生米卡链霉菌与北里链霉菌种间原生质体融合重组的研究

生米卡链霉菌和北里链霉菌用42％PEG4000做助融剂进行多配对原生质体种间融合,融合率为10~(-2)。同时,进行了UV灭活亲株的种间融合,融合率也为10~(-2)。采用液体培养基再生,表观融合率达10~(-1)。随机挑选形态各异的一定数量的融合子作产物分析,发现它们产生柱晶白霉素,总效价比直接亲本高5.9倍,比间接亲本高27％。高效液相色谱测定表明A_5组份从9.1％提高到43.4％。     

生米卡链霉菌原生质体电融合重组研究

采用电融合新技术可提高生米卡链霉菌原生质体融合频率,并且在原生质体稳定液中加入2.5mol/L的MgCl_2,比使用PEG助融方法的融合频率高10倍。经过UV灭活高产菌株和另一脯氨酸缺陷型菌株的原生质体的电融合,其融合子的抗生素产量变异幅度大,发酵产物的各组份比例改变,经过选择获得了一新的高产菌株,麦迪霉素产量提高77％,其有效组份A_1比例增加。     

产黄青霉菌球状菌株原生质体的分离再生和融合

产黄青霉菌球状菌株原生质体的融合是用两株不同遗传标记的菌株作亲本,用玻璃纸平板培养菌丝体,在高渗透性稳定剂中用纤维素酶裂解菌丝细胞壁,制备高浓度(10~6～10~7/ml)原生质体悬浮液。 将原生质体悬浮液接种到高渗性再生培养基上,再生频率可达40％左右。作渗透处理后,测得菌丝断片含量在0.01～0.1％之间。 两菌株的原生质体以1∶1相混合,用分子量6000,30％聚乙二醇处理后,发生了原生质体间的凝聚。将混合物涂布在高渗性合成培养基上,产生了异核体菌落,频率为0.40％左右。将少量异核体分生孢子分离在菌丝生长培养基上后,产生了数量相仿的两亲本型分离子。将大量异核体产生的分生孢子接种到合成培养基上后,能得到少数原养型杂合二倍体,频率为0.035％左右,杂合二倍体纯化后,再以紫外线诱发,获得了以角变和斑点形式出现的二亲本型分离子。     

中国抗生素杂志——第16卷1～6期(1991年)目录检索

进同与评述 生米卡链霉菌质粒DNA的分离及特性 余柏松等绿脓杆菌对卜内酞胺类抗生素耐药机理的研究进(4)。237～240 展 汪 冰等(4):30?～311 生米卡链霉菌**A对北里链霉菌原生质体种间转新的广谱豚酚青霉素类抗生素的研究 周 红等 化 孙 胜等(1):20～24 (l)。73—77 生米卡链霉菌麦迪霉素抗性基因的克隆 姜 浩等螺旋霉素的再评价 朱 峰等(3),沈】～236(6):396～402一种新的生物反应修饰物多抗甲素 胡其乐等 生米卡链霉菌原生质体电融合重组研究 余柏松等 (2):151～156(5):323～327大孔网状吸附剂在抗生素分离纯化中的应用 顾 利福霉素产生…     

生米卡链霉菌DNA对北里链霉菌原生质体种间转化

采用SDS-苯酚法提取生米卡链霉菌DNA,同时以SDS处理生米卡链霉菌原生质体得到游离DNA。将提取DNA及游离DNA转化北里链霉菌原生质体,得到10~(-2)的转化率。转化子经发酵得柱晶白霉素,其产量比亲本高5.2倍,同时发现组份亦有所变化,A_5组份从9.1％提高到36.7％。     

小诺霉素产生菌棘孢小单孢菌突变菌株原生质体形成、再生及融合的研究

甘氨酸（Ｇｌｙ）的加入将会影响棘孢小单孢突变型菌株孢子发芽和菌丝生长，其影响程度与甘氨酸浓度及菌丝培养基成份有关，在Ⅱ号培养基中，０．３％Ｇｌｙ对菌丝形态的改变十分明显，而０．５％Ｇｌｙ能抑制孢子发芽。消色肽酶（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｉｔｉｄａｓｅ）与溶菌酶（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）联合作用比单一溶菌酶制备的原生质体形成率和再生率有明显提高。再生培养基以原分离培养基补充０．２ｍｏｌ／Ｌ蔗糖为宜，其再生频率可达到１５％。采用ＰＥＧ４０００，４２％（ｗ／ｖ）为助融剂，直接法检出融合重组体，其重组频率可达０．５％～１．０％，重组体中大部分苗株的次级代谢特性与亲株有较大差异，在再生菌落筛选中获得一些优良菌株，其小诺霉素产率较原亲株有显著提高。     

