胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗原的研究

目的 研究胶体金免疫层析试纸条检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性.方法通过鼠疫F1抗原单克隆抗体(F1MAb)捕捉F1抗原的胶体金免疫层析(GICA)试纸条,检测308只强毒鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)感染鼠脏器标本和225份对照鼠(达乌尔黄鼠217只,小白鼠5只,豚鼠3只)标本,同时用鼠疫反向间接血球凝集试验(RIHA)微量法和细菌培养做平行检测.结果 225只对照鼠鼠疫细菌学检验及GICA和RIHA的F1抗原检测均为阴性,GICA和RIHA在1×108 cfu/ml水平上未发现与近缘假结核耶尔森菌有交叉反应.GICA、RIHA对鼠疫菌检测灵敏性为2.5×105、2.0×105cfu/ml;检测F1抗原灵敏性为1、10 μg/L.GICA与细菌学检验符合率为97.94%(522/533),Kappa值=0.959,阳性检出率组间比较,差异无统计学意义(x2=0.36,P＞0.05);与RIHA符合率为97.94%(522/533),Kappa值=0.959,阳性检出率组间比较差异有统计学意义(x2=9.09,P＜0.05).308只实验鼠样本细菌培养阳性284只,284份细菌培养阳性标本中,GICA有280份检测阳性,阳性率为98.59%,高于RIHA[阳性率为96.13%(522/533)],两组比较差异有统计学意义(x2=5.14;P＜0.05).GICA的敏感度为98.59%(280/284),特异度为97.19%(242/249),阳性预测值为97.56%(280/287),阴性预测值为98.37%(242/246),Youden指数为0.9578.结论 GICA检测鼠疫F1抗原敏感特异,快速简便,是鼠疫早期快速诊断中有应用价值的检测技术.     

胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗原的研究

Objective To study the sensitivity and specificity of gold-immunochromatography assay (GICA) for detection of Yersiniapestis(Y. pestis ) F1 antigen. Methods Viscera organ(liver and spleen) specimens of 308 mice with virulent Y. pestis infection and 225 control specimens of rats(217 Spermophilus dauricus, 5 mice,3 guinea pigs) were detected by GICA dipstick with monoclonal antibody against plague F1 antigen (F1MAb).Meanwhile, micro-method of reverse indirect hemagglutination assay(RIHA) and bacteria culture were carried out for parallel testing. Results Bacteriological examination of 225 control specimens, and F1 antigen detected with GICA and RIHA were all negative. No cross-reaction with related Yersinia pseudotuberculosis at 1 x 108 cfu/ml level was found in GICA and RIHA. Detection sensitivity of Y. pestis by GICA and RIHA were 2.5 × 105 cfu/ml and 2.0 × 105 cfu/ml, respectively, and of F1 antigen were 1μg/L and 10 μg/L, respectively. Coincidence was 97.94% (522/533) between GICA and bacteriological test, Kappa = 0.959, and the difference was statistically insignificant(x2 = 0.36, P ＞ 0.05); and 97.94%(522/533) between GICA and RIHA, Kappa = 0.959, with statistically significant difference in the positive detection rates(x2 = 9.09, P ＜ 0.05). Out of the 308 infected mice, 284 were positive of plague bacterial cultured, In 284 samples with positive bacterial culture, there were 280 of positive detected by GICA for F1 antigen, positive rate of F1 antigen was 98.59%, higher than that by RIHA[the positive rate of 96.13%(522/533)], with statistically significant difference(x2 = 5.14, P ＜ 0.05). Sensitivity of GICA was 98.59% (280/284), specificity was 97.19% (242/249), positive predictive value (PPV) was 97.56% (280/287),negative predictive value ( NPV ) was 98.37% (242/246), and Youden index was 0.9578. Conclusions GICA is sensitive and specific, fast and simple in detection of F1 antigen of the plague. It's a valuable detection technique for early and rapid diagnosis of plague.     

胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗体技术的应用及效果评价

目的研究鼠疫胶体金免疫层析法(GICA)快速检测鼠疫F1抗体技术在鼠疫血清学诊断、监测及流行病学调查中的应用及效果评价。方法应用GICA、双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)对比检测190份啮齿动物血清和11份鼠疫免疫血清中鼠疫F1抗体。结果190份动物血清IHA检测结果均为阴性:GICA检测出1份阳性血清,滴度1:10;DAgS-ELISA检测出3份阳性血清,滴度1:4( ) 2份和1:16( )1份。3种方法检测11份鼠疫免疫血清均为9份阳性,但GICA敏感性低于IHA和DAgS-ELISA (GICA与IHA:t=3．257,P<0．05;GICA与ELISA:t=3．625,P<0．01;IHA与ELISA:t=1.437,P>0．05)。201份血清检测结果,GICA与IHA总符合率99．50％,与DAgS-ELISA总符合率99．00％,3种方法检测结果差异无统计学意义(x2=0．5,P>0．05)。结论GICA检测鼠疫F1抗体敏感特异、简便快速,与DAgS-ELISA同样为鼠疫血清学快速诊断和鼠疫监测中有应用价值的检测技术。     

