法】 体外培养巨噬细胞株RAW264.7,分为对照组?饥饿状态激活自噬组?单纯LPS刺激组?LPS+P38抑制剂(SB203582)组和LPS+mTOR抑制剂(rapamycin)组?将前期构建的载体pcDNA3.1-GFP-LC3,转染RAW264.7,通过荧光显微镜观察各组细胞中自噬体形成情况?qRT-PCR方法检测各组中与细胞自噬相关的基因Atg5,Atg7,LC3-Ⅱ和Bnip3 mRNA表达水平的改变?利用Western blotting检测LC3-Ⅱ?p-P38?P38蛋白在各组中的表达情况,以评价LPS激活巨噬细胞自噬过程中p38/MAPK通路的作用?【结果】 在荧光显微镜下可以观察到自噬在饥饿状态组?LPS+SB203582组和LPS+rapamycin组有明显增强;qRT-PCR检测到自噬相关基因Atg5,Atg7,LC3-Ⅱ,和Bnip3 mRNA的表达在饥饿状态组?LPS+SB203582组和LPS+rapamycin组有明显增强;Western blotting 检测发现p-P38在饥饿状态组?LPS组和LPS+rapamycin组中表达明显升高; LC3-Ⅱ的表达在饥饿状态组?LPS+SB203582组和LPS+rapamycin组中表达要高于对照组和LPS组?【结论】 LPS参与巨噬细胞自噬的调控,除经典mTOR通路之外,p38/MAPK通路是其抑制通路之一?