顶头孢霉菌原生质体融合研究

顶头孢霉菌营养缺陷型菌株的原生质体是采用1％东风纤维素酶或0.1％Zymolyase5000消化生长48小时经0.005 M二硫苏糖醇(DTT)预处理的菌丝获得的。影响营养缺陷型菌株原生质体分离和再生的因素有不同来源的商品酶、不同批号的东风纤维素酶、菌丝生理状态、裂解温度、渗透压稳定剂浓度、再生培养基成份和培养条件等。含0.01 M CaCl_2的聚乙二醇(分子量6000),pH 8溶液作融合剂,融合率较高。营养互补的原生质体融合形成平衡异核     

链霉菌原生质体融合:原生质体经紫外线照射后的融合

几种链霉菌的原生质体在聚乙二醇存在下可以融合,并产生高比例的染色体基因的重组子。这一发现对这些重要的抗生素产生菌的经典和应用遗传学有很大的影响。在许多链霉菌中,在融合后在再生培养基上产生的孢子总数中,重组子的比例或含有重组子的单个再生菌落的比例是很高的——在最适条件下至少达20％——这对分析融合杂交或分离特定需要的重组基因型十分适用且不需要每个亲株有任何     

基因组重排选育麦迪霉素高产菌株

目的以生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)突变株为研究对象,选育麦迪霉素高产菌株。探索并验证基因组重排技术在菌种选育中的重要作用。方法通过2轮多亲株灭活原生质体融合技术实现基因组重排。将来自不同育种方法的5株麦迪霉素高产菌株B64-5、01-GM-1、H-101、H-106和H-108作为第一轮亲本,在质量浓度为3 g.L-1溶菌酶3、2℃水浴60 min条件下制备原生质体,分别采用紫外线照射148 s和52℃加热60 min灭活原生质体,然后采用质量分数35%PEG 4000、37℃保温2 min诱导原生质体融合。融合子经过初筛和复筛,获得产量进一步提高的重组子作为亲本进行第二轮的多亲株灭活原生质体融合实验。用生物学方法测定麦迪霉素效价,用HPLC方法测定麦迪霉素A1含量。结果与结论经过2轮基因组重排实验成功选育出3株高产且遗传稳定的麦迪霉素生产菌株。其中1株菌株GSZ2-32发酵前补加前体X-1后摇瓶产量比原始出发菌株Streptomyces mycarofaciens var.464提高1.1倍,麦迪霉素A1(MDMA1)质量分数含量保持在80%以上。     

生米卡链霉菌启动子的克隆和表达

用高拷贝启动子探针质粒pIJ486为载体,变青链霉菌(S.lividans)TK24为受体,克隆并表达了生米卡链霉菌(S.mycarofaciens)的启动子,得到了对新霉素抗性不同的5个转化子。其中对新霉素有高抗性的转化子中重组质粒pIJM2的插入片段约为2kb,将 pIJM2转化生米卡链霉菌SM90919原生质体,得到新的转化子SM9pM201和SM9pM205,从SM9pM205菌株中分离到的质粒要比pIJ486和pIJM2小,约3.5kb。     

林可链霉菌与委内瑞拉链霉菌种间原生质体融合的研究

本文报道氯霉素产生菌委内瑞拉链霉菌A-186株与林可霉素产生菌林可链霉菌林可变种78-11株种间原生质体融合的结果。首先,研究了委内瑞拉链霉菌A-186的原生质体制备和再生条件,再生率可达86％。然后,采用氯霉素产生菌S.venezuelae A-186的原生质体用紫外线灭活后,与具有耐药标记的S.lincolnensis var.lincolnensis78-11原生质体融合的方法,种间融合频率达到3.2×10~(-5) 。并筛选到一株遗传稳定的重组子,经初步鉴定它能同时产生两亲株所产的两种抗生素。     

提高原生质体融合后的龟裂链霉菌的土霉素产量

本报告概述了龟裂链霉菌高频率原生质体融合的某些最适条件和融合产物的OTC生产。菌株与培养基OTC产生菌——龟裂链霉菌QBS3的营养缺陷型变株是用N-甲基-N’-亚硝基胍或紫外线处理后获得的。完全培养基(CM)含;1%胰酶解胨、0.5%酵母膏、0.5%葡萄糖。最低限度培养基(MM)系采用Waksman所述,并由Bauman等加以改进的培养基。在最低限度和完全再生培养基内,均使用0.3M蔗糖。原生质体的制备、融合与再生采用Okanishi等的方法并稍作改进。融合频率     