胶体金免疫层析法与双单克隆抗体夹心ELISA检测鼠疫F1抗原的比较

目的比较胶体金免疫层析法（GICA）和双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（DMcAbS-ELISA）检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性。方法用GICA试纸条和DMcAbS-ELISA平行检测308份强毒鼠疫耶尔森菌感染鼠脏器标本和327份对照鼠标本,用RIHA微量法同时检测作为参照。结果327份对照鼠鼠疫细菌学检验及GICA,DMcAbS-ELISA和RIHA的F1抗原检测均为阴性,GICA,DMcAbS-ELISA和RIHA在108cfu/mL水平上未发现与近缘假结核耶尔森菌有交叉反应;308只感染鼠样本细菌培养阳性284只,24只样本未分离到鼠疫菌;F1抗原检测GICA阳性287份,DM-cAbS-ELISA阳性280份,RIHA阳性276份,GICA阳性检出率最高93.19%,与DMcAbS-ELISA和RIHA比较,差异均有统计学意义（χ^2=5.14,9.09;P=0.016,0.001）;GICA与DMcAbS-ELISA符合率97.73%（Kappa=0.845）;GICA和DMcAbS-ELISA与RIHA符合率分别是96.43%和98.70%（Kappa=0.774,0.926）;284份细菌培养阳性鼠标本F1抗原检测GICA阳性率是98.59%,高于DMcAbS-ELISA和RIHA,差异有统计学意义（χ^2=4.17,5.14;P=0.031,0.016）;24份细菌培养阴性实验鼠标本F1抗原检测：GICA检出7份阳性,阳性率29.17%,DMcAbS-ELISA检出6份阳性,阳性率25%,RIHA检出3份阳性,阳性率12.5%,GICA高于DMcAbS-ELISA和RIHA,但差异无统计学意义（χ^2=2.25,0;P=0.125,1.000）。结论GICA检测鼠疫F1抗原敏感特异,快速简便,优于DMcAbS-ELISA和RIHA,是鼠疫快速诊断中有应用价值的检测技术。     

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的表位预测

目的预测F1抗原的B细胞表位,为抗F1单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白B细胞表位研究的可行性方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析F1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测。结果F1蛋白的B细胞表位可能位于第106~132和141~155等区域内。结论预测结果为后续抗F1单克隆抗体的制备奠定一定理论基础,表位预测法有利于我国鼠疫菌B细胞表位研究平台的建立。     

鼠疫耶尔森菌F1抗原免疫Balb/c小鼠方法的研究

目的 观察鼠疫耶尔森菌F1抗原(F1Ag)单克隆抗体制备过程中,F1Ag免疫Balb/c小鼠的免疫剂量和方法,探索操作性强、用时短和免疫效果好的方法.方法 7～9周龄Balb/c小鼠48只,按体质量随机分成6组:150、100、50、25μg组(第1次接种为皮下多点注射,F1Ag分别为150、100、50、25μg,第2、3次接种分别为皮下多点注射和腹腔注射,F1Ag量均为100 μg)、皮下接种组(3次F1Ag接种均采用皮下多点注射,每次100 μg)、腹腔接种组(3次F1Ag接种均采用腹腔注射,每次100 μg),每组8只.首次免疫接种F1Ag+等量弗氏完全佐剂(CFA)的乳化剂;3周后第2次接种F1Ag+等量弗氏不完全佐剂(IFA)的乳化剂;1周后第3次接种F1Ag(不加佐剂);1周后取小鼠尾血,用双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)微量法检测F1抗体.结果 不同剂量(150、100、50、25μg)组小鼠血清F1抗体效价(DAgS--ELISA法:G=12 173.87、13 440.37、15 024.19、4466.72;IHA微量法:G=19 972.32、18 089.40、23 170.47、4871.08)比较,差异有统计学意义(DAgS-ELISA法:F=3.11,P<0.05;IHA微量法:F=4.11,P<0.05).150、100、50 μg组小鼠血清F1抗体效价明显高于25μg组(DAgS-ELISA法:t值分别为2.18、2.39、2.73,P<0.05;IHA法:t值分别为2.54、2.73、3.13,P<0.05).不同接种途径条件下,皮下注射组、腹腔接种组、100μg组小鼠血清F1抗体效价呈渐次增高趋势(DAgS-ELISA法:G=8933.44、9986.16、13 440.37:IHA微量法:G=13 777.25、16 384.00、18 089.40),但差异无统计学意义(F值分别为0.66、0.25,P>0.05).结论 F1Ag免疫小鼠首次皮下多点注射50μg,加强免疫(腹腔注射)100μg,可以缩短整个免疫周期,免疫效果良好,抗体水平较高.     

胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体

目的建立检测鼠疫耶尔森菌F1抗体的胶体金标记免疫层析方法。方法胶体金标记纯化鼠疫F1抗原,双抗原夹心法原理制成免疫层析检测试纸条,并对兔、羊、人和黄鼠血清进行检测评价。结果用80份不同动物种属的阴性血清进行检测,未出现非特异性反应,对5份恢复期病人血清、13份免疫兔血清和2份免疫羊血清检测也取得阳性结果,对于8份I HA临界阳性(滴度1∶20)的达乌尔黄鼠血清检出阳性6份。结论建立了可以用于现场快速检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析方法。     

鼠疫耶尔森氏菌荚膜抗原（F1）的几种提取方法评价

鼠疫菌荚膜Ｆ１抗原的传统提取方法费时且成本较高，本文参考不同微生物表面蛋白的制备程序，观察了６种不同实验条件下该抗原的提取效果。结果表明，鼠疫菌湿菌用ＫＣＮＳ作为解离剂提取Ｆ１抗原，和传统方法的提取效果基本一致。由于省去了丙酮制备菌粉这一烦锁步骤，从而撮程序大为减化。     

PCR检测鼠疫菌种中F1抗原基因

目的应用PCR检测试验用EV菌株是否存在caf1基因。方法应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因caf1合成一对引物,进行PCR实验。结果该试验用EV菌株经PCR扩增,呈现一条与caf1基因分子量相吻合的清晰目的扩增带。结论该试验用EV菌株未缺失产生F1抗原的基因,可以用于提取F1抗原等试验。     

鼠疫菌荚膜抗原和重组rV270抗原免疫小鼠后保护效果观察

目的 对小鼠血清抗体滴度检测和对小鼠的保护力观察,评价鼠疫菌荚膜抗原(F1抗原)和重组rV270抗原对鼠疫的免疫保护效果.方法 40只6～8周雌性Balb/c小鼠,按体质量随机分成4个实验组(F1-10 μg+铝佐剂、F1-20μg+铝佐剂、rV-10 μg+铝佐剂、rV-20 μg+铝佐剂)和1个对照组,每组8只.将天然F1抗原和重组rV270抗原分别吸附到25％铝佐剂中免疫实验组小鼠,对照组小鼠以免疫等量的铝佐剂.每只动物每次后腿肌肉免疫100 μ1,初次免疫后,第21天加强免疫1次.所有动物分别于第1次免疫后第8周采血,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体滴度.同时用2000倍半数致死量(LD50)的鼠疫菌141强毒株皮下攻毒,观察14d,以观察免疫后保护效果.结果 对照组未产生抗体,F1-10 μg+铝佐剂组、F1-20 μg+铝佐剂组的抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶30443.9、1∶21527.8,组间比较差异无统计学意义(t=1.1282,P＞0.05);rV-10 μg+铝佐剂组和rV-20μg+铝佐剂组的GMT分别为1∶13957.3、1∶18100.9,组间比较差异无统计学意义(t=0.9408,P＞0.05).用141强毒株皮下攻毒后,实验组小鼠全部存活,对照组8只小鼠全部死亡.结论 实验用天然F1抗原及重组rV270抗原具有较高的免疫活性,可作为鼠疫亚单位疫苗的主要组分用于鼠疫亚单位疫苗的研究.     

鼠疫耶尔森氏菌快速检测研究进展

目的论述一套对鼠疫耶尔森氏菌特异性强、快速、灵敏度高的快速检测方法,对鼠疫做到早发现、早预防、早诊断、早治疗,预防和控制鼠疫的发生和流行。方法查阅和收集国内外相关鼠疫耶尔森氏菌快速检测的文献和资料。结果鼠疫耶尔森氏菌检测技术向着快速、敏感、特异的标准化和国际化方向发展,其检测技术更加先进、齐全、完备。结论鼠疫耶尔森氏菌的检测技术从细菌学、血清学及分子生物学等正向更快速、更先进的方向发展,这对鼠疫防治将发挥重要作用。     

对常规制备的鼠疫F1抗原、抗体组分及免疫交叉反应的观察

目的对常规方法制备的鼠疫菌F1抗原、抗体的组分进行分析,并观察其免疫交叉反应。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分析抗原、抗体的组分;应用蛋白印迹观察其与相关细菌的免疫交叉反应。结果常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体组分复杂,混杂有其他多种蛋白;假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌的全膜蛋白与F1抗体存在交叉反应。结论常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体不纯,影响鼠疫免疫学诊断的特异性。     

胶体金免疫层析法诊断鼠疫的特异性试验

目的研究胶体金免疫层析法用于鼠疫快速诊断的特异性。方法采用胶体金免疫层析测试条和鼠疫反向间接血凝试验(RIHA)平行检测。结果检测鼠疫菌F1抗原具有很强的特异性,不与包括小肠结肠炎和假结核耶尔森等其他细菌发生交叉免疫反应。结论该方法简便、快速、敏感,适合现场鼠疫监测。