汉滩病毒S片段基因cDNA3‘端非编码区对核蛋白在…

为了探讨汉滩病毒Ｓ片段ｃＤＮＡ３‘端非编码区基因对核蛋白表达的影响，先后构建了两个核蛋白的表达质粒，其中ｐＢＶＳ２２不含非编码区基因，ｐＢＶＳＸ含有３’端非编码区基因，比较两者在大肠杆菌中表达核蛋白的水平后发现３‘端非码区对核蛋白的表达有明显的负调控作用，表达量下降近５０％，可能的原因是非编码区中含有非常丰富的ＡＴ碱基。该研究结果为进一步提高汉滩病毒核蛋白的表达量积累了经验，也为高效表达其它病毒结     

汉滩病毒囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端在昆虫细胞中的融合表达

目的：在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的表达载体pFBDHTa—G2S0．7，并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统，将嵌台基因重组至杆状病毒穿梭质粒hacmid中，并筛选含有G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，在昆虫细胞中表达该融合蛋白。对表达产物用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹进行检测。结果：构建了的含G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，感染昆虫细胞后，可表达相应大小的融合蛋白。该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别。结论：利用杆状病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

汉滩病毒M、S基因部分片段在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌中融合表达含主要抗原位点的汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP片段。方法将汉滩病毒76118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5′端约0.7kb的片段连接,克隆入pGEX4T2,构建嵌合基因原核表达载体pGEX4T2G1S0.7,并在大肠杆菌XL1Blue中,诱导GSTG1S0.7融合蛋白的表达。表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定。结果成功地构建了嵌合原核表达载体pGEX4T2G1S0.7。经IPTG诱导后,ELISA活性测定结果表明,该融合蛋白可与抗汉滩病毒NP及糖蛋白的mAb特异性结合。Westernblot结果显示,诱导出相对分子质量Mr大于1×105的G1S0.7与GST的融合蛋白。结论获得具有特异性结合活性的融合蛋白GSTG1S0.7,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

汉滩病毒部分核蛋白基因原核表达产物 的免疫及其保护作用

目的 探讨汉滩病毒（HTNV）部分核蛋白（NP）基因（37－294bp)原核表达产物NP AA1－86多肽的免疫原性及其免疫保护作用。方法 大肠杆菌表达的HTNV部分核蛋白多肽NP AA1－86混合福氏佐剂,腹腔注射免疫BALB／c小鼠,IFA检测抗体应答;^3H-TdR掺入及4h ^51Cr释放试验检测免疫小鼠脾细胞对HTNV的特异淋巴细胞增殖转化指数及细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤功能;免疫小鼠脾细胞转输感染HTNV A9株的乳鼠,观察对乳鼠致死性的免疫保护作用。结果 免疫后1周小鼠即出现抗体应答反应,抗体滴度最高达1：12800,与重组完整NP免疫组差异无显著性（P＞0．05）;免疫小鼠的淋巴细胞增殖转化指数、CTL杀伤率较对照组明显增高（P＜0．01）,与完整NP免疫组差异无显著性（P＞0．05）,CTL杀伤率随效：靶比例的增高呈逐渐上升趋势;免疫小鼠脾细胞转输可部分保护病毒致死性感染的乳鼠,保护率约25％。结论 大肠杆菌表达的汉滩病毒部分核蛋白多肽NP AA1－86不仅包含NP几乎所有的体液免疫表位,同时含有部分细胞免疫表位,对汉滩病毒感染可产生部分免疫保护作用。     

汉滩病毒S基因真核表达载体的构建及免疫小鼠的初？…

目的 研究汉滩病毒Ｓ片段编码区基因免疫小鼠的作用。方法 利用基因重组技术，构建含汉滩病毒Ｓ片段编码区基因的真核表达质粒。用此质粒直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌内进行ＤＮＡ免疫，用间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清中汉滩病毒抗体。结果 在初次免疫的小鼠血清中检测出有低滴度的汉滩病毒抗体。加强免疫后，抗体水平显著上升，免疫荧光抗体（ＩＦＡＴ）滴度最高达１：６４０。约８７％的免疫动物发生了血清抗体阳转。抗     

