内皮祖细胞的研究进展

出生后骨髓中存在着一群祖细胞能够迁移到外周循环中,并且可以分化为成熟的内皮细胞,这一群细胞被定义为内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs).在胚胎发育的过程中,EPCs参与了最初的血管形成(vasculogenesis).     

下肢缺血及G-CSF促进小鼠外周血内皮祖细胞动员

目的：观察下肢缺血以及腹腔注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对小鼠外周血内皮祖细胞（EPCs）的影响。 方法： 建立小鼠下肢缺血模型，双色荧光标记流式细胞技术检测缺血状态下外周血内皮祖细胞的变化，同时给予G-CSF后观察对EPCs的影响。 结果： 下肢缺血后，外周血中反映EPCs变化的CD34和VEGFR2双荧光阳性细胞比例轻度增加，在缺血基础上同时给予G-CSF，上述变化更明显。 结论： 下肢缺血刺激可以使外周血内皮祖细胞数量增加，G-CSF通过骨髓动员可增强这种效应。     

肝细胞生长因子对冠心病患者外周血内皮祖细胞迁移、粘附功能的影响

目的 观察肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）对体外培养的冠心病（coronary heart disease,CHD）患者外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）生物学功能的影响,为CHD患者应用HGF治疗提供基础.方法 选择CHD患者（CHD组）和非CHD患者（对照组）各30例,每组再随机分为重组人HGF（rhHGF）干预组和非rhHGF干预组,ELISA法检测血浆中HGF含量.收集CHD患者外周血单个核细胞,流式细胞仪检测EPCs数量,并体外选择培养EPCs,分别用MTT法、Transwell小室、黏附测定实验检测rhHGF对EPCs增殖、迁移和粘附能力的影响.结果 与对照组相比,CHD组患者外周血EPCs数量显著减少,血浆HGF含量显著升高（P＜0.01）;CHD组患者EPCs增殖、黏附和迁移能力明显下降（P＜0.05）.rhHGF干预组能明显促进CHD患者EPCs增殖、黏附和迁移能力;在非CHD组,rhHGF仅促进非CHD患者EPCs增殖,对黏附和迁移虽有改善,但差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 CHD患者EPCs的增殖、迁移和粘附等生物学功能在HGF的刺激下可明显增强,有望将HGF应用于CHD的治疗.     

双顺反子表达人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白重组病毒的构建及其在内皮祖细胞中表达

目的 构建双顺反子表达人组织因子途径抑制因子（TFPI）与绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒表达载体pMSCV-TFPI-IRES-GFP,并观察其在大鼠内皮祖细胞（EPCs）中的表达,为进一步研究TEPI在预防血管再狭窄中的作用奠定基础.方法 将人全长TFPI cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pMSCV-IRES-GFP中,获得定向插入重组子pMSCV-TFPI-IRES-GFP,采用酶切图谱分析和测序进行鉴定.用磷酸钙法经293T细胞包装,收集病毒上清,感染EPCs.用荧光显微镜和流式细胞术观察感染后细胞内GFP表达情况.RT-PCR检测EPCs中TFPI mRNA的表达水平,ELISA法检测EPCs细胞培养上清中TFPI蛋白的含量.结果 经限制性内切酶酶切图谱分析证实重组病毒中含有人TFPI的cDNA片段,基因测序结果与Genebank中TFPI cDNA序列相符.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示,90%以上的感染细胞中存在GFP表达;RT-PCR分析显示,重组病毒感染细胞中TFPI mRNA水平明显增高;ELISA法检测发现,感染重组病毒的EPCs培养上清中有TFPI蛋白表达.结论 本研究成功构建重组pMSCV-TFPI-IRES-GFP真核表达载体,其在EPCs中能够同时表达TFPI和GFP,为TFPI基因结合血管内皮祖细胞进行血管再狭窄防治研究的进一步深入开展奠定了良好实验基础.     

