siRNA靶向沉默PcG蛋白EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响

背景：PcG蛋白是一组转录抑制因子,其核心成分EZH2在胃癌组织中表达增高,并与胃癌的进展相关。目的：应用RNA干扰（RNAi）技术研究EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响,从细胞水平探讨EZH2参与胃癌发生的机制。方法：使用EZH2小干扰RNA（siRNA）转染MKN45细胞,以实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测EZH2mRNA和蛋白表达,CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期．MatrigelTM侵袭实验检测细胞侵袭力。结果：EZH2siRNA能有效抑制MKN45细胞的EZH2mRNA和蛋白表达。与阴性对照siRNA组相比,EZH2siRNA组MKN45细胞增殖抑制率为14．7％（P＜0．05）,侵袭能力显著降低[穿过Transwell小室膜细胞数：（38．5±3．4）个／HPF对（92．7±9．7）个／HPF,P＜0．05）,细胞周期阻滞于G0／G1和G2／M期。结论：EZH2siRNA可抑制人胃癌细胞的增殖和侵袭力,证实EZH2通过促进细胞增殖和侵袭在胃癌发生中发挥作用。     

siRNA干扰沉默EZH2基因对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的探讨小分子RNA(siRNA)干扰沉默靶基因EZH2对人肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法取对数生长期的HepG2细胞,分为转染组、阴性对照组及空白对照组,转染组与阴性对照组按照Lipofectamine2000使用说明分别瞬时转染EZH2 siRNA、荧光物FAM,对照组不予任何干预。分别采用MTT法检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期;qRealtime-PCR和Western blot方法检测EZH2 mRNA和蛋白表达。结果与阴性对照组相比,转染组细胞增殖明显受抑;与阴性对照组及空白对照组比较,转染组细胞凋亡率明显升高,G0/G1期细胞明显增多,S期明显细胞减少;转染组EZH2 mRNA和蛋白表达明显下调,P均<0.05。结论 EZH2 siRNA可抑制人肝癌细胞增殖活性,是一种潜在基因治疗新方法。     

沉默畸胎瘤衍生生长因子-1基因对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响

目的 探讨TDGF-1基因沉默对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响.方法 设计并合成3个(S1、S2、S3)靶向TDGF-1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),筛选出沉默效果最好的siRNA.以该siRNA的不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)转染PANC1细胞,并设对照组和脂质体组.采用实时定量PCR和Western blotting检测TDGF-1 mRNA和蛋白表达,以软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力,并将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察癌细胞的体内侵袭.结果 siRNA转染组细胞的TDGF-1 mRNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性下降,且较脂质体组明显降低(P值均＜0.01).对照组细胞集落形成数和穿膜细胞数分别为19.8±2.2和49.8±2.6;siRNA组呈浓度依赖性明显减少,12.5 nmol/L转染组分别为5.6±1.2和8.1±1.1.对照组、脂质体组和12.5 nmol/L转染组接种4周后裸鼠种植瘤体积分别为(2.228±0.026)cm3、(2.186±0.028)cm3和(0.728±0.023)cm3.对照组和脂质体组种植瘤侵犯周围肌层组织,转染细胞组未见侵犯.结论 采用RNA干扰技术沉默PANC 1细胞的TDGF-1基因表达可抑制癌细胞的侵袭力.     

ZNF278 siRNA抑制胃癌细胞株AGS增殖的实验研究

背景：ZNF278属C2H2型锌指蛋白,为参与生长发育的重要转录因子,其异常表达可能参与肿瘤发生。目的：研究ZNF278siRNA对胃癌细胞株AGS增殖和周期的影响。方法：以蛋白质印迹法检测正常胃上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株AGS中ZNF278表达。构建ZNF278siRNA片段,并转染胃癌AGS细胞,转染阴性对照siRNA和RPMll640分别作为阴性对照组和空白对照组。以定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测ZNF278mRNA和蛋白表达,利用MTT和细胞计数法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期变化。结果：胃癌AGS细胞中ZNF278表达明显高于正常胃上皮细胞GES-1。ZNF278siRNA转染胃癌ACTS细胞后,ZNF278mRNA和蛋白表达均明显下调,而阴性对照组与空白对照组无明显差异。MTT法示ZNF278siRNA组AGS细胞增殖率显著低于阴性对照组（0．64±0．03对0．81±0．03,P〈0．01）,细胞计数法示细胞数量亦显著降低[（4．11±0．35）×10^5对（5．78±0．50）×10^5,P〈0．01],流式细胞术显示ZNF278siRNA组G0／G1期细胞明显增加而s期细胞明显减少（P〈0．05）。结论：转染ZNF278siRNA可抑制胃癌AGS细胞增殖,细胞周期阻滞于G0／G1期。     

