ISA720与CpG联合佐剂增强恶性疟原虫抗原的免疫原性

目的评价CpG佐剂对以PfCP-2．9f/ISA720佐剂为基础的联合疟疾抗原的免疫原性。方法使用ISA720及ISA720＋CpG佐剂与恶性疟原虫抗原制备制剂,免疫BALB／c小鼠,考察不同佐剂增强免疫的效果。通过检测免疫血清中特异性IgG的水平、识别天然抗原的能力、分析特异性IgG的亚类分布等指标进行评价。结果CpG佐剂显著提升了联合疟疾抗原在BALB／c小鼠中产生特异性抗体的量（P〈0．01）,免疫血清能有效识别红内期疟原虫天然抗原,IFA滴度显著提高（P〈0．01）,IgG亚类分析显示该佐剂能有效刺激小鼠产生针对PfCP-2．9和Pfclet-3的多种IgG亚类抗体。结论CpG显著提高了联合疟疾抗原的免疫原性。     

日本血吸虫HGPRT重组抗原与不同佐剂联合应用对小鼠免疫保护作用的研究

目的:观察日本血吸虫(大陆株)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase, HGPRT)重组抗原(reSjc HGPRT)与ISA206或弗氏佐剂联合免疫对小鼠诱导抗日本血吸虫感染的保护作用. 方法:雌性C57BL/6小鼠随机分为5组:reSjc HGPRT加ISA206佐剂免疫组、reSjc HGPRT加弗氏佐剂组、ISA206佐剂对照组、弗氏佐剂对照组和感染对照组.20 μg重组抗原和ISA206或弗氏佐剂乳化后小鼠项背部多点皮下注射,共免疫3次,每次间隔2周.佐剂对照组小鼠仅注射ISA206或弗氏佐剂和生理盐水,感染对照组不注射任何重组抗原或生理盐水.于末次免疫后3周,每只小鼠经腹部皮肤感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴,6周后剖杀小鼠,门脉灌注收集成虫,计数成虫数、雌雄合抱数和小鼠肝组织虫卵数.在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前分别采血并分离血清,用ELISA检测血清中特异性IgG抗体. 结果:重组抗原加ISA206佐剂或弗氏佐剂免疫组均诱导小鼠产生特异性IgG抗体应答,与感染对照组和弗氏佐剂对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);诱导小鼠产生的减虫率、减雌雄合抱率和肝组织减卵率分别为53.7%、59.3%、44.9%和43.3%、44.1%、33.0%,与感染对照组和2种佐剂对照组相比均有统计学意义(P<0.05).结论:reSjc HGPRT与ISA206或弗氏佐剂联合免疫,可诱导小鼠产生抗血吸虫感染保护作用.     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠中的免疫特性

目的:探讨恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠(BALB/ca、C57BL/6J、C3H/He、DBA/2J及昆明种)中的免疫原性和免疫反应特性.方法:以ISA720为佐剂,PfCP-2.9抗原皮下免疫5种品系小鼠3次,间隔3周.以ELISA检测免疫血清中特异性抗体的动态变化、IgG抗体亚型及对融合抗原各组分的抗体水平,以间接荧光抗体实验分析免疫血清对恶性疟原虫天然抗原的识别情况.结果:5种品系小鼠均能产生针对PfCP-2.9的免疫应答,3次免疫后血清中特异性抗体滴度达105以上.PfCP-2.9所诱生的免疫血清不但能识别MSP1-19和AMA-1(Ⅲ)两个主要片段,而且能识别恶性疟原虫天然抗原.所诱导的4种IgG抗体亚型中,IgG1和IgG2a是免疫血清中主要的抗体类型.但特异性抗体水平及抗体亚型分布因遗传背景不同而异.结论:融合蛋白PfCP-2.9在5种不同品系小鼠中具有强的免疫原性,其抗体能识别疟原虫天然蛋白.     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3功能区片段的制备及其免疫原性分析