汉滩病毒S基因真核表达载体的构建及免疫小鼠的初步研究

目的研究汉滩病毒Ｓ片段编码区基因免疫小鼠的作用。方法利用基因重组技术,构建含汉滩病毒Ｓ片段编码区基因的真核表达质粒。用此质粒直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌内进行ＤＮＡ免疫,用间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清中汉滩病毒抗体。结果在初次免疫的小鼠血清中检测出有低滴度的汉滩病毒抗体。加强免疫后,抗体水平显著上升,免疫荧光抗体（ＩＦＡＴ）滴度最高达１６４０。约８７％的免疫动物发生了血清抗体阳转。抗体水平及小鼠血清抗体阳转率与注射的质粒ＤＮＡ剂量及注射次数有关。结论应用基因免疫技术能够诱导机体产生针对汉滩病毒的特异性免疫应答     

汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7,然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连,电转化E.coli JM109,获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA,转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒,滴度可达10^13～10^15 PFU／L;该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后,表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗（mAb）所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

汉滩病毒76-118株核蛋白部分基因片段的克隆、表达和抗原活性测定

为了研究汉坦病毒的DNA疫苗,用PCR方法克隆汉滩病毒76-118株S片段部分基因,构建真核细胞表达质粒pEGFP-HTNV-S0.7,并在成纤维细胞L929中进行瞬时表达。成功地得到预期大小约0.7kb的重组基因,并在成纤维细胞中进行了瞬时表达。免疫印迹分析产生的相对分子质量约26000的蛋白质具有抗汉坦病毒的抗原活性。直接免疫荧光分析显示了特异性的绿色荧光。     

中国人丙型肝炎病毒基因组3′端非编码区的研究

目的分析中国丙型肝炎病人ＨＣＶ基因组３′端非编码区（３′ＮＣＲ）,以促进对ＨＣＶ基因组复制机制的研究。方法采用两种方法,从上海地区感染ＨＣＶ的病人血清中,扩增获得ＨＣＶ基因组３′端非编码区：一是用套式ＰＣＲ直接扩增,二是先分别获得ＨＣＶ３′ＮＣＲ的前半部分和后半部分,再将两片段进行融合ＰＣＲ。ＰＣＲ产物进行测序后作同源性分析。在此基础上,建立了针对３′端非编码区的ＲＴＰＣＲ方法,并与基于５′端非编码区的ＲＴＰＣＲ方法检测ＨＣＶＲＮＡ的特异性和灵敏度比较。结果序列分析表明,中国丙型肝炎病人ＨＣＶ基因组３′非编码区由４部分组成：高度变异区、Ｐｏｌｙ（Ｕ）区、Ｐｏｌｙ（Ｕ／Ｃ）区和９８碱基区。同源性分析显示,９８碱基区在不同分离株间高度保守并与国外报道株一致,而Ｐｏｌｙ（ＵＵＣ）区存在较大差异。３′端非编码区和５′非编码区ＲＴＰＣＲ检测血清ＨＣＶＲＮＡ有较高符合率（９５％）。结论ＨＣＶ基因组３′端非编码区的３′末端（９８碱基）,在不同分离株间的高度保守性提示,该区在ＨＣＶ基因复制中起重要作用。基于３′非编码区的ＲＴＰＣＲ方法,将有助于ＨＣＶ感染的诊断。     

狂犬病毒糖蛋白及核蛋白在非复制型痘苗病毒天坛 …

目的 提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。方法 利用ＴＫ区表达狂犬病毒糖蛋白（ＲＧ）的重组痘苗病毒作为亲本株，通过两步同源重组，删除痘苗病毒基因组ＣＫ片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段，同时将狂犬病毒核蛋白（ＲＮ）基因插入Ｃ－Ｋ片段之间，获得了含有ＲＧ基因和ＲＮ基因的非复制型重组痘苗病毒ＶＴＫＲＧ△ＣＫＬａｃＺＲＮ。结果 经ＰＣＲ鉴定，ＲＮ基因已插入ＣＫ区；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示     