cripto-1基因siRNA对乳腺癌细胞侵袭力的影响

目的观察cripto-1基因小于扰RNA（siRNA）对乳腺癌细胞侵袭力的影响。方法将人乳腺癌MDA—MIM68细胞分为4组,A组不处理,B组转染空载脂质体,C组转染错配siRNA,D组转染分别转染含3．125、6．25、12．5nmol／Lcfipto-1基因siRNA的脂质体。分别于处理24．48、72h收集各组细胞。采用实时定量RT—PCR法和Western blot法检测MDA—MB468的cripto-1 mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测MDA—MB468的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果与A、B、C组比较,D组MDA—MB468的cripto-1 mRNA、cripto-1蛋白、集落形成数量、穿膜细胞数均呈浓度依赖性减少（P均〈0．005）。结论cripto-1基因siRNA可抑制乳腺癌细胞侵袭。     

幽门螺杆菌对人胃癌细胞株AGS侵袭力的影响

背景：幽门螺杆菌（H．pylori）为人类胃癌的Ⅰ类致癌原,但其在胃癌演进中的作用仍未完全阐明。目的：体外观察Hpylori对人胃癌细胞株AGS侵袭力的影响。方法：将AGS细胞与H．pylori标准菌株NCTC11637共培养72h．光学显微镜观察12—72h时细胞形态变化,扫描电镜观察24h时细胞形态变化。侵袭小室实验检测共培养24h后AGS细胞的侵袭力。结果：AGS细胞与H．pylori共培养12h后,细胞渐出现变形,伪足增多、伸长．24h和48h时细胞间相互离散,伸出细长伪足,呈“蜂鸟”表型,60h和72h时细胞出现空泡样变,死亡逐渐增多;扫描电镜下可见Hpylori黏附于AGS细胞表面,细胞变形明显,伸出细长伪足。侵袭小室实验显示与H．pylori共培养24h的AGS细胞,每200倍视野下穿膜细胞数显著高于PBS对照组（130．4±11．5对87．1±9．3．P〈0．01）。结论：Mpylori感染可影响人胃癌细胞株AGS的细胞形态,增加细胞侵袭力。     

靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的: 构建靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用.方法: 设计合成靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与pSUPER载体连接, 构建VEGF siRNA表达载体, 经酶切鉴定和测序确认后, 脂质体2000介导VEGF siRNA转染HepG2细胞. RT-PCR及Western blot检测VEGFsiRNA表达载体转染的HepG2细胞中VEGF基因表达.结果: 通过双酶切鉴定和测序分析, 成功构建了靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体. RT-PCR和Western blot法检测转染VEGFsiRNA表达载体的HepG2细胞VEGF mRNA及VEGF165表达下调, 其抑制率分别为65%和74%. 实验组中的HepG2中VEGF mRNA表达较阴性对照组、空载体组表达量显著下降(0.304±0.062 vs 0.896±0.061, 0.884±0.074,P<0.05).结论: 成功构建了靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体, 且该载体在体外能有效抑制HepG2细胞VEGF基因表达.     

siRNA沉默Bmi-1基因对人肝癌细胞株MHCC97-H侵袭迁移能力的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默Bmi-1基因表达后,对人肝癌细胞株MHCC97-H侵袭迁移能力的影响.方法:设计并合成针对Bmi-1基因序列特异性的双链小干扰RNA(Bmi-1-siRNA),转染高转移性人肝癌细胞株MHCC97-H,用流式细胞仪观察转染效率,荧光实时定量PCR和Westernblot检测Bmi-1基因的mRNA和蛋白表达水平;通过体外Transwell小室基质侵袭和迁移实验,观察Bmi-1表达沉默后对人肝癌细胞株MHCC97-H侵袭和迁移能力的影响.结果:将针对Bmi-1基因序列特异性的小干扰RNA(Bmi-1-siRNA)转染高转移性人肝癌细胞株MHCC97-H后,流式细胞仪显示,转染效率可达到91%.与空白组、对照siRNA组相比,实验组Bmi-1-siRNA能有效抑制MHCC97-H细胞中Bmi-1基因的mRNA(F=56.199,P<0.05)和蛋白表达水平.通过Transwell小室基质侵袭和迁移实验,我们分析了不同组细胞的侵袭迁移能力.结果发现,与空白组、对照siRNA组相比,Bmi-1-siRNA转染的MHCC97-H细胞穿透能力明显降低(F=186.66,12.746,P<0....     

