小剂量高三尖杉酯碱对K562细胞端粒酶活性及其分化的影响

以往的研究认为高三尖杉酯碱(HHT)主要通过抑制蛋白质合成或诱导白血病细胞凋亡发挥抗肿瘤作用.我们以K562细胞为对象,研究小剂量HHT对白血病细胞端粒酶活性的影响及作用机制.     

小剂量高三尖杉酯碱对K62细胞端粒酶活性及其分化的影响

以往的研究认为高三尖杉酯碱 (HHT)主要通过抑制蛋白质合成或诱导白血病细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。我们以K5 6 2细胞为对象 ,研究小剂量HHT对白血病细胞端粒酶活性的影响及作用机制。材料和方法1　主要试剂　TRIzol、M MLV和RPMI 16 4 0均为Gibco/BRL公司产品。TaqDNA聚合酶为Promega公司产品。引物均由上海Sangon公司合成。HHT购自杭州民生药厂 ,原液浓度 1mg/ml。牛血红蛋白纯品及Benzidine HCl为Sigma公司产品。2　细胞培养　K5 6 2细胞株引自中国科学院上海细胞研究所 ,置于含 10 %胎牛血清的RPMI 16 4 0培养体系中 ,于 …     

高三尖杉酯碱启动白血病细胞凋亡的比较蛋白质组学研究

目的：解码高三尖杉酯碱(HHT)启动白血病细胞凋亡相关蛋白。方法：在建立HHT启动HL-60细胞早期凋亡模型的基础上，分别提取未用和经HHT作用的HL-60细胞总蛋白，构建其相应的双向电泳图谱，应用图像扫描仪及图像分析软件获得差异蛋白斑点的信息，运用MALDI-TOF-MS分析呈显著性差异的蛋白斑点，将检测出的肽链质量输入蛋白质数据库获得差异蛋白质信息。结果：MHCI类抗原分子、钙结合蛋白D-28K、氯通道蛋白6、癌蛋白OP18、锌指蛋白HELIOS和凋亡抑制物样蛋白2与HHT启动白血病HL-60细胞凋亡相关。结论：运用比较蛋白质组学技术解码HHT启动白血病细胞凋亡相关蛋白，将有助于揭示HHT治疗白血病的机制，为开发HHT相关的以诱导白血病细胞凋亡为靶位的药物先导化合物提供参考。     

吲哚美辛诱导慢性髓细胞白血病细胞凋亡的研究

目的　观察和确定吲哚美辛 (IN)对慢性髓细胞白血病 (CML)细胞凋亡的诱导作用 ,并部分揭示其分子机制 ,以期筛选一种新的抗白血病药物。方法　以CML细胞株K5 6 2及来自 6例初治Ph CML患者骨髓原代培养细胞为研究材料 ,在不同时间点 ,用不同浓度的IN进行干预 ,利用细胞形态学、流式细胞仪、DNA电泳、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)等技术 ,确定IN对CML细胞凋亡和增殖的影响。结果　①IN能诱导K5 6 2细胞和原代培养的CML细胞凋亡 ,并有抑制白血病细胞增殖的作用 ;②IN对足叶乙甙诱导K5 6 2细胞凋亡具有协同作用 ;③IN能下调K5 6 2细胞中bcl 2mRNA水平表达 ,对baxmRNA水平无明显影响。结论　IN能诱导CML细胞凋亡和抑制白血病细胞增殖 ,IN对足叶乙甙的抗白血病效应具有增敏作用。bcl 2基因表达下调可能为IN诱导CML细胞凋亡的重要机制之一。     