新疆出血热病毒核蛋白基因的高效表达及其在诊断中的初步应用

目的　克隆并测定了克里米亚 刚果出血热病毒 (CCHFV)中国分离株 (新疆出血热病毒 ,XHFV)BA8816 6株核蛋白 (NP)基因的序列并实现其在细菌中的高效表达与临床诊断的应用。方法　病毒RNA经RT PCR扩增出完整的NP基因。将扩增产物进行序列分析并克隆至融合表达载体pET32a ,使重组质粒在大肠杆菌BL 2 1中高效表达。将融合蛋白经初步纯化后包被ELISA板用于抗体检测。结果　XHFVBA8816 6株NP基因序列以及推导的氨基酸序列与其它XHFV的NP基因和蛋白序列同源性较高 ,在进化树上形成独立的分支。BA8816 6株NP基因编码 4 82个氨基酸的核蛋白 ,推测的相对分子质量 (Mr)约为 5 4× 10 3。在细菌中表达的融合蛋白经印迹试验证明具有良好的抗原性。以所建立的ELISA方法检测疫区人和动物血清的结果与IFA一致 ,并与临床诊断有很好的符合率。结论　BA8816 6株与其它XHFVBA6 6 0 19、BA84 0 2的NP基因在进化上关系密切 ,综合M基因的序列分析结果 ,人源分离株BA8816 6可能是来自蜱的BA84 0 2变异株。表达于细菌中的核蛋白可作为安全的诊断性抗原用于临床检测及流行病学调查 ,所建立的方法准确、特异、简便、快速     

狂犬病毒糖蛋白及核蛋白在非复制型痘苗病毒天坛株中的共同表达

目的　提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。方法　利用TK区表达狂犬病毒糖蛋白 (RG)的重组痘苗病毒作为亲本株 ,通过两步同源重组 ,删除痘苗病毒基因组CK片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段 ,同时将狂犬病毒核蛋白 (RN)基因插入C K片段之间 ,获得了含有RG基因和RN基因的非复制型重组痘苗病毒VTKRGΔCKLacZRN。结果　经PCR鉴定 ,RN基因已插入CK区 ;Westernblot结果显示 ,该株病毒能同时表达RG和RN ,相对分子质量 (Mr)分别为 6 5× 10 3 和 5 0 5× 10 3。VTKRGΔCKLacZRN在人源细胞如TK 143细胞中不能正常繁殖 ,在鸡胚成纤维细胞 (CEF)中能正常复制。与非复制型重组病毒VTKRGΔCK相比 ,VTKRGΔCKLacZRN免疫小鼠后能更快地诱生较高滴度的中和抗体 ,效果相当于复制型重组病毒VTKRG免疫组 ;它们均能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒国际标准攻击毒株 (CVS)的攻击。结论　VTKRGΔCKLacZRN具有良好的免疫效果和安全性     

中国人丙型肝炎病毒基因组3‘端非编码区的研究

目的 分析中国丙型肝炎病人ＨＣＶ基因组３‘端非编码区,以促进对ＨＣＶ基因组复制机制的研究。方法 采用两种方法,从上海地区感染ＨＣＶ的病人血清中,扩增获得ＨＣＶ基因组３’端非编码区：一是用套式ＰＣＲ直接的增,二是先分别ＨＣＶ３‘ＮＣＲ的前半部分和后半部分,再将两片段进行融合ＰＣＲ。ＰＣＲ产物进行测序后作同源性分析。     

MAGE-3基因编码的肿瘤排斥抗原在食管癌的表达

由于人类ＭＡＧＥ(ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ)基因编码的肿瘤排斥抗原(ｔｕｍｏｒｒｅｊｅｃｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ)可为ＣＴＬ(ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ)识别,且在许多肿瘤有较高的表达,而在正常组织(除了睾丸和胎盘外)均不表达,因而是一种ＣＴＬ介导的特异性免疫治疗的理想靶分子。在机体抗肿瘤免疫应答中,特异性ＣＴＬ的杀伤作用是主要的抗肿瘤机制,因而这一领域的研究,引起了国内外学者的极大重视。利用ＭＡＧＥ基因产物为靶分子的特异性免疫治疗在临床上已取得了一些令人鼓舞的成功〔1〕。目前,国内尚未见对Ｍ…     