siRNA干扰MDM2基因对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的将靶向MDM2的siRNA转染人肝癌HepG2细胞,观察转染后细胞内p21基因的表达变化及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法将人工合成的针对MDM2基因的siRNA片段通过LipofectamineTM 2000转染人肝癌细胞HepG2。实验分为MDM2 siRNA转染组、阴性对照组、脂质体组、正常对照组。分别用RT-PCR和Western blot法检测各组细胞中MDM2、p21的mRNA和蛋白质的表达量,并用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化。结果与其他3组比较,siRNA转染组细胞中MDM2 mRNA及蛋白表达减少（P〈0.01）,而p21 mRNA及蛋白表达增高（P〈0.01）。HepG2转染MDM2 siRNA后,增殖能力减弱,凋亡显著。结论 MDM2基因可能通过影响p21控制肝癌细胞的生长。     

RNA介导survivin基因沉默对肝癌细胞HepG2细胞株凋亡及增殖的影响

目的观察靶向封闭survivin基因对肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响,探讨survivin基因在肝癌的发生、发展中的作用。方法设计1对survivin-siRNA,体外转录制备siRNA。应用脂质体转染技术将survivin-siRNA转染肝癌细胞株HepG2,应用有荧光标记的非特异性小分子siRNA检测转染效率;RT-PCR检测survivin-mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测survivin蛋白表达情况;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪分析细胞凋亡。结果转染survivin-siRNA可使HepG2细胞survivin-mRNA水平下降53.8%,并可使survivin蛋白表达明显减少;转染survivin-siRNA对细胞增殖及细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。结论抑制survivin表达对肝癌细胞株HePG2凋亡及增殖无明显影响。提示survivin在肝癌细胞增殖与调亡调控中所起的作用可能并非是关键性的。     

调控Pokemon-p14ARF-p53通路对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

背景:研究发现转录抑制因子Pokemon是一种关键性致癌因子,在多种人类恶性肿瘤中表达异常上调,在体内、外实验中均能促进细胞的肿瘤性转化。Pokemon对抑癌基因ARF具有特异性转录抑制作用。目的:应用RNA干扰技术抑制人结肠癌细胞株HT-29的Pokemon表达,观察其表达抑制对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法:根据Pokemon cDNA序列设计干扰序列,构建重组干扰质粒,经脂质体介导转染入HT-29细胞。以real time RT-PCR和蛋白质印迹法检测Pokemon、p14ARF、p53表达,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果:Pokemon siRNA能有效抑制HT-29细胞中的Pokemon mRNA和蛋白表达,mRNA相对表达量为0.29±0.04,同时p14ARF、p53 mRNA和蛋白表达明显上调,mRNA相对表达量分别为3.03±0.49和2.80±0.25。与转染无效序列siRNA的HT-29细胞相比,Pokemon表达抑制的HT-29细胞G0/G1期细胞比例增加(43.6%±2.3%对34.7%±1.9%,P<0.05),细胞凋亡增多(10.7%±1.9%对2.7%±0.4%,P<0.05)。结论:人结肠癌细胞中的Pokemon表达与p14ARF、p53表达之间存在负相关关系,抑制Pokemon可通过上调p14ARF-p53信号通路阻滞肿瘤细胞的细胞周期进程,并诱导细胞凋亡。调控Pokemon-p14ARF-p53信号通路有望作为结肠癌的治疗靶点。     

siRNA沉默p28GANK对结肠癌细胞增殖的影响

背景：研究发现p28GANK表达与结肠癌恶性程度相关,其高表达提示预后不良。然而,p28GANK在结肠癌中的作用尚未完全明确。目的：探讨沉默p28GANK对结肠癌细胞增殖能力的影响。方法：以针对p28GANK基因的慢病毒携带siRNA转染人结肠癌HT29细胞,以蛋白质印迹法检测干扰效果,以MTr法检测细胞增殖,以平板克隆实验检测细胞克隆能力,以流式细胞术检测细胞周期变化。结果：与HT29、Con—HT29细胞相比,Si—HT29细胞中p28GANK蛋白表达水平显著降低;细胞增殖速度显著减缓;细胞克隆数量显著减少;G0／G1期细胞比例显著增多,S期细胞比例显著减少,PI值显著降低（P〈0．05）。结论：沉默p28GANK在结肠癌细胞中的表达可抑制细胞增殖能力,使细胞周期阻滞。p28GANK可作为治疗结肠癌的新靶点。     