全反式维甲酸和柔红霉素对NB4和HL-60细胞株VEGF表达及分泌的影响

目的　探讨在全反式维甲酸 (ATRA)和柔红霉素 (DNR)的分别作用下 ,白血病细胞株NB4和HL 6 0VEGFmRNA表达及VEGF蛋白分泌的变化。方法　应用RT PCR法和ELISA方法研究ATRA和DNR分别对NB4和HL 6 0细胞VEGFmRNA表达及VEGF蛋白分泌的影响。结果　NB4和HL 6 0细胞中均有VEGFmRNA的表达和VEGF蛋白的分泌。ATRA(10 - 5～ 10 - 8mol L)及DNR(0 .0 1～2 .0 0 μmol L)在体外能分别下调NB4及HL 6 0细胞VEGFmRNA的表达和VEGF蛋白的分泌 ,并呈时间(3～ 72h)和剂量依赖性 (r值均为 - 1.0 0 ,P值均 <0 .0 1)。结论　这两种化疗药物除了可以诱导白血病细胞分化或抑制白血病细胞生长外 ,还可以通过抑制促血管新生 ,使新生血管减少 ,以发挥抗白血病的效应。     

survivin、XIAP在骨髓增生异常综合征患者及其细胞株MUTZ-1中的表达及意义

目的研究骨髓增生异常综合征(MDS)患者及MDS-RAEB细胞株MUTZ-1凋亡蛋白抑制因子survivin、XIAP的表达和高三尖杉酯碱(HHT)诱导MUTZ-1细胞凋亡的作用机制.方法以47例初发MDS患者及15名异基因骨髓移植志愿供者为研究对象,应用RT-PCR方法检测survivin、XIAP mRNA表达;采用流式细胞术分析MDS-RAEB细胞系MUTZ-1细胞凋亡和细胞周期变化,RT-PCR技术检测survivin、XIAP在MUTZ-1中的表达;研究survivin反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)和HHT对细胞增殖、凋亡的影响.结果 MDS患者survivin mRNA 总阳性率高于正常对照组(分别为38.3%和0,P<0.01),高危组(RAEB、RAEB-t、CMML)阳性率高于低危组(分别为53.6%和16.7%,P<0.05).MDS患者及正常对照均表达XIAP,但表达水平不同,其中低危组XIAP mRNA(0.74±0.24)低于正常对照组(1.01±0.28)(P<0.05),高危组XIAP mRNA表达(1.55±0.34)高于低危组及正常对照组(P值均<0.01).HHT能诱导MUTZ-1细胞凋亡,凋亡率与作用浓度和时间呈正相关,细胞被阻滞在G2期;HHT作用MUTZ-1细胞6?h后细胞内survivin 表达下调,而XIAP表达无明显变化.survivin AS-ODN能明显抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡,并提高MUTZ-1细胞对HHT的敏感性.结论凋亡蛋白抑制因子survivin、XIAP表达在MDS的不同阶段的改变可能与MDS的发生及发展有关.HHT能诱导MUTZ-1细胞凋亡,且能使凋亡蛋白抑制因子survivin mRNA下调,可能是HHT诱导MUTZ-1细胞凋亡的机制之一.     

甲异靛对慢性粒细胞白血病抗血管新生作用的体外研究

远期疗效分析结果证实 ,甲异靛与目前国际上治疗慢性粒细胞白血病 (CML)的首选化疗药物羟基脲疗效相当 ,甲异靛联合羟基脲或干扰素较单用甲异靛、羟基脲、干扰素能明显延长总生存率 ,降低 5年恶变率[1 ,2 ] 。以前我们的研究结果表明 ,其主要疗效机制是抑制白血病细胞增殖、诱导凋亡。最近研究表明 ,CML患者骨髓微血管密度 (MVD)较正常人明显增高[3] 。为探讨抗血管新生是否为甲异靛治疗CML的疗效机制之一 ,我们研究了甲异靛对K5 6 2细胞系和CML原代细胞分泌血管内皮生长因子 (VEGF)的影响及其对内皮细胞的作用。材料和方法1　主要…     

高三尖杉酯碱通过mTOR通路诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡

目的:观察高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)对人CML细胞株K562的增殖及凋亡的影响,并从mTOR通路探索HHT抗CM L效应的作用机制。方法:采用不同浓度HHT或联合mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)处理K562细胞,用CCK-8法检测细胞增殖抑制活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测BCL-6、Caspase-3及mTOR通路相关蛋白的表达水平,RT-PCR法检测BCL-6 mRNA表达水平。结果:HHT可抑制K562细胞的增殖并促进其凋亡,且呈浓度依赖性(r=0.970)。随着HHT作用浓度的增加,mTOR通路相关蛋白表达水平升高(r=0.908),而BCL-6 mRNA及蛋白的表达水平下降(r_(mRNA)=-0.961,r_(protein)=-0.981)。与HHT单用组相比,联用RAPA可显著下调mTOR及Caspase-3的表达,并上调BCL-6表达。结论:HHT可通过激活mTOR通路抑制抗凋亡BCL-6蛋白的表达,进而诱导CML细胞凋亡。     