以新型杆状病毒载体在昆虫、哺乳动物细胞中表达克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白基因

目的 构建可以在哺乳动物细胞中高效表达的新型杆状病毒载体，并利用其将克里米亚—刚果出血热病毒(CCHFY)中国分离株(新疆出血热病毒，xHFY)BA88166的核蛋白(NP)基因在昆虫和哺乳动物细胞中进行表达。方法 将人巨细胞病毒(CMv)立即早期(IE)启动子连接至杆状病毒载体PFastBacl多角体启动子下游形成新载体PCB1，然后将xHFY NP基因克隆至该载体，通过重组质粒转染和病毒感染，检测其在哺乳动物细胞(COS—7和vero)及昆虫细胞中的表达。结果 连接至PCB1的xHFV NP基因均能在相应的细胞中获得良好表达；以重组杆状病毒感染的vero细胞可以作为抗原检测xHF血清，与ELISA的检测结果完全一致，并与临床诊断有很好的平行性。结论 新型杆状病毒载体能够驱动外源基因在昆虫和哺乳动物细胞中高效表达，不仅能方便快速地制备诊断抗原，还具有发展重组病毒疫苗和基因治疗的潜力。     

影响人α-突触核蛋白基因在原核细胞中表达因素的研究

目的　研究影响人α 突触核蛋白 (α synuclein)基因在原核细胞中表达的常见因素 ,以提高其在原核细胞中的表达量。　方法　将重组质粒ProEXNACP转化进入到DH5α 大肠杆菌体内 ,观察诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导培养基、诱导初始菌浓度及诱导中pH值变化等因素对蛋白表达产量的影响 ,用SDS PAGE梯度胶电泳分析 ,考马斯亮蓝染色进行比较研究 ,同时检测pH值 ,观察其变化。　结果　诱导剂IPTG浓度对诱导蛋白产生的影响不大 ,诱导过程中pH值变化较小 ,而诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类对诱导产生α 突触核蛋白有较大影响。其中 ,以LB培养基 ,37℃ ,180r min诱导 1～ 2h产生α 突触核蛋白的量最大。　结论　诱导剂IPTG诱导ProEXNACP/DH5α大肠杆菌产生α 突触核蛋白的量与诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类有明显的关系。初始菌A590 =0 5～ 0 8,LB培养基 ,37℃ ,大通氧量 (180r min以上 ) ,1～ 2h诱导可作为大量提取、纯化α 突触核蛋白的首选条件。     

TNF-α单抗Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的进行ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ段基因的克隆并在大肠杆菌中表达。方法用逆转录－聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆重链Ｆｄ段和κ链基因；并用ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析证明表达的Ｆａｂ段特异结合ＴＮＦ－α。结果从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆出了重链Ｆｄ段和κ基因。经ＤＮＡ序列测定表明，ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ３Ｄ、ＤＳＰ２和ＪＨ４；Ｖκ和Ｊκ分别属于Ｖκ１和Ｊκ１。将该Ｆｄ和κ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ中，在大肠杆菌中获得了表达。结论ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析表明，表达的Ｆａｂ段可特异地和ＴＮＦ－α结合。     

长链非编码RNA MEG3对肿瘤细胞调控作用的研究进展

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200 nt的不编码蛋白的RNA分子。lncRNA最初被认为是转录噪音,在近年的研究中发现越来越多功能性的lncRNA,其重要性才渐渐被阐述。母系表达基因3(materally expressed gene 3,MEG3)是一种由母系印记基因编码的lncRNA,在对其功能的研究中发现MEG3几乎参与了所有的生理和病理过程,其在多种肿瘤中表现出抑制作用。本文就lnc RNA MEG3对肿瘤细胞调控的作用机制作一综述。