目的构建恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3功能片段MSP3(69)与谷胱甘肽(GST)的融合蛋白,并在大肠杆菌中进行表达,分析其免疫原性。方法采用大肠杆菌系统表达融合蛋白GST-MSP3(69),以疟疾病人血清进行Western-blot,并以ISA720、佛氏、氢氧化铝与CpG联合3种佐剂与GST-MSP3(69)融合蛋白乳化,免疫Balb/ca小鼠,分析其免疫原性。结果在大肠杆菌系统中成功表达GST-MSP3(69)融合蛋白,疟疾病人血清能与融合蛋白反应。3种佐剂免疫Balb/ca小鼠均能诱发Balb/ca小鼠产生较高水平的特异抗体,3次免疫后的抗体滴度分别为4.5×105,4.1×105和3.5×105。3次免疫后血清抗体亚型分析显示该蛋白能够诱导Balb/ca小鼠产生较高滴度的亲细胞亚型IgG1和IgG2b,ISA720、佛氏、氢氧化铝与CpG联合佐剂组IgG1分别为8×104、7.8×104、6.8×104,IgG2b分别为1.2×104,1.25×104、1.5×104。统计学分析显示不同佐剂组的抗体滴度及抗体亚型滴度之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论制备了在大肠杆菌表达的GST-MSP3(69)融合蛋白,该蛋白具有高免疫原性,并产生亲细胞亚型抗体,这些为研究MSP3蛋白功能区的免疫保护作用打下了基础。     

Identification of excreted and metabolic antigens from adult worms of Schistosoma japonicum

目的 制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,对其免疫原性以及免疫反应性进行初步鉴定.方法 日本血吸虫尾蚴感染家兔,42 d后剖杀获取成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5% CO2孵箱37℃培养4 h,得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA法检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western blot分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗发生反应的蛋白条带.结果 成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1:16 000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1:800、1:400、1:800和1:100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白条带,分子量分别是13、40、60和180 ku左右;Western blot结果 表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5 ku左右处识别.结论 制备的日本血吸虫成虫分泌代谢抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性.     

日本血吸虫尾蚴抗原模拟表位的筛选及其免疫保护性

目的 筛选日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，探讨其对日本血吸虫的免疫保护性。方法 用粗提日本血吸虫尾蚴抗原的抗体IgC作配体筛选噬菌体12肽库，按“吸附－洗脱－扩增”的过程进行三轮筛选；随机挑取单个噬菌体克隆进行Dot-ELISA检测；用混和噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染45d后剖杀冲虫，计算虫数及肝卵数。结果 经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，挑取11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定，均与日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清呈特异性反应。与对照组相比，混和噬体克隆免疫小鼠的减虫率为18.79%，减卵率为38.00%。结论 利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，这些表位能诱导对日本血吸虫的保护性免疫。     

日本血吸虫成虫分泌抗原的鉴定

目的制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,对其免疫原性以及免疫反应性进行初步鉴定。方法日本血吸虫尾蚴感染家兔,42 d后剖杀获取成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5%CO2孵箱37℃培养4 h,得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA法检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western blot分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗发生反应的蛋白条带。结果成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1∶16 000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1∶800、1∶400、1∶800和1∶100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白条带,分子量分别是13、40、60和180 ku左右;Westernblot结果表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5ku左右处识别。结论制备的日本血吸虫成虫分泌代谢抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

日本血吸虫紫外线致弱尾蚴免疫小鼠攻击感染后的组织细胞反应

目的 观察日本血吸虫紫外线致弱尾蚴疫苗(UVC)免疫动物攻击感染后的局部组织免疫病理变化.方法 将70只C57BL/6小鼠随机分为疫苗免疫组和感染对照组.疫苗组小鼠接种紫外线致弱日本血吸虫尾蚴后5周,再经腹部皮肤攻击感染正常日本血吸虫尾蚴(800±50)条;感染对照组经皮肤感染同量尾蚴.于攻击感染后6～120 h的不同时间点各剖杀小鼠5只,取攻击部位皮肤及/或肺组织,进行病理学观察.结果 UVC疫苗免疫小鼠攻击感染日本血吸虫尾蚴后,皮肤炎症反应较感染对照出现早、反应强烈、持续时间长,EOS百分比高,但肺部出血斑点出现时间(72 h)迟于感染对照组(48 h).72～120 h,疫苗组小鼠肺部局灶性炎症明显,肉芽肿样结节形成,肺泡壁多正常.而感染对照组小鼠肺组织炎症轻,但肺泡壁水肿明显,且有较多红细胞渗出.结论 紫外线致弱尾蚴疫苗免疫增强了小鼠皮肤及肺组织的细胞反应及其杀虫作用.     