内皮祖细胞移植治疗心血管疾病的新策略:基因修饰

1997年Asahara等首次从外周血CD34^＋细胞中分离到内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）后。围绕EPCs的研究便迅速展开和深入。近年来，基因修饰EPCs移植在以往EPCs移植治疗心血管疾病的研究取得一定成效的基础上得到发展，并初步展现了美好的应用前景。     

内皮祖细胞移植对血管内膜修复的影响

目的： 从脾源性单个核细胞中分离并扩增血管内皮祖细胞（EPCs）,研究EPCs移植对血管损伤后内膜修复的影响。 方法: 大鼠脾源性单个核细胞贴壁培养法定向扩增EPCs，检测其内皮细胞特性。荧光标记EPCs从尾静脉移植到颈动脉内皮损伤的大鼠体内。 结果: 脾源性单个核细胞体外可诱导出内皮祖细胞，表现为表达内皮细胞特异性标志。移植后，EPCs可归巢至血管损伤部位。EPCs移植组在球囊损伤2周后血管新生内膜明显减少，血管腔狭窄程度显著减轻。EPCs移植组新生内膜/中膜比值显著低于单纯球囊损伤组及M199组(0.82±0.09 vs 1.52±0.21, 1.48±0.19,P＜0.01)。EPCs移植组PCNA 阳性表达细胞明显少于单纯球囊损伤组及M199组（19.25±3.96 vs 31.42±5.23, 29.37±3.16, P＜0.05）。 结论: EPCs能有效移植到内皮损伤血管段，参与损伤血管的内膜修复过程。     

川芎嗪对自体移植内皮祖细胞修复兔受损腹主动脉内膜的影响

目的通过在体实验研究川芎嗪对内皮祖细胞（EPCs）修复球囊损伤后的兔腹主动脉的影响,探讨更好的损伤性血管修复的方法。方法密度梯度离心法分离兔外周血单个核细胞,以EBM-2培养基培养7d,获得兔外周血内皮祖细胞,应用2．5F球囊导管造成兔腹主动脉去内皮损伤模型。将实验兔分为三组,每组6只,对照组使用生理盐水,EPCs组只使用EPCs,EPCs＋川芎嗪组注射EPCs及川芎嗪,术后14d处死动物,并测量各组内膜损伤血管再生内皮覆盖率和新生内膜增生程度。结果EPCs＋川芎嗪组新生内膜／中膜厚度明显低于EPCs组,新生内膜面积明显高于EPCs组,两组均与对照组相比差异有统计学意义。结论EPCs可促进受损血管内膜修复,川芎嗪具有增强EPCs修复血管内膜的作用。     

红景天苷对内皮祖细胞功能及其PI3K/Akt通路的影响

 目的：研究红景天苷对人内皮祖细胞（EPCs）功能及其对磷酸肌醇3羟基激酶（PI3K）/Akt通路的影响。方法：体外培养正常人外周血EPCs,观察红景天苷或PI3K抑制剂的干预对EPCs增殖、黏附、迁移及一氧化氮（NO）分泌量的影响。MTT法检测细胞增殖、Western blotting检测Akt蛋白表达。结果：与对照组比较, 红景天苷能促进EPCs的增殖、黏附及迁移功能（P<0.05）,促进EPCs分泌NO,增加细胞内磷酸化Akt蛋白的水平。但这些作用均被PI3K抑制剂LY294002抑制（P<0.05）。结论：红景天苷通过PI3K/Akt通路调节EPCs的功能。     

