HpaA IgY抑制小鼠胃内幽门螺杆菌的定植

目的 在构建基因工程菌pQE30-HpaA-DH5a的基础上,制备HpaA重组蛋白,以此为抗原,制备抗HpaA的蛋黄抗体(HpaA IgY).通过小鼠口服试验,验证HpaA IgY阻止H.pylori在胃内定植的作用,为研制预防H.pylori感染的制剂奠定基础.方法 大量诱导工程菌pQE30-HpaA-DH5a,获得重组蛋白Hpan,免疫产蛋立克体鸡,以水稀释法联合硫酸铵沉淀法提纯LgY,SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度,Western blot鉴定对相应抗原的特异性,ELISA法检测效价.建立H.pylori感染Balb/c小鼠的动物模型,预防组在小鼠灌喂H.pylori菌液前灌喂不同剂量的HpaA LgY.组织学检查和细菌培养观察H.pylori定植.结果 提纯后的HpaA IgY纯度为90%,浓度为24.6 mg/mL,Western blotting证实有良好抗原结合特异性,ELISA效价为1:12 800.阳性对照组H.pylori的感染率为70.4%,12周后的感染率为88.9%.预防组的感染率明显低于阳性对照组,随IgY剂量的增加,感染率降低.IgY的剂量为6 mg/mL时,能达到预防效果.结论 成功制备出高纯度、高浓度、高效价的特异性HpaAIgY,在小鼠体内能阻止H.pylori的定植,有望进一步开发成为预防H.pylori感染的制剂.     

人幽门螺杆菌尿素酶抗体诊断试剂盒的研制

幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈ .ｐｙｌｏｒｉ)为慢性胃炎、消化性胃溃疡的致病菌 ,并且与胃癌的发生密切相关 ,世界卫生组织 (ＷＨＯ)将其列为一级致癌因子 ,早期诊断Ｈ .ｐｙｌｏｒｉ感染并对其治疗和预后的观察具有重要意义。目前 ,临床上用于诊断Ｈ .ｐｙｌｏｒｉ感染的方法主要有胃镜下组织活检、细菌培养、13 Ｃ呼气试验等 ,前者需活检组织 ,病人痛苦大 ,且阳性率低 ,后者需特殊性设备 ,不易推广 ,细菌培养则阳性检出率低 ,而血清学诊断具有灵敏、快速、准确、简便、费用低等优点 ,易在临床上广泛使用。但是 ,…     

含幽门螺杆菌特异性抗体牛奶清除幽门螺杆菌效果的临床随机试验

目的:比较观察抗幽门螺杆菌抗体牛奶根除幽门螺杆菌的效果。方法:用4 株幽门螺杆菌(1 株为标准菌株,3 株为本地流行菌株)免疫奶牛,制备出抗幽门螺杆菌抗体牛奶。本次试验共筛选148 例患者,C-14 呼气试验阳性的患者为72 例,最后符合入选标准的为39 例,将符合标准的患者随机分为试验组和对照组,分别为21 例和18 例,试验组饮用含特异性幽门螺杆菌抗体的牛奶,对照组饮用普通牛奶,连续饮用2 个月后,观察结果。结果:试验组的21 名对象中,9 人C-14 呼气试验转为阴性,10 人降低。有效清除率达42.86%,而对照组未有清除,两组清除率有统计学意义(P =0.005,P<0.05)。结论:抗幽门螺杆菌抗体牛奶具有多克隆性和很高的效价,能够有效清除胃内幽门螺杆菌。     

胃粘膜局部抗幽门螺杆菌抗体IgA的研究

采用胃粘膜体外培养技术和免疫印迹技术研究了５１例慢性胃炎和消化性溃疡患者胃粘膜局部抗幽门螺杆菌（Ｈｐ）抗体ＩｇＡ，同时对其中１０例Ｈｐ阳性患者的血清ＩｇＡ作了分析。结果表明：４０例Ｈｐ阳性患者除１例外，其粘膜抗ＨｐＩｇＡ抗体均为阳性；１１例Ｈｐ阴性患者中，２例胃粘膜局部ＩｇＡ阳性，９例为阴性。该方法与常规方法检测Ｈｐ的符合率为９２．２％。粘膜局部ＩｇＡ识别５条左右条带，且识别条带具多样性。１０例Ｈｐ阳性且局部ＩｇＡ阳性患者的血清ＩｇＡ亦为阳性，但血清ＩｇＡ的识别条带较局部ＩｇＡ少，且染色浅，说明抗ＨｇＩｇＡ抗体以局部为主，该局部ＩｇＡ的作用值得进一步研究。     