对渗透压不稳定的链霉菌用常规脱水再生平板会使原生质体再生频率大幅度下降

影响链霉菌原生质体再生频率有三大要素,即菌丝生长期,菌丝和原生质体再生培养温度、再生平板的脱水率和培养基成份。60-1与74-4为在南朝鲜土壤中分离得到的二株抗生素产生菌,用经典的岡西昌则和汤普逊的各种方法不能使其原生质体再生?匝榈?0-1株菌丝培养基应为TSB(Difco)加甘氨酸0.7%,28℃培养45小时;74-4株亦     

东方诺卡氏菌原生质体的再生

现在不同微生物原生质体已成功地应用于菌株的重组,其成功与否很大程度上决定于原生质体再生的频率.作者以万古霉素产生菌——东方诺卡氏菌(Nocadia orientals)ATCC19795的原生质体为对象研究血清白蛋白对再生的作用,结果表明,再生频率决定于原生质体接种条件及培养基去水的程     

红霉素链霉菌原生质体的形成和再生及其对紫外光的敏感性

红霉素链霉菌的菌丝生长在含有0.8％甘氨酸的S培养基中,对溶菌酶的作用敏感,通过酶解,并利用一个包含10mM-MgCl_2和25mM-CaCl_2的高渗培养基能使其菌丝脱壁形成10~(10)/ml的原生质体。 原生质体能再生细胞壁,回复成为一个完整的细胞。最佳条件时再生频率达90％左右。 利用紫外光对红霉素链霉菌的孢子及原生质体分别照射3分钟,其致死率分别为97.95％和98.81％。     

通过原生质体再生手段改进大环内酯类抗生素产生菌

三株大环内酯类抗生素产生菌:产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)产生螺旋霉素(Spiramycin),弗氏链霉菌(Strep-tomyces fradiae)产生泰乐菌素(tylosin),卷须链霉菌(Streptomyces cirratur)产生缠霉素。这三株菌株当用溶菌酶处理时,在高渗培养基中很容易形成原生质体。若在再生培养基中添补原生质扩张剂,则三种原生质体再生形成菌丝体的频率可达90～100%。     

绛红色小单孢庆大霉素生物合成障碍突变型的细胞融合

本文报道用Co~(60) 处理绎红色小单孢得到一株产生小诺霉素和庆大霉素组份为C_(1a)的突变型274和产生C_1为主的突变型46的原生质体融合。两亲本分别以NTG处理得到抗氨苄青霉素(AP)突变型和抗氯霉素(CM)突变型在含氨苄青霉素加氯霉素的合成培养基上可以得到具有AP和CM双重抗性的融合子,融合频率在10~(-2) ～10~(-3)之间。从融合子中得到一株产生小诺霉素比亲本提高的菌株。     

红霉素链霉菌重组子获得及其性状的初步研究

红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 两株不同营养缺陷型突变体(P_1~(cys~-)和M_1~(his~1))配对重组。重组频率为1.1×10~(-6)。重组子的生长速度,气生菌丝形态以及菌落形态等性状介于两亲本之间,除此之外,重组子对诱变剂(u v)很敏感,在蛋白胨完全培养基上形成红棕色色素,这两点是不同于亲本的新性状。重组子摇瓶效价接近于高单位亲本7—56水平,但只经两次诱变剂处理之后,获得DES-P_1M_1菌株,其摇瓶效价比高单位亲本7—56高25％左右。     

原生质体再生法选育耐自身代谢产物的卡那霉素链霉菌高产菌株

以卡那链霉菌株KA01为出发菌株,酶法制备原生质体,在含有高浓度的卡那霉素的培养基再生或经UV诱变处理后再生,从再生菌落中分离突变菌株。从中获得一高产突变株KA02,其摇瓶相对效价比出发株提高18%,大罐生产水平提高8%。     

通过灰色链霉菌原生质体再生提高卡那霉素抗性的机制——Ⅰ.指导高水平氨基糖苷3-N-乙酰转移酶活性基因片段的克隆

由于链霉基因技术的发展,使我们能够克隆和分析结构以及抗生素生物合成基因与抗性基因的调节,相继发现了一些簇集在一起的抗生素生物合成基因和抗性基因。并且证实了一些基因的启动区和二种形式的RNA聚合酶全酶。在分别丧失生产链霉素(SM)和Istamycin(IS)能量的灰色链霉菌和S.tenjimariensis两个突变株之间进行的种间原生质体融合而产生抗生素抗性的研究过程中,Yama Shita等发现灰色链霉菌原生质体再生的结果出现了显著增强卡那链霉(KM)抗性的克隆。没有经过原生质体再生的灰色链霉菌对5μg/mlKM敏感,抗性克隆后可在500～1000μg/ml KM的情况下生长。尽管人们知道链霉菌原生质体再生可引起各种各样的表