高三尖杉酯碱联合三氧化二砷诱导人急性髓系白血病U937细胞株凋亡的实验研究

目的:本探讨高三尖杉酯碱(HHT)联合三氧化二砷(As_2O_3)对人急性髓系白血病细胞株U937细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用及相关机制。方法:用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测不同浓度HHT及As_2O_3单用及联用对U937细胞增殖的影响;应用Annexin-V-FITC/PI双染流式细胞术检测二者单用或联用对U937细胞的凋亡诱导作用,Western blot方法检测U937细胞内P-Akt~(Ser473)、P-Akt~(Thr308)、BCL-XL、BID、MCL-1与P-MCL-1等蛋白的表达。结果:HHT和As_2O_3均可明显抑制U937细胞的增殖,诱导其凋亡,两药联合可明显增加U937细胞早期凋亡率,且两药联合作用后U937细胞P-Akt~(Ser473)、P-Akt~(Thr308)、MCL-1、P-MCL-1与BCL-XL蛋白表达明显下调,而BID蛋白表达无明显变化。结论:HHT与As_2O_3联合可通过抑制PI3K/Akt信号通路及下游MCL-1蛋白协同抑制U937细胞。     

线粒体膜电位在高三尖杉酯碱诱导T-淋巴细胞白血病细胞Molt-3凋亡中的作用

目的 研究线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP)改变在高三尖杉酯碱（HHT）诱导的细胞凋亡中的作用。方法 用膜联蛋白V染色,流式细胞仪和共聚焦激光扫描显微镜等手段观察Bax、 细胞色素C等在HHT诱导T－淋巴细胞白血病细胞（Molt-3）凋亡过程中与线粒体膜电位的关系。结果 发现HHT诱导细胞早期凋亡的同时,Bax从胞浆易位至线粒体,线粒体膜电位下降,同时细胞色素C从线粒体膜释放到胞浆。结论 线粒体膜电位下降是HHT诱导T－淋巴细胞凋亡的重要环节。     

中华眼镜蛇毒组分诱导人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞凋亡的研究

目的:探讨中华眼镜蛇毒组分(naja naja actra venom component,NNAVC)诱导KG1a细胞凋亡及相关机制.方法:以NNAVC作用人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞,台盼蓝拒染法测定细胞毒性,流式细胞仪测细胞凋亡率,RT-PCR测细胞凋亡相关基因(Bax、Bak、Bcl-2)的表达.结果:NNAVC对KG1a细胞有显著的细胞毒性作用,能诱导KG1a细胞凋亡,促凋亡作用可能与Bcl-2表达下调和Bax表达上调有关.结论:NNAVC通过调节抗/促凋亡分子诱导KG1a细胞凋亡,提示NNAVC具有治疗复发难治性白血病的应用前景.     

甲异靛诱导NB4细胞凋亡的分子机制研究

甲异靛对多种肿瘤细胞生长具有抑制作用~([1-2]),对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞系NB4细胞有显著的诱导细胞凋亡作用,但其具体机制尚不明确~([3]).我们通过研究半胱天冬酶(caspase)、蛋白激酶C(PKC)以及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在甲异靛诱导细胞凋亡过程中的变化,对甲异靛诱导NB4细胞凋亡的机制进行了初步探讨.     