HP1188-IgY对感染幽门螺杆菌BALB/c小鼠的治疗作用

目的:评价抗幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)HP1188蛋黄抗体(HP1188-immunoglobulinyolk,HP1188-IgY)对BALB/c小鼠胃内H.pylori感染的治疗效果。方法:建立H.pylori感染BALB/c小鼠的动物模型,将建模成功的80只小鼠随机分为8组,每组10只。第1组(抗生素治疗组)、第2组(1mgHP1188-IgY)、第3组(1mgHP1188-IgY+30%硫糖铝)、第4组(5mgHP1188-IgY)、第5组(5mgHP1188-IgY+30%硫糖铝)、第6组(PBS对照组)和第7组(30%硫糖铝对照组)分别连续治疗10d,每天1次;第8组间隔48h皮下注射2.5mgHP1188-IgY,共2次;另10只正常小鼠为第9组(健康对照组)。处理完成2周后取各组小鼠胃组织作H.pylori培养、快速尿素酶试验、PCR检测H.pylori特异性vacA和cagA及病理组织学检查,观察H.pylori清除情况并进行评分。结果:在小鼠体内,灌胃(1mgHP1188-IgY+30%硫糖铝)即可有效治疗H.pylori感染引起的胃黏膜损害,其治疗效果与抗生素相似。结论:成功构建了H.pylori感染的BALB/c小鼠模型,选择30%硫糖铝为抗体保护剂,经口服HP1188-IgY可抑制小鼠胃内H.pylori感染。     

两株抗幽门螺杆菌特异性卵黄抗体的制备及性能

目的分别制备抗幽门螺杆菌(H.pylori)全菌(SS1株)和尿素酶I和尿素酶B的重组蛋白(r IB)的特异性卵黄抗体(Ig Y),纯化后研究其体外抑菌效果。方法分别以超声破碎SS1菌液和r IB为抗原免疫来杭鸡,用水稀释法和硫酸铵沉淀法纯化获得相应特异性Ig Y(SS1-Ig Y、IB-Ig Y)。将特异性Ig Y与SS1混合作用后共培养检测其抑菌效果,快速脲酶试验检测其抗尿素酶作用。结果成功制备2种特异性Ig Y:SS1-Ig Y和IB-Ig Y,效价超过1∶12 800,纯度超过80%。SS1-Ig Y和IB-Ig Y均有体外抗尿素酶活性和抑菌作用。结论 SS1-Ig Y和IB-Ig Y均具有在体外抑制H.pylori尿素酶活性和抑制H.pylori生长的作用。     

三种抗原检测抗幽门螺杆菌抗体的临床意义评价

目的：寻求敏感性高、特异性强的ＨＰ抗原和简便、可靠的检测ＨＰ抗体的方法,用于诊断ＨＰ感染。方法：分别以ＨＰ尿素酶、全菌破碎物、培养上清液为抗原。采用斑点金标免疫渗滤法（ＤＩＧＦＡ）检测ＨＰ培养、病理组织学检查、尿素酶试验均阳性和均阴性的血清各５０份;胃镜检查各类胃病毒者血清２５８份,并以ＥＬＩＳＡ试剂盒做平行检测对照。结果：三种抗原的敏感性分别为１００％、９６％和７６％;５０份阴性血清的阴性符合率     

幽门螺杆菌黏附素HpaA的克隆、表达及生物学活性研究

幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)是一种慢性、感染率高的细菌 ,是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要致病因子 ,并与胃癌、胃相关淋巴组织瘤密切相关。Hp感染最基本的条件之一是黏附定居 ,N 乙酰神经氨酰乳糖结合血凝素(NLBH ,HpaA)是Hp众多黏附素中的一种 ,可激发宿主产生相应抗体 ,引起黏膜和全身性免疫应答 ,针对它所产生的抗体不与非Hp细菌和人胃黏膜组织发生交叉反应 ,是Hp的保护性抗原之一。HpaA由hpaA基因编码 ,属于Hp的外膜蛋白 ,PHD预测 2 6 0个氨基酸的HpaA由胞内区、跨膜区和胞外区 3部分组成。其中 1～ 17位氨基酸为…     