人外周血来源内皮祖细胞诱导分化为心肌样细胞的实验研究及机制探讨

目的： 研究人外周血来源内皮祖细胞（EPCs）在体外定向分化为心肌样细胞的能力及其可能机制。方法： 分离培养及鉴定健康人群（对照组）及冠心病（CAD）患者（实验组）EPCs。将对照组及实验组EPCs分别分成3组在体外进行分化诱导实验：A组 EPCs与乳鼠心肌共培养；B组 EPCs与多聚甲醛固定后的乳鼠心肌共培养；C组 于EPCs中加入收集到的乳鼠心肌培养液上清诱导培养。观察心肌样细胞形态变化;2周后免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白 （cTnT）和结蛋白（desmin）的表达；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌相关基因ANP、cTnT、cTnI和主要组织相容性复合物α链（αMHC）的表达；流式细胞仪检测HLA-DR和人desmin的表达，计数desmin阳性表达细胞。结果： 实验及对照A、B组EPCs均可呈现心肌样细胞形态;ANP、cTnT、cTnI和αMHC基因及cTnT和desmin蛋白均呈阳性表达；流式检测HLA-DR及desmin呈双阳性表达，对照A组分化率为（9±2）％，实验A组分化率约为（4±1）％，差异显著（P<0.01）。实验及对照C组EPCs形态未发生变化，各项检测指标均为阴性表达。结论： 与乳鼠心肌共培养可诱导人外周血来源EPCs分化为心肌样细胞，且其可能机制为细胞间的直接接触。     

皮肤来源间充质干细胞对内皮祖细胞募集效应的体外观察

目的细胞的募集趋化与归巢被认为是间充质干细胞（MSCs）修复重建受损组织的重要机制,本研究拟通过体外实验观察皮肤来源间充质干细胞对在血管化中发挥重要作用的内皮祖细胞（EPCs）的募集效应。方法分离与培养胎鼠皮肤MSCs和大鼠EPCs,利用免疫组织化学法,分别检测二者的SDF-1与CXCR4表达;并利用体外迁移实验,观察MSCs是否影响EPCs的迁移。结果利用免疫组织化学检测,MSCs和EPCs可以分别表达SDF-1与CXCR4;利用双室培养系统发现,MSCs可明显促进EPCs的迁移,且阻断SDF-1表达后,这种促进效应得到抑制（P〈0.05）。结论体外实验证实了MSCs可以促进EPCs的募集趋化。     

红细胞生成素对慢性肾衰竭大鼠外周血内皮祖细胞SDF-1及其受体表达的影响*

 目的：观察红细胞生成素（EPO）对慢性肾衰竭（CRF）大鼠外周血内皮祖细胞（EPCs）归巢因子表达的影响。方法：采用分阶段5/6肾切除制备大鼠CRF模型。实验动物随机分为3组：假手术组、CRF组和EPO治疗组。从第3周开始,治疗组大鼠每次皮下注射重组人EPO 50 U/kg,每周3次,共6周。8周时取其外周血分离与培养EPCs,并检测EPCs的功能。采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测外周血EPCs基质细胞衍生因子1 （SDF-1）及其受体（CXCR4）、EPO及其受体（EPOR）mRNA和蛋白的表达。结果：与CRF组比较,EPO治疗可上调外周血EPCs中SDF-1和CXCR4 mRNA及蛋白的表达（均P<0.05）;此外,EPO还可上调CRF大鼠外周血EPCs的 EPO及EPOR mRNA和蛋白的表达（均P<0.05）。结论：EPO对慢性肾衰竭大鼠外周血EPCs的动员可能与其增加外周血EPCs的 SDF-1及其受体表达有关。     

内皮祖细胞在糖尿病血管病变中的作用及干预治疗

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞,它与出生后的血管形成密切相关,具有重要的病理生理学意义。近年的研究显示EPCs功能受损和数量减少在糖尿病血管病变发生的机制中扮演着重要角色。从单个核细胞移植、内源性EPCs的动员活化以及EPCs的基因修饰这几个方面进行研究,为糖尿病血管病变治疗提供了新思路。本文就EPCs的生物学特性及其与糖尿病血管病变的关系以及内皮祖细胞对糖尿病血管病变治疗的展望进行综述。     