紫外线照射日本血吸虫尾蚴疫苗保护性抗原的筛选

目的：分析经紫外线照射处理后日本血吸虫尾蚴蛋白的差异性表达，并从中筛选出有效的保护性抗原组分。方法：收集尾蚴，制备抗原，进行SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，与照射尾蚴免疫血清和正常感染血清分别进行免疫印渍(Western blot)试验，比较两反应条带的差异性，筛选出惟有免疫血清所能识别的特有的抗原组分，并测定其分子量。结果：在童虫抗原中发现一条能被免疫血清所识别的特异性抗原条带，并测得其分子量为75kDa。结论：紫外线照射致弱尾蚴可诱导宿主产生特异性抗体，被该抗体所识别的抗原分子量为75kDa。     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

LZ-8基因克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

【目的】从灵芝中克隆LZ-8基因并在毕赤酵母表达系统中诱导表达LZ-8蛋白。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)法从赤灵芝的基因组DNA中扩增LZ-8基因序列,采用电激转化法将pPLZ8-X重组质粒转化到毕赤酵母中,PCR Southernblot法检测酵母是否转化LZ-8基因,十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并银染法观察蛋白在酵母中的差异表达。【结果】PCR Southern blot结果显示LZ-8基因已转化到酵母中;SDS-PAGE胶银染结果提示LZ-8蛋白在酵母中被诱导表达。【结论】免疫调节蛋白基因LZ-8在毕赤酵母表达系统获得了诱导表达。     

恶性疟原虫3D7株主要裂殖子表面抗原C—末端基因的全合成及其表达

目的：在毕赤酵母表达系统中获得大量构象正确的3D7／MSP1－42重组蛋白进行疫苗有效性试验。方法：采用不对称PCR法拼接合成了3D7／mps1-42基因（1202bp),用电穿孔法将合成基因导入毕赤酵母并进行诱导表达,用免疫印迹法检测表达产物。结果：按毕赤酵母密码子使用频率重新设计并全合成了3D7/msp1-42基因序列,该合成基因在毕赤酵母系统（Pichia pastoris)中得到高水平分泌表达,产生全长重组蛋白。识别构象表位的特异性单克隆抗体能与该重组蛋白反应。结论：重新设计的基因能在毕赤酵母中高水平分泌表达,并产生构象正确的重组蛋白,从而解决了该天然基因在毕赤酵母中不表达的问题。     

人重组白细胞介素11在毕氏酵母系统中的表达及纯化

目的在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达人白细胞介素-11(rhIL-11),便于进一步开发。方法以人工设计合成的rhIL-11基因,构建表达载体pPICZαA-IL-11,经线性化后电转化导入毕氏酵母菌株KM71,甲醇诱导表达,用ELISA和SDS-PAGE检测发酵上清中IL-11的抗原性和表达量,用IL-11依赖的B9-11细胞株分析其生物学活性,采用疏水层析、离子交换和凝胶过滤纯化发酵上清中的IL-11。结果序列分析表明,克隆载体中IL-11人工基因序列与设计相符;基因工程菌株KM71-2424在摇瓶培养上清中IL-11的表达量超过60mg/L,生物学活性测定显示其比活性为5.5×10     

重组人内皮抑素在酵母中的表达及对人肺腺癌Astc－a－1细胞生长的抑制

OBJECTIVE: To achieve expression of recombinant human endostatin (rhES) in a highly efficient foreign gene expression system, the yeast strain Pichia pastoris, and to evaluate the inhibitory effect of rhES on the growth of nude mouse pulmonary adenocarcinoma cells. METHODS AND RESULTS: The rhES gene was efficiently expressed in the yeast strain, and heparin affinity chromatography yielded highly purified endostatin identified by Western blotting, which proved to significantly inhibit the growth of the ECV-304 cells in vitro and also the growth of the lung adenocarcinoma Astc-a-1 in nude mice. CONCLUSIONS: The rhES gene can be expressed in Pichia pastoris, and has the ability to restrain the growth of ECV-304 cells and lung adenocarcinoma Astc-a-1 in nude mice, showing important potentials for future clinical applications.     