siRNA沉默APE1／Ref-1基因增强人胰腺癌细胞株对吉西他滨的敏感性

背景：人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶／氧化还原因子-1（APE1／Ref-1）基因与肿瘤的化放疗抵抗和预后密切相关．是肿瘤基因治疗的理想靶点。目的：以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株APE1／Ref-1基因,观察该方法对细胞增殖和凋亡的影响及其能否增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。方法：将靶向APE1／Ref-1基因的小干扰RNA（siRNA）转染人胰腺癌细胞株SW1990,半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测APEl／Ref-1基因和蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪和Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况。结果：转染APE1siRNA后．SW1990细胞APE1／Ref-1mRNA和蛋白表达显著减低,蛋白表达抑制率为55．4％±3．6％;24h、48h和72h时细胞增殖抑制率分别为41．7％±2．8％、24．8％±3．7％和21．3％±9．8％：吉西他滨组、si-APE1组和联合组均可见明显细胞凋亡．联合组早期凋亡率显著高于两者单用和空白对照组（19．8％±3．5％对7．7％±1．1％、8．4％±1．0％和2．7％±1．4％．P〈0．05）,凋亡核形态学变化最为明显。结论：沉默APE1／ReG1基因能抑制SW1990细胞增殖,促进细胞凋亡,显著提高细胞对吉西他滨的敏感性。RNAi沉默APE1／Ref-1基因联合吉西他滨化疗可能成为胰腺癌治疗的新的选择。     

hnRNPA1在人胃癌细胞株BGC-823中的生物学功能

核不均一核糖核蛋白A1（hnRNPAl）是体内重要的RNA结合蛋白,通过调节pre-mRNA和mRNA参与转录和转录后调控过程,与肿瘤发生、发展密切相关。目前对hnRNPAl与胃癌的关系尚不十分清楚。目的：探讨hnRNPAl在人胃癌细胞中的生物学功能,明确其与胃癌的关系。方法：以蛋白质印迹法检测正常人胃黏膜上皮细胞株GES一1和人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823中的hnRNPAl表达。构建靶向hnRNPAl基因的siRNA重组质粒并稳定转染BGC一823细胞,以稳转空质粒pU6的细胞株作为对照,蛋白质印迹法验证干扰效果。分别以CCK一8实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验和流式细胞术分析各组BGC-823细胞的增殖、迁移、侵袭能力和细胞凋亡情况。结果：hnRNPA1在3株人胃癌细胞株中均呈高表达,BGC-823细胞表达水平最高。与pU6稳转组相比,siRNAhnRNPAl稳转组BGC．823细胞增殖抑制率为36．3％,细胞迁移[（5．44±0．25）斗In／h对（9．37±0．49）μm／h,P〈0．01]和侵袭（穿膜细胞数146．30±12．56对312．51±9．62,P〈0．01）受抑,细胞凋亡率降低（3．6％±0．3％对12．7％±0．2％,P〈0．01）。结论：hnRNPAl在人胃癌细胞中呈高表达,其可能通过促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭,在胃癌侵袭和转移过程中发挥作用。     

脱氧胆酸在人结肠癌细胞株HCT116迁移和侵袭中的作用及其机制研究

背景:脱氧胆酸(DCA)是参与肠肝循环的一种次级胆汁酸。近年研究发现DCA可促进结肠癌细胞增殖,然而其在结肠癌细胞迁移和侵袭中的作用尚未明确。目的:探讨DCA在人结肠癌细胞株HCT116迁移和侵袭中的作用及其机制。方法:以DCA刺激HCT116细胞较长时间(1~28 d),以DMSO处理的细胞作为阴性对照。采用CCK-8实验检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移力,Transwell实验检测细胞侵袭力,蛋白质印迹法检测上皮型钙黏蛋白(E-cad)、神经型钙黏蛋白(N-cad)和维生素D受体(VDR)表达。结果:经12.5μmol/L DCA作用的HCT116细胞,增殖、迁移和侵袭力均较DMSO组显著增强(P0.05)。DCA组E-cad和N-cad表达水平随DCA作用时间的延长而升高,第28 d时明显高于DMSO组;DCA组VDR表达水平在第1 d时较DMSO组有所上升,其后呈下降趋势,第28 d时较DMSO组明显降低。结论:较长时间(7 d)的DCA刺激可促进结肠癌细胞迁移和侵袭,其机制可能与上调N-cad表达和下调VDR表达有关。     