1种新来源的内皮祖细胞提取分离方法

目的探索1种新来源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的提取分离方法,以增加EPCs细胞数量、提高增殖活性。方法拟从胎鼠肺提取分离培养EPCs,分别从形态学、表面标志物、吞噬功能和体外管腔形成等方面验证所提取细胞为EPCs。同时将其与骨髓中提取的内皮祖细胞的细胞增殖活力进行比较。结果从胎鼠肺提取分离培养的细胞,其形态特征与EPCs一致,细胞表达CD31、CD34、CD133、VEGFR2等EPCs特异标志物,可同时吞噬Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1;体外可形成管腔样结构,功能上符合EPCs的表现。胎鼠肺提取的细胞增殖活力明显高于传统从骨髓提取的EPCs。结论胎鼠肺中可提取出数量和质量较好的EPCs,为进一步实验提供可靠的细胞来源。     

稳定性心绞痛患者内皮祖细胞与侧支循环之间的关系探讨

目的： 探讨稳定性心绞痛(SAP)冠状动脉有重度狭窄或完全闭塞患者循环内皮祖细胞（EPCs）与侧支循环的关系。 方法: 将2006年3月至2007年8月期间入院的稳定性心绞痛患者，经冠状动脉造影检查冠脉有重度狭窄或完全闭塞的，将其侧支循环根据Rentrop分级分为0、1、2、3级，Rentrop分级≥2级者归为侧支循环良好组（Coll＋组,n=15),≤1级者归为侧支循环不良组（Coll-组,n =15）,共2组。经造影导管抽取血样标本，分离培养单个核细胞。激光共聚焦显微镜鉴定Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）和FITC标记的荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)双染色阳性细胞为正在分化的EPCs，并计数。采用改良的Boyden小室和MTT法分别测定其迁移能力及增殖能力。 结果: Coll+组内皮祖细胞数量(60.9±9.6)EPCs/视野(×400)显著高于Coll-组（31.0±4.1）EPCs/视野,P﹤0.01,其迁移能力和增殖能力也明显强于Coll-组（P<0.01），相关性分析显示EPCs的数量、迁移能力和增殖能力与侧支循环程度呈正相关。 结论: 本研究显示了稳定性心绞痛患者循环内皮祖细胞与侧支循环的形成之间存在着关联性。     

内皮祖细胞与肿瘤血管新生

血管内皮祖细胞（EPCs）是内皮细胞的前体细胞,特异性表达CD34,CD133和VEGFR-2,具有向血管内皮细胞分化的潜能。EPCs主要位于骨髓和外周血。肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管新生。肿瘤细胞可合成和释放多种细胞因子,在不同因子的趋化作用下EPCs从骨髓动员至外周血循环,然后迁移和定居到肿瘤组织,经细胞因子诱导分化为成熟内皮细胞,参与肿瘤血管新生。VEGF/VEGFR-2信号途径在EPCs参与的肿瘤血管新生方面起重要作用。     

血管内皮生长因子对外周血内皮祖细胞功能的影响

目的: 观察不同浓度血管内皮生长因子(VEGF）对体外培养人外周血内皮祖细胞（EPCs）生物学功能的影响，探讨VEGF促进EPCs分裂生长的合适浓度。方法: 密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞（MNCs），接种至人纤维连接蛋白（HFN）包被的培养板上，培养4 d后收集贴壁细胞，换用配有不同浓度（对照组、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L）VEGF的培养基继续培养3 d后进行细胞免疫组化鉴定EPCs，采用MTT比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验，观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力。结果: 从人外周血能成功分离EPCs细胞，并能分化为血管内皮细胞；从冠心病患者分离的EPCs增殖能力较非冠心病患者弱；VEGF在较低浓度（10 μg/L和20 μg/L）时即能显著促进EPCs生长的各项生物学指标，但高浓度（50 μg/L）时并不能进一步增强这一效应；低浓度（10 μg/L）下VEGF对冠心病患者作用较非冠心病患者弱，高浓度时对两者促进作用相近。结论: 冠心病患者EPCs功能显著减弱，较低浓度的VEGF即可显著增强EPCs的各项生物学功能，可能对损伤血管的再内皮化有益。     