家蝇胚胎细胞抗菌肽对人髓样白血病细胞K562的杀伤作用

目的探讨家蝇胚胎细胞抗菌肽和高三尖杉酯碱(HHT)对人髓样白血病细胞K562的抑制、杀伤作用。方法采用脂多糖诱导家蝇胚胎细胞,提取抗菌肽。采用磷酸盐缓冲液(PBS)配制80、160、320及640μg/mL4个浓度,阴性对照组仅加入PBS和培养基。采用流式细胞术检测不同浓度抗菌肽对K562细胞周期和细胞凋亡率的影响。用处于对数生长阶段的K562和人脐静脉血管内皮细胞制备成浓度相同的2个药物组(HHT组和抗菌肽组),不加入药物的2种细胞作为正常对照组。采用流式细胞术检测正常对照组及2个药物组对2种细胞的有效杀伤率。结果 4个浓度组抗菌肽均使K562的S期降低,增殖指数降低,并引起G0/G1期升高,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。4个浓度组K562细胞凋亡率与阴性对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。HHT组和抗菌肽组对K562的有效杀伤率显著升高,HHT组和抗菌肽组与正常对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。HHT组对人脐静脉血管内皮细胞的有效杀伤率显著高于正常对照组和抗菌肽组(P0.05)。结论家蝇胚胎细胞抗菌肽能有效抑制肿瘤细胞的生长,对正常人体细胞无抑制、杀伤作用。     

人前列腺凋亡反应因子4对K562细胞的促凋亡作用研究

前列腺凋亡反应因子4(prostate apoptosis response-4,Par-4)是Sells等[1]于1994年从前列腺肿瘤细胞中分离出来的一种促凋亡基因.国外学者发现Par-4能增强细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导剂(TRAIL)的敏感性,诱导细胞凋亡,提示Par-4在诱导白血病细胞凋亡中发挥重要作用.三氧化二砷(As2O3)不仅对急性早幼粒细胞白血病(APL)具有明显的疗效,对其他白血病细胞系HL-60、K562细胞以及某些实体瘤细胞也有明显的生长抑制和诱导凋亡作用[2].我们前期研究发现,Par-4不能直接诱导K562细胞凋亡,但是在As2O3诱导K562细胞凋亡的过程中,Par-4表达明显上调,提示Par-4参与K562细胞的凋亡调控.由于小剂量As2O3 对K562细胞的促凋亡作用较弱[3],因此我们在本实验中通过转染pIRES2-EGFP/Par-4真核表达载体,加用小剂量As2O3,进一步观察Par-4对K562细胞的促凋亡作用.     

血管内皮生长因子基因表达定量分析方法的建立及其应用

血管内皮生长因子(VEGF)是血管新生的中枢介质,在白血病的病理机制中具有重要作用,也是血液肿瘤患者一种独立的预后因素,但VEGF在白血病细胞分化或凋亡中的重要性尚待阐明。为了查明VEGF在白血病细胞分化或凋亡中的作用,构建了VEGF基因竞争模板(T-VEGFΔ)并建立竞争性定量逆转录聚合酶链反应(cQRT-PCR),以监测全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化过程中VEGF基因表达的改变;通过将系列稀释的靶分子与恒量的竞争模板共扩增,获得标准曲线,用于计算待测样本中靶基因的分子数;在不同时间点分别检测NB4细胞的CD11b抗原表达和NBT还原率。结果显示:cQRT-PCR可作为定量分析VEGF基因表达的有效工具,其测定范围约为1×104-2×105分子。NB4细胞经ATRA处理0、12、24和48小时后,其VEGF基因转录本的数量分别为42.3×105、12.6×105、3.6×105,低于1.0×105/μg总RNA,并伴有CD11b表达上调和NBT还原率增加。结论:成功地建立了cQRT-PCR方法,证明ATRA显著抑制VEGF表达并可能通过抑制血管新生发挥抗白血病的功效。     

干扰素-α联合高三尖杉酯碱对K562细胞增殖及β-catenin基因表达的影响

本研究探讨干扰素-α(IFN-α)联合高三尖杉酯碱(HHT)对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期及β-环联蛋白(β-catenin)基因表达的影响。用IFN-α、HHT单药或两药联合处理后,K562细胞的增殖、凋亡、细胞周期及β-catenin mRNA表达水平分别用MTT法,流式细胞术及RT-PCR方法检测。结果显示,单用HHT能明显抑制K562细胞增殖,诱导凋亡,使细胞阻滞在G0/G1期,β-catenin表达下调,呈时间和剂量依赖性,而IFN-α无此作用。HHT组的β-catenin表达水平为0.5576±0.0373,低于空白对照组(0.9369±0.0142)。IFN-α联用HHT组β-catenin表达较单用HHT组下调更显著(0.3737±0.0529 vs 0.5576±0.0373,P<0.05)。HHT联合IFN-α对正常人骨髓单个核细胞未见明显毒性作用。结论:IFN-α联用HHT可明显增强后者的抗K562细胞作用,而β-catenin表达下调可能为其作用机制之一。     