IgY抗体在体外和体内对幽门螺杆菌作用的研究

目的 通过口服IgY抗体制剂中和幽门螺杆菌（Hp)的毒性蛋白，以达到根除Hp感染的目的。方法 将空泡毒素基因阳性Hp株培养后，用超滤浓缩的上清和超声破碎的菌体蛋白免疫产蛋母鸡，从鸡蛋中提取2种IgY抗体，用MTT法进行IgY抗体对Hp毒素细胞毒活性的中和作用试验，将此2种IgY抗体间隔2d分3次口服已感染Hp的小鼠，2、4、6、8周后分批处死小鼠，进行细菌培养、尿素酶试验和病理检查。结果 2种IgY抗体分别能够中和培养上清和菌体蛋白诱导的Vero细胞毒活性。感染小鼠经治疗后细菌培养阴转率分别达66．7％、100％、100％、100％。病理切片显示，炎症明显减轻甚至消失。结论 口服IgY抗体制剂可能是治疗Hp感染的一种有效方法。     

融合蛋白VacA-HpaA卵黄抗体的体外研究

目的：研究VacA-HpaA融合蛋白的鸡卵黄抗体（IgY）的理化特性和生物学活性,为制备集预防与治疗为一体的抗H.pylori感染的制剂奠定基础。方法：以纯化的VacA-HpaA融合蛋白免疫产蛋鸡,水稀释法获取蛋黄抗体（VacA-HpaAIgY）。（1）用硫酸铵沉淀法纯化IgY后,用SDS-PAGE分析其纯度,Bradford法测定蛋白含量。（2）用间接ELISA法检测该IgY的耐热性、耐酸性及其对酶消化的耐受作用。（3）采用Western blot分析IgY的特异性并检测其效价。（4）用MTT法检测不同浓度VacA-HpaAIgY对细胞毒活性的中和作用。（5）用扫描电镜观察VacA-HpaA IgY对AGS细胞粘附的中和作用。结果：（1）该IgY纯度为60%,蛋白浓度为22g/L;（2）具有一定的耐热性、耐酸性和耐胃蛋白酶能力;（3）Western blot分析显示IgY的特异性,在相对分子量约27000和30000处出现在相应的条带;（4）该IgY对VacA细胞毒活性有中和作用,且具有量效性和时效性;（5）IgY可阻止H.pylori菌体蛋白的粘附作用。结论：该IgY具有良好的理化和生物学特性,可用于制备抗H.pylori感染的防治制剂。     

幽门螺杆菌黏附素A有效T和B联合抗原表位噬菌体展示和抗原性测定

目的 分析并确定幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)分子中有效T细胞和B细胞联合(T/B)抗原表位.方法 重组表达HpaA(rHpaA)并免疫家兔制备抗血清.采用生物信息学技术预测和分析HpaA分子中T细胞和B细胞表位,PCB扩增T/B联合表位肽片段并构建其噬菌体展示系统.采用PEG/NaCl沉淀法提纯展示了T/B联合表位的重组噬菌体PⅢ蛋白(rPⅢ).分别以商品化幽门螺杆菌全菌IgG抗体和rHpaA抗血清为一抗,采用Western blot和ELISA对rPⅢ蛋白中展示的T/B联合表位进行筛选和鉴定.采用MTT检测rHpaA免疫小鼠脾细胞在不同重组噬菌体蛋白刺激下的增殖情况.结果 HpaA分子中共有5个T/B联合表位:HpaA10、HpaA37、HpaA79、HpaA116和HpaA143.所有T/B联合表位均成功地展示于M13噬菌体PⅢ蛋白表面.Western blot、ELISA和淋巴细胞增殖试验结果 均显示,HpaA116是优势抗原表位,HpaA37和HpaA79为有效抗原表位,HpaA10和HpaA143为无效抗原表位.结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌HpaA的T/B联合表位肽噬菌体展示系统.HpaA37和HpaA79,尤其是HpaA116是HpaA有效T/B联合抗原表位.     