二甲双胍对人胃癌细胞株MKN45增殖和迁徙的影响

背景:近年发现二甲双胍具有潜在抑制肿瘤的作用,但其在消化系肿瘤尤其是胃癌中的研究较少。目的:研究二甲双胍对人胃癌细胞株MKN45增殖和迁徙的影响,并初步探讨其可能机制。方法:体外培养人胃癌细胞株MKN45.予10mmol/L二甲双胍进行干预(联合或不联合5-氟尿嘧啶),以MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡、线粒体膜电位,细胞划痕实验检测迁徙速率,RT-PCR检测AMPKα1、cyclin D1、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9mRNA表达。结果:与对照组相比,二甲双胍作用后,MKN45细胞存活率显著降低,并呈浓度-时间依赖性,细胞凋亡率显著增加,线粒体膜电位显著下降,平均迁徙速率显著降低,cyclin D1、MMP-2、MMP-9mRNA表达均显著减少,Bcl-2、BaxmRNA表达显著增加但两者之比降低,AMPKα1 mRNA表达无明显差异。二甲双胍与5-氟尿嘧啶联用对MKN45细胞的存活率无明显协同作用。结论:二甲双胍能抑制人胃癌细胞株MKN45增殖、迁徙,可通过改变线粒体膜通透性促进细胞凋亡。     

核抗原Mina53在人胃癌细胞中的作用及其意义探讨

背景:核抗原Mina53基因为原癌基因Myc的下游直接靶基因之一,在一些消化系统恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤增殖、侵袭、转移或患者生存期相关。目的:研究Mina53在人胃癌细胞中的作用及其对胃癌发生、发展的意义。方法:选择Mina53表达水平较高的人胃癌细胞株SGC7901和AGS,应用RNA干扰技术下调其Mina53表达,以转染无关序列siRNA的细胞作为对照组。采用CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,细胞侵袭和迁移实验检测细胞侵袭、迁移能力。结果:与相应对照组相比,Mina53 siRNA转染组SGC7901、AGS细胞增殖受抑(96 h相对增殖率:60%和68%),并发生明显细胞周期G1期阻滞(SGC7901细胞G1/G2:2.76±0.12对1.86±0.06,P<0.05;AGS细胞G1/G2:1.78±0.13对1.34±0.05,P<0.05),细胞凋亡率分别增加9.8%±1.2%和10.6%±1.5%(P<0.05),穿透Transwell小室基质胶细胞数(SGC7901细胞:11.67±0.88对24.33±1.45,P<0.05;AGS细胞:8.00±1.15对20.33±1.73,P<0.05)和穿透Transwell小室微孔膜细胞数(SGC7901细胞:7.00±1.53对14.67±2.03,P<0.05;AGS细胞:8.00±1.16对15.33±1.45,P<0.05)均显著减少。结论:Mina53对人胃癌细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡以及侵袭、迁移能力具有调控作用,可能影响胃癌的生长、浸润和转移,有望作为胃癌基因治疗的靶点。     

siRNA干扰galectin-3表达对人胃癌细胞株SGC-7901增殖、凋亡和化疗敏感性的影响

Galectin-3属于半乳凝素家族成员,参与细胞生长和凋亡、细胞黏附、新生血管形成、肿瘤浸润和转移等多种生理和病理过程,在多种恶性肿瘤细胞中呈高表达。目的:研究siRNA干扰galectin-3表达对人胃癌细胞株SGC-7901增殖、凋亡和化疗敏感性的影响。方法:合成靶向galectin-3的siRNA并转染SGC-7901细胞,以real time PCR和蛋白质印迹法检测干扰效果。CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:Galectin-3siRNA转染24 h后转染效率为83.8%,转染后SGC-7901细胞的galectin-3表达显著受抑,mRNA和蛋白表达量分别较空白对照组降低87.8%和90.4%(P0.01)。转染后24 h、48 h和72 h,galectin-3 siRNA组SGC-7901细胞增殖抑制率分别为15.57%±1.45%、32.90%±0.76%和57.35%±1.05%,转染后72 h该组细胞凋亡率为46.17%±2.39%,均显著高于同时间点空白对照组、空脂质体组和阴性对照siRNA组(P0.01)。Galectin-3 siRNA组SGC-7901细胞由化疗药物奥沙利铂诱导的增殖抑制亦较其余三组显著增加(P0.01)。结论:以siRNA干扰galectin-3表达后,SGC-7901细胞增殖减少、凋亡增加,对化疗药物的敏感性增强,表明galectin-3有望成为胃癌基因治疗的有效靶点。