化疗药物诱导白血病细胞凋亡对Fas/FasL途径依赖性的研究

化疗药物除通过同各自的靶点直接作用外 ,也可以通过诱导细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞。文献报道化疗药物诱导白血病细胞凋亡与Ｆａｓ/ＦａｓＬ途径有关[1 3 ] ,我们对此进行了研究 ,并探讨化疗药物与ＦａｓＬ联用的疗效及其机制 ,期望为白血病的治疗提供新的线索。材料和方法1　主要试剂　柔红霉素 (ＤＮＲ)、阿糖胞苷 (Ａｒａ Ｃ)、碘化丙锭(ＰＩ)购自Ｓｉｇｍａ公司 ;原位末端标记 (ＴＵＮＥＬ)试剂盒购自博士德公司 ;可溶性Ｆａｓ配体 (ｓＦａｓＬ) ,小鼠抗人Ｆａｓ单抗 (ＩｇＧ1) ,白血病细胞系ＨＬ 6 0、Ｋ5 6 2、Ｕ937由华中科技大学同济…     

氨肽酶抑制剂Bestatin通过激活半胱天冬酶3诱导HL-60细胞凋亡

目的 研究半胱天冬酶3在国产氨肽酶N抑制剂Bestatin(商品名百士欣,BS）诱导人白血病细胞凋亡过程中的变化及其意义。方法 用光学显微镜观察细胞形态结构的改变,通过DNA片段原位末端标记法及流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡。用发色底物法检测细胞半胱天冬酶3活性。Rhodamin(Rh)123染色后,采用FCM检测细胞线粒体跨膜电位。结果 典型的细胞形态改变、DNA片段化、DNA末端原位标记及FCM结果,均证实BS能诱导HL－60细胞凋亡。凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖关系。BS诱导细胞凋亡过程中,半胱天冬酶3活性明显升高,而AC0DEVD－CHO能抑制BS诱导的细胞凋亡。经BS处理的HL－60细胞出现线粒体跨膜电位（ΔΨm)下降。结论 BS通过激活半胱天冬酶3而诱导白血病细胞凋亡。     

高三尖杉酯碱治疗慢性髓细胞白血病的研究进展

高三尖杉酯碱(HHT)以持续静脉滴注疗效为最佳,半合成和人工合成HHT每日二次皮下注射的药代动力学和药理学与持续静脉滴注相当.HHT的主要作用机制是诱导白血病细胞凋亡与抑制蛋白合成,并能直接抑制P210BCR-ABL蛋白的表达.HHT单用或与其他药物联用是初诊慢性髓细胞白血病(CML)患者和α-扰素治疗失败的慢性期晚期CML患者的有效治疗方法,加用HHT可使部分伊马替尼治疗失败或疗效处于平台期的CML患者获得疗效,对伊马替尼耐药尤其是T315I突变CML患者,HHT也是有效的补救治疗方法之一.     

细胞自噬对高三尖杉酯碱作用K562细胞的影响

目的:探讨高三尖杉酯碱(HHT)单用或与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联用对K562细胞凋亡及自噬的影响。方法:K562细胞在HHT(10 ng/ml)作用下1-8 d,采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用RT-PCR法、Western blot法和透射电子显微镜检测细胞自噬。结果:在HHT作用前期K562细胞凋亡率逐渐升高,而在后期则下降。HHT作用后,K562细胞的Beclin1表达及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值先下降后升高。HHT单用时,激活型caspase-3蛋白表达前期逐渐上升,而在后期下降。与自噬抑制剂3-MA联用组的K562细胞的Beclin1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值持续下降,而激活型caspase-3蛋白表达则逐渐升高。结论:HHT可诱导K562细胞凋亡,但HHT持续作用可诱导K562细胞发生自噬,与3-MA联用则增强HHT的细胞毒作用。