肿瘤相关抗原17-1A在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的利用Pichia pastoris酵母表达系统表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A,为进一步设计肿瘤蛋白疫苗提供研究基础。方法通过RT-PCR从小鼠肾组织中扩增17-1A的cDNA,将其定向克隆到pPICZαA质粒上,获得重组质粒pPICZαA-17-1A,测序正确后,重组质粒电转化到Pichia pastoris酵母菌株GS115中,在甲醇诱导下,利用其AOX I基因的α信号肽,分泌表达17-1A抗原糖蛋白,并对获得的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果构建了pPICZαA-17-1A重组质粒,通过电转化将目的基因整合人酵母基因组中,重组毕赤酵母表达能够表达17-1A抗原并检测到抗原发生了糖基化。结论能够通过毕赤酵母表达系统稳定表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A。     

人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中的表达与纯化

目的利用毕赤酵母高效表达人组织因子途径抑制因子（TFPI）。方法利用基因定点突变技术对人TFPIcDNA特定序列进行定点突变（同义突变）。将获得的突变体及野生型cDNA分别插入表达载体pPic9中,转化酵母宿主菌GS115和KM71,用0.5%的甲醇诱导重组蛋白表达。细胞培养上清经超滤浓缩后,依次用DEAE-sepharose Fast Flow、Heparin-sepharose CL6B及Sephadex G-75柱层析分离纯化得到重组蛋白,分别采用凝胶扫描成像定量分析和底物显色法测定重组蛋白的表达量和活性。结果凝胶扫描成像定量分析显示,同义突变体的表达量（1mg/L）显著高于天然型（0.1mg/L）。活性测定表明GS115重组菌在诱导表达12h后即可于培养上清中检测到TFPI活性,36h达峰值;而KM71重组菌诱导表达24h后才开始于培养上清中检测到TFPI活性,72h达峰值。两个菌株中突变体mTFPI-pPic9转化子的表达量均显著高于TFPI-pPic9转化子。重组蛋白相对分子质量约为42000。结论对TFPI-cDNA特定序列进行同义突变后能显著提高重组蛋白在毕赤酵母细胞中的表达,且显著高于在酿酒酵母和昆虫细胞的表达;重组蛋白具有良好的生物活性。因此,利用毕赤酵母表达TFPI是一种较好的选择。     

恶性疟原虫红前期多表位融合抗原基因的构建及其高效表达

目的:构建一个恶性疟原虫红前期多表位融合抗原基因(PfCP-TCL),并在毕氏酵母中进行高效分泌表达.方法:选取了疟原虫红外期疫苗候选抗原CSP、TRAP和LSA-1中的一些重要T、B细胞表位,按一定的次序加以串联连接,并全合成该融合基因.在毕氏酵母中进行分泌表达,并纯化表达产物.结果:合成的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达,产量达1 g/L以上.经离子交换和凝胶过滤2步纯化过程,获得纯度在95%以上的重组蛋白.结论:全合成的多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达,并产生一种工艺简易的纯化方法.大量获得该重组蛋白为探讨其免疫学功能及作为多价联合疫苗的成分提供了基础.     

恶性疟疾多价疫苗的构建及表达

目的 构建恶性疟原虫多表位融合抗原基因(PfCP2E9),并在毕氏酵母中进行高效分泌表达.方法 选取本实验室前期构建的融合蛋白PfCP-2.9与疟原虫红内期疫苗候选抗原EBA175IIF2,按一定的次序拼接成该融合基因,并克隆至酵母表达载体,用电转化方法将拼接基因导入毕氏酵母中进行分泌表达.结果 拼接的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达.结论 构建的恶性疟原虫多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达,为探讨其免疫学功能及作为多价联合疫苗的成分提供了基础.     

结核分枝杆菌Ag85A在毕赤酵母中的表达、纯化及酶联免疫斑点试验研究

目的利用毕赤酵母表达和纯化结核分枝杆菌AgS5A蛋白,以期得到高效刺激T淋巴记忆细胞产生1．干扰素的特异性抗原。方法用PCR扩增得到Ag85a基因,构建出重组质粒pPic9k085a,通过电转化进入毕赤酵母,经遗传霉素G418抗性筛选、硫酸铵沉淀浓缩及离子交换层析纯化得到目的蛋白。最后以大肠杆菌和毕赤酵母表达的A邸5A分别为抗原刺激物进行酶联免疫斑点（Elispot）试验,分析其刺激BCG免疫小鼠T淋巴细胞产生Υ-干扰素（IFN-Υ）的能力。结果在毕赤酵母中成功克隆并稳定表达了Ag85A蛋白,Elispot检测结果表明,毕赤酵母比大肠杆菌产生的Ag85A蛋白,对小鼠T淋巴细胞的刺激效果更加明显（P〈0．05）,能产生更多的免疫斑点。结论毕赤酵母表达的Ag85A蛋白可以更高效的刺激T淋巴细胞,可用于检测结核杆菌感染诱导的细胞免疫应答。