Recombinant HpaA purified from Escherichia coli has biological properties similar to those of native Helicobacter pylori HpaA

The aim of this study was to recombinantly produce and purify Helicobacter pylori adhesin A (HpaA) from Escherichia coli and compare it to purified native H. pylori HpaA, for potential use as a vaccine antigen. The hpaA gene was cloned from H. pylori, transferred to two different expression vectors, and transformed into E. coli. Expression of rHpaA was analysed by immunoblot, inhibition ELISA, and semi-quantitative dot-blot. Using affinity chromatography, rHpaA was purified from E. coli and native HpaA from H. pylori. The binding of both purified proteins to sialic acid was analysed and antibody titres to native and rHpaA were compared after intraperitoneal immunisation of C57/Bl mice. The rHpaA protein was highly expressed in E. coli from both vectors. Purified recombinant and native HpaA bound similarly to fetuin but also to the non-sialylated asialofetuin. Both native HpaA and rHpaA induced comparable amounts of specific antibodies in serum after immunisation and they were identical in double immunodiffusion. In conclusion, rHpaA was successfully produced in E. coli. Purified rHpaA showed biological properties similar to those of native HpaA isolated from H. pylori and may therefore be further used as an antigen in the development of a vaccine against H. pylori infection.     

抗肠道病毒71型特异性卵黄抗体的制备及鉴定

目的:制备特异性抗肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的卵黄抗体并检测其生物学性能,这对EV71感染手足口病的预防和治疗具有重大的意义。方法:用纯化并灭活后EV71作为抗原免疫健康产蛋鸡。采用本实验室水提综合聚乙二醇法提取纯化鸡卵黄抗体;用Bradford法测定卵黄抗体提取液的蛋白含量;还原性SDS-PAGE凝胶电泳分析测定提取蛋白的纯度及相对分子质量;分别用ELISA、双向免疫琼脂扩散检测纯化特异性卵黄抗体抗EV71效价;Western blot分析特异性卵黄抗体的免疫反应性。结果:卵黄中卵黄抗体含量达7.76 mg/ml,卵黄抗体的纯度为94.86%。初免10天后蛋黄中可检测到特异性抗EV71卵黄抗体,初免40天后ELISA检测抗体效价高达1∶20 480,双向琼脂扩散检测效价达1∶16。提取的卵黄抗体具有良好的免疫反应性,能与EV71特异性结合。结论:水提综合聚乙二醇法提取纯化得到的抗EV71卵黄抗体产量和纯度高、效价好且具有良好的免疫反应性。     

幽门螺杆菌黏附素A抗原H-2~d(I-A)限制性免疫优势Th表位的筛选与鉴定

目的鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素A抗原(HpaA)H-2d限制性免疫优势Th表位,为H.pylori表位疫苗的研究提供候选表位。方法采用体外扩增的HpaA抗原特异性T细胞和步移重叠合成肽筛选鉴定HpaA抗原的免疫优势Th表位,再利用抗体阻断实验对其H-2d限制性进行分析。结果 18mer氨基酸肽段筛选发现肽段H154-171、H184-201、H190-207、H202-219和H220-237能够激发HpaA特异性CD4+T细胞产生γ-干扰素。其中H154-171激发的应答最强。13mer氨基酸短肽鉴定结果显示:仅H158-170能刺激产生强于18mer氨基酸短肽H154-171的应答反应。同时,抗体阻断试验结果表明:抗H-2d(I-A)抗体能有效阻断该表位激发的应答。结论 H154-171、H184-201、H190-207、H202-219和H220-237是HpaA的小鼠H-2d限制性Th表位,其中H154-171为免疫优势表位肽,该表位的核心氨基酸序列为H158-170,并存在H-2d(I-A)限制性。该研究将为H.pylori表位疫苗研究提供了可能的候选分子。     

特异性抗内毒素鸡蛋黄抗体的制备

目的：制备特异抗内毒素鸡蛋黄免疫球蛋白（Egg yolk immunoglobulin，IgY），探索防治内毒素血症的新途径。方法：用大肠杆菌J5株、内毒素（Lipopolysaccharide，LPS）及类脂A(Lipid A)作抗原免疫25周龄Roman鸡，改良水溶法提取抗体，进行紫外分光光度计检测、SDS-PAGE及Western blot免疫印迹分析，通过酶联染色反应检测其免疫学活性。结果：大肠杆菌J5株、LPS及Lipid A抗体含量分别为11.4、9.2、9.3mg/mL蛋白黄液，质量分数分别为92.3％、87.13％、90.4％，分子质量为180000u，初步鉴定其对内毒素具有特异性结合作用。结论：用大肠杆菌J5株、LPS及LipidA免疫鸡制备的IgY效价高、特异性强、产量大，将是一种防治内毒素血症的新方法。     

抗重组幽门螺杆菌VacA单克隆抗体的制备

目的 制备抗重组幽门螺杆菌致细胞空泡毒素抗原(VacA)的单克隆抗体(mAb).方法 用基因工程菌pQr30-v-DH5α大最表达重组蛋白VaeA,经Ni2+-NTA树脂纯化后,Western blot鉴定抗原性,免疫家兔后ELISA法检测血清VacA抗体鉴定其免疫原性.用重组vacA免疫Balb/c小鼠.取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/O细胞融合,HAT选择性培养和间接EIJSA进行筛选,并检测所分泌抗体的效价和分析Ig类别.结果 获得4株能稳定分泌VacA mAb的杂交瘤细胞,能分泌IgG2b、lgM和IgG1 3类抗体,轻链均为k型.其中,IgG1 mAb经Western blot鉴定能与重组VacA发牛特异性反应.结论 应用纯化的重组VacA,成功获得了能稳定分泌幽门螺杆菌VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞,并制备了单克隆抗体.为进一步研制检测VacA的试剂盒及探讨VacA的致病机制奠定了基础.     

Preparation of specific anti-Helicobacter pylori yolk antibodies and their antibacterial effects

Objective: To study immunization procedures and preparation methods of specific IgY antibodies (IgY-Hp, IgY-IB) produced by hens immunized with Helicobacter pylori (Hp) bacterial antigen and recombinant Hp specific antigen IB, detect the inhibition effects on Hp growth and Hp urease activity, and study the effects of oral administration for treating Hp infection. Methods: By using recombinant cholera toxin subunit B (rCTB) as an adjuvant, hens received intramuscular injection immunization for continuous 7 times at an interval of 14 days. Then, the eggs were collected; IgY was purified. Results: On day 49 after hens were immunized, levels of two antibodies all reached 1:12800; after they were purified by Ammonium sulfate precipitation, their purity was over 80%. IgY-Hp could inhibit Hp growth and inhibit Hp urease activity; although in vitro, IgY-IB could not inhibit Hp growth but could inhibit Hp urease activity. The experiments in vivo found that when IgY-Hp or IgY-IB with sucralfate dual oral therapy was used to treat Hp infected mouse model, the cure rate all could reach 83.3%. Conclusion: According to immunization procedure, high titer specific IgY antibody (1:12800) can be obtained in 49 days and its titer remains stable. Oral administration of the specific IgY antibodies in Hp infected mice can reach a cure rate of 83.3%, and the antibodies are expected to become new drugs and therapeutic methods of targeted therapy against Hp infection.     

Production of chicken yolk IgY to sulfamethazine: comparison with rabbit antiserum IgG

Sulfamethazine was used as target analyte to produce IgY from chicken aiming to compare the performance of these two antibodies in term of yield, titer, sensitivity, selectivity and matrix effect under parallel conditions. The results showed that the total yield of IgY produced by one chicken during 43 weeks' experimental period was about 15 g. This output is much more than IgG (150 mg from one rabbit). Besides, IgY titers increased during 10 weeks and remained stable over 30 weeks. The peak titer of IgY was 1:2¹⁸. As the antibody titer rose, the sensitivity was increased. For IgG, the maximum titer was observed to be 1:2²³. In addition, both IgY and IgG were highly sensitive. The limits of detection were 0.54 ng/mL for IgY and 0.24 ng/mL for IgG. These results indicated that the IgY potentially provides a practical and ethical alternative to IgG in veterinary drug residue immunoanalysis.