尿酸对外周血内皮祖细胞数量与功能的影响

目的：观察尿酸对外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）数量与功能的影响。方法:采用Ficoll密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞,将其接种于包被人纤维连接蛋白的培养板上,培养14 d后收集贴壁细胞,加入不同浓度(50 mg/L,150 mg/L,300 mg/L)尿酸分别培养24 h、48 h、72 h。激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I 和Dil-acLDL 双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,并在倒置荧光显微镜下计数。然后分别采用MTT 比色法、黏附能力测定实验来观察EPCs 的增殖能力、黏附能力。结果:尿酸呈量效和时效地增加EPCs 数量，300 mg/L尿酸作用48 h后EPCs数量明显多于对照组（32.5±3.6 vs 78.2±4.1，P< 0.01），并增加EPCs增殖能力（0.179±0.005） vs （0.322±0.011）, P< 0.01，和黏附能力（20.5±3.7） vs （67.8±4.9）, P< 0.01。结论:尿酸可增加EPCs 数量并改善EPCs的增殖及黏附能力。     

内皮祖细胞在血管新生及血管组织工程化过程中的生物学意义

内皮祖细胞(EPCs)是能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞,参与了出生后的血管再生和受损内皮的修复过程。近年来围绕以EPCs作为种子细胞来促进血管新生、维持内皮功能完整并构建组织工程化血管方面展开了许多研究。本文就这方面的进展作一综述。     

内皮祖细胞在体外培养成血管样结构的初步观察

目的：探索体外培养脐血、外周血内皮祖细胞（EPCs）的方法，观察其形成血管样结构的可能性及条件。 方法： 采用贴壁选择法培养人脐血及兔外周血内皮祖细胞，光镜下观察细胞形态，用荧光显微镜、流式细胞仪分析贴壁细胞CD34、VEGFR-2、AC133、血管内皮钙粘素（VE-cadherin）的表达，DiI-ac-LDL 吞噬试验及Ⅷ因子免疫组化证实细胞属性。 结果： 体外成功培养出人脐血及兔外周血内皮祖细胞，形成条索状、管状结构，兔外周血EPCs分化较成熟，形成典型铺路石形状及血管样结构。 结论： 脐血、兔外周血内皮祖细胞可在体外培养成功并表现成血管倾向，可能是血管组织工程的潜在资源。     

内皮祖细胞移植对肺动脉高压大鼠一氧化氮、内皮素的影响

目的研究同种异体内皮祖细胞（EPCs）移植对野百合碱（monocrotaline,MCT）所致肺动脉高压（Pulmonary Artery Hypertensinn,PAH）大鼠的影响,并观察肺动脉血一氧化氮（NO）、内皮素（ET）的变化,探讨其治疗PAH的机制。方法体外培养并鉴定大鼠EPCs,MCT诱发肺动脉高压模型组由尾静脉注入标记的EPCs。在移植EPCs后第21天,测定肺血流动力学参数,计算平均肺动脉压（mPAP）,分别用硝酸还原酶法,放射免疫法测定NO及ET-1值。结果与模型组（29．33±3．01）mm—Hg相比,EPCs治疗组（21．89±2．69）mmHg平均肺动脉压明显下降,肺动脉血的NO值明显增加,（49．28±5．31 vs 21．64±3．06）μmol／L（P〈0．05）,ET-1值由（354．40±36．35）pg／ml降至（259．20±29．08）pg／ml（P〈0．05）。结论同种异体EPCs移植可有效降低肺动脉压力,作用机制可能与其分化为血管内皮细胞,修复损伤的肺血管内皮,调节NO与ET-